胰高血糖素缺乏降低成年小鼠的肝葡萄糖生成并改善葡萄糖耐受性

阿尔克斯-缺陷小鼠的α细胞减少，β、δ和PP-cells显著增加

评估胰高血糖素产生的α细胞分化是否受到干扰Arx公司-缺乏小鼠，我们对其切片中胰高血糖素的表达进行免疫组化分析阿尔克斯-在3-6个月大时缺乏并控制动物。与中报告的内容类似阿尔克斯无动物(28)，我们观察到阿尔克斯-胰腺缺乏，而胃和肠中胰高血糖素表达细胞的数量没有受到影响（图2​2,、A和B以及补充图1A，发表在内分泌学会期刊在线网站上，网址为http://mend.endojournals.org)（未显示数据）。此外，胰岛内表达生长抑素的δ细胞和表达胰岛素的β细胞的数量增加阿尔克斯-缺乏动物（图2​2,，C–F）。形态计量分析证实，胰腺中胰高血糖素、胰岛素和生长抑素产生细胞的数量分别减少99%，增加1.5倍和2倍（图2​2,、B、D和F）。有趣的是，我们还观察到在我们的阿尔克斯-缺陷小鼠（补充图1、B和C），这与之前在阿尔克斯无效动物，其中报告了正常数量的PP细胞(28).

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图2

阿尔克斯-缺陷小鼠缺乏胰高血糖素生成细胞。A、 C和E，3至6个月大的对照组和Arx公司-胰腺缺陷。形态计量学分析表明，α细胞质量（B）减少99%，β细胞质量（D）增加1.5倍，δ细胞质量（F）增加2倍阿尔克斯-缺乏动物。数值为平均值±扫描电镜每组三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。

阿尔克斯-有缺陷的小鼠健康，空腹血糖水平较低

据报道Arx公司空白小鼠围产期死亡(28,31)这种致命性归因于内分泌功能异常，可能导致低血糖(28). 令人惊讶的是，尽管α细胞完全丧失阿尔克斯-缺陷小鼠以预期的孟德尔比率出生，在所有受检年龄段（最长14个月）都无法与对照组同窝小鼠区分开来。两组之间的体重没有差异（数据未显示）。由于胰高血糖素被认为是维持空腹血糖稳态的关键因素，我们测量了年轻（6周）和老年（3-6个月）的血糖水平阿尔克斯-0、16和24小时禁食后出现缺陷的小鼠。虽然我们没有发现阿尔克斯-这两个年龄组在禁食0或16小时后出现缺陷和控制动物（图3​三，，A和B），24小时禁食后血糖水平的差异确实达到显著水平（图3​三，、A和B）。这些结果表明，无论动物的年龄如何，在长时间禁食期间，胰高血糖素都是维持正常血糖水平所必需的。

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图3

阿尔克斯-缺陷小鼠无明显异常，随着年龄的增长，糖耐量增加。A、 6周龄雄性小鼠禁食0、16或24小时后的血糖水平。数值为平均值±扫描电镜每组至少三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。B、 3至6个月龄雄性小鼠在0、16或24小时禁食后的血糖水平。数值为平均值±扫描电镜每组至少三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。C和D，6周龄（C）和3-6个月龄（D）雄性对照的GTT试验，以及阿尔克斯-缺陷小鼠。数值为平均值±扫描电镜每组至少三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。E、 禁食16小时后，3至6个月大雄性小鼠的血浆胰高血糖素和胰岛素水平。数值为平均值±扫描电镜每组四只小鼠。*，P（P）<0.05和基因型之间；**，P（P）基因型间<0.01。血浆胰高血糖素水平低于检测阈值（20 pg/ml）阿尔克斯-缺乏营养的动物。F、 3-6个月龄男性对照组和阿尔克斯-GTT期间对缺乏的动物进行了测量（参见插入). 数值为平均值±扫描电镜每组至少三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。

阿尔克斯-缺乏的小鼠表现出改进的葡萄糖耐量试验（GTT），但没有检测到血浆胰高血糖素

为了确定胰高血糖素在维持餐后血糖稳态方面是否也至关重要，我们对6周龄和3-6个月龄的动物进行了GTT。虽然我们没有观察到阿尔克斯-6周龄的缺陷小鼠和对照小鼠（图3C​3C），)，我们发现3-6个月大的婴儿糖耐量显著提高阿尔克斯-缺陷小鼠（图3D​3D）。). 为了确定糖耐量的提高是否与胰高血糖素的丢失有关阿尔克斯-缺乏的小鼠，我们在禁食16小时后用放射免疫法测定了3至6个月大的小鼠的血浆胰高血糖素水平，并在小鼠的外周血中未发现可检测到的胰高血糖激素阿尔克斯-缺乏动物（图3E​3E）。). 有趣的是，尽管我们确实观察到在阿尔克斯-胰腺缺陷（图2​2,（C和D），我们没有发现Arx公司-禁食16小时后出现缺陷的小鼠（图3E​3E）。). 为了确定是否有更多的胰岛素分泌在阿尔克斯-在葡萄糖刺激缺乏小鼠后，我们测量了3至6个月大的小鼠GTT前30分钟的血浆胰岛素水平，发现GTT后3至6月大的鼠的胰岛素分泌没有显著增加阿尔克斯-缺乏动物（图3F​3F）。). 事实上，我们注意到胰岛素分泌减少的趋势Arx公司-缺陷小鼠。这些数据表明，缺乏胰高血糖素有助于提高成人的葡萄糖耐量阿尔克斯-缺陷小鼠。

阿尔克斯-缺陷小鼠HGP降低

胰高血糖素通过促进糖原分解和糖异生帮助维持血糖水平，从而增加HGP。评估阿尔克斯-我们对2个月大的小鼠进行了高胰岛素/正常血糖钳夹研究，血糖水平保持在60-70mg/dl（对照组为64.1±2.6mg/dl；突变组为64.9±2.1mg/dl）。虽然葡萄糖处理率（Rd）没有差异，但葡萄糖输注率（GIR）在阿尔克斯-缺乏的动物，表明需要更多的葡萄糖来保持血糖水平稳定。只有当HGP较低时才会发生这种情况，这在我们的阿尔克斯-缺陷小鼠（图4A​4A）。). 这些数据表明，胰高血糖素缺乏导致阿尔克斯-缺陷小鼠。

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图4

阿尔克斯-缺陷小鼠的肝脏脂肪和糖原增加。A、 在钳夹期间测量来自2个月大的雄性对照的GIR、HGP和Rd阿尔克斯-缺陷小鼠。数值为平均值±扫描电镜每组5只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。B、 3至6个月大的男性对照和阿尔克斯-用H&E或（D）周期性酸-雪夫（PAS）染色的石蜡包埋不足的肝脏切片（放大×40）。安图像的放大部分在中提供箱.C，在禁食16小时后，测量3至6个月大的小鼠肝脏中的糖原水平。数值为平均值±扫描电镜每组三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。E、 实时PCR分析测量了3~6个月大男性禁食16小时后糖异生相关基因的相对mRNA水平。Tat，酪氨酸氨基转移酶。数值为平均值±扫描电镜每组四只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。F、 使用3-6个月龄男性对照组和阿尔克斯-检测PEPCK（63 kDa）、P-CREB（43 kDa。G、 根据Western blot分析定量，PEPCK和P-CREB的平均强度归一化为微管蛋白。

阿尔克斯-缺陷小鼠肝脏中糖原的数量增加

接下来，为了确定阿尔克斯-我们比较了3至6个月龄对照组和阿尔克斯-缺陷小鼠。虽然对照组和对照组之间的肝脏没有明显的形态学差异阿尔克斯-缺乏动物（图4B​4B），)，糖原颗粒明显更大，在阿尔克斯-缺陷小鼠，表明缺乏胰高血糖素会导致肝内糖原积聚（图4B​4B）。). 周期性酸-雪夫（PAS）染色标记了肝脏中的糖原颗粒，进一步证实了肝脏中糖原的增加阿尔克斯-肝脏缺陷（图4D​4D）。). 此外，肝糖原含量阿尔克斯-缺陷小鼠也显著增加（图4C​4C）。). 这些数据表明，在缺乏胰高血糖素生成的情况下，肝内的糖原合成增强或肝糖原分解受到抑制阿尔克斯-缺乏小鼠，导致糖原颗粒过多。

禁食组主要糖异生基因的mRNA水平下调阿尔克斯-缺陷小鼠

研究肝糖异生是否在阿尔克斯-接下来，我们通过定量PCR分析检测了这一过程中相关基因的表达。我们发现磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK公司)（减少70%）酪氨酸氨基转移酶（减少76%），以及葡萄糖6磷酸酶（减少60%）在阿尔克斯-禁食16小时后出现肝脏缺陷（图4E​4E）。). 的级别过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化子1αmRNA也减少，尽管没有统计学意义（图4E​4E）。). 此外，PEPCK蛋白水平在阿尔克斯-缺陷小鼠（图4​4,、F和G）。因此，正如预期的那样，在缺乏胰高血糖素的情况下，参与肝糖异生的基因表达受到损害。有趣的是，磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（P-CREB）的水平在阿尔克斯-肝脏缺陷，这与最近的研究结果一致，即胰高血糖素的作用是由CREB辅激活子CREB-调节转录辅激活子2（CRTC2）介导的，并且与CREB磷酸化无关(28,32,33,34). 这些结果表明，在16小时禁食期间，需要胰高血糖素来充分激活肝脏中的糖异生基因，以促进葡萄糖的产生。为了确定其他战斗或飞行激素，即儿茶酚胺在阿尔克斯-缺乏维持葡萄糖稳态的动物，我们接下来测量了肾上腺素和去甲肾上腺素，发现在Arx公司-缺陷小鼠（图5C​5摄氏度).

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图5

1岁对照组和阿尔克斯-缺陷小鼠。A、 1岁对照组的H&E和油红O染色阿尔克斯-缺陷小鼠。B、 4个月龄对照组和阿尔克斯-禁食16小时后出现缺陷的动物。C、 禁食16小时后，3-6个月龄小鼠的血浆肾上腺素和去甲肾上腺素水平。D、 STZ治疗期间和之后测量的血糖水平。第1-5天在禁食4小时后测量，第6天之后在禁食1小时后测量。数值为平均值±扫描电镜每组至少三只小鼠。*，P（P）基因型间<0.05。

阿尔克斯-缺陷小鼠肝脏脂肪含量较高

除了糖原颗粒数量增加外阿尔克斯-肝脏缺陷（图4​4,B和D），我们注意到阿尔克斯-缺陷小鼠（图5A​5A）。). 我们证实在肝组织切片中存在过多的脂滴阿尔克斯-油红O染色的缺陷小鼠（图5A​5A）。). 同时，血浆甘油三酯和酮类水平在阿尔克斯-缺陷小鼠，尽管没有统计学意义（图5B​第5页).

GTT和分析程序

隔夜禁食的动物每公斤体重ip注射2克葡萄糖（西格玛，圣路易斯，密苏里州）。在注射后0、15、30、60、90和120分钟，使用自动血糖仪（One Touch Ultra；加利福尼亚州Milpitas的LifeScan）监测血糖值。为了进行激素/脂质测量，血液收集在肝素化管中（BD Microtainer，BD，Franklin Lakes，NJ），旋转并储存在−20 C下，直到化验。采用ELISA法测定血浆胰岛素。血浆脂质水平由宾夕法尼亚大学的小鼠表型、生理学和代谢核心测定。为了测量血浆胰高血糖素，在采集血液后，将250 KIU/ml抑肽酶添加到200μl全血中，以防止胰高血糖激素蛋白降解。然后在肝素化管中旋转样品，并快速冷冻100μl血浆。抑肽酶的最终浓度为500 KIU/ml。然后通过宾夕法尼亚大学RIA/生物标记物核心使用RIA测定血浆胰高血糖素水平。根据制造商的说明，使用2-CAT（A-N）Research Elisa（BA E-5400；LDN，Nordhorn，Germany）测量肾上腺素和去甲肾上腺素水平。具体而言，EDTA（最终浓度，1 m米)和焦亚硫酸钠（最终浓度，4 m米)添加到全血中以防止降解。

组织学

组织用4%多聚甲醛固定，然后用石蜡包埋。切割载玻片（7-μm截面），然后脱蜡。主要抗体为胰高血糖素（1:3000；Millipore，Billerica，MA）、胰岛素（1:1000；Millibore）、PP（1:50；Invitrogen，Carlsbad，CA）和生长抑素（1:300；Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Crux，CA）。然后用荧光次级抗体（1:600）或生物素化次级抗体（1:200）孵育切片。根据制造商的建议，生物素化抗体与ABC精英试剂孵育，然后使用二氨基联苯胺底物试剂盒进行显色反应（Vector Laboratories，Burlingame，CA）。在颜色反应后，切片脱水并用组织印迹（Invitrogen）贴装。脱水前对切片进行H&E复染，以帮助观察组织形态。然后将幻灯片交给费城儿童医院病理学中心进行幻灯片扫描。通过将载玻片依次置于0.5%周期性酸溶液、希夫试剂、苏木精、0.5%酸性乙醇和饱和碳酸锂中，对去蜡肝切片（6μm）进行PAS染色。使用冷冻肝组织进行油红O染色。

定量PCR分析

组织在TRIzol试剂中均质。通过氯仿提取回收RNA，然后使用RNeasy迷你试剂盒（马里兰州日耳曼敦QIAGEN）纯化RNA。使用0.5μg寡核苷酸（dT）引物、上标II逆转录酶和配套试剂（Invitrogen）逆转录RNA。使用Brilliant SYBR Green PCR Master Mix（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）建立实时PCR反应。所有反应均以标准染料归一化和用于分析的中值循环阈值进行三次。可根据要求提供引物序列。

α-、β-和δ-细胞质量

取下3至6个月大的雄性对照和突变小鼠的胰腺，称重，在4℃下用4%多聚甲醛固定过夜，并将其包埋在石蜡中。使用足迹最大的切片（7μm）进行胰岛素、胰高血糖素和生长抑素免疫染色。在4倍放大下拍摄图像，并使用Aperio软件测量胰岛素、胰高血糖素和生长抑素染色阳性的胰腺组织。通过测量强阳性像素占总组织面积的比例并乘以胰腺重量来获得细胞质量。每个胰腺使用三个切片，对三个对照和突变胰腺进行分析。

高胰岛素血糖钳

在戊巴比妥钠麻醉下，将留置导管插入右颈内静脉，并延伸至右心房。禁食6小时后，进行120分钟的高胰岛素血症钳夹，以2.5 mU/kg·min的速度持续输注人胰岛素（Humulin；新泽西州普林斯顿市诺和诺德斯），以提高生理范围内的血浆胰岛素。每隔10-20分钟采集尾血样本（20μl），用于立即测量血糖浓度，并以可变速率输注20%葡萄糖，以将血糖维持在基础浓度。血糖维持在60–70 mg/dl，在手术过程中每10分钟检查一次血糖水平，以确保血糖处于稳定状态。使用含HPLC-纯化物的原剂量输注来评估胰岛素刺激的全身葡萄糖流量[3-^三H] 夹钳中的葡萄糖（10μCi团注，0.1μCi/min；PerkinElmer Life and Analytical Sciences，Boston，MA）。评估单个组织中胰岛素刺激的葡萄糖转运活性，2-脱氧-d日-[1-¹⁴C] 葡萄糖（2-[¹⁴C] DG；PerkinElmer Life and Analytical Sciences）在夹钳结束前45分钟以丸状（10μCi）给药。在夹钳开始后77、80、85、90、100、110和120分钟采集血样（20μl），以测定血浆[^三H] 葡萄糖，^三H（H）₂O、 和2-[¹⁴C] DG浓度。在夹钳开始和结束前采集额外的血样（10μl），以测量血浆胰岛素浓度。所有输血均使用可编程注射泵BS-8000（Braintree Scientific，Inc.，Braintere，MA）进行。基础葡萄糖周转率和全身葡萄糖摄取率是以[^三H] GIR（dpm）对血糖的比活性。通过从全身葡萄糖摄取量（Rd）中减去GIR来测量钳夹期间的HGP。

STZ处理

禁食4小时后，连续5天ip注射STZ（50 mg/kg体重；西格玛阿尔德里奇，圣路易斯，密苏里州）诱导糖尿病。禁食4小时后进行第1-5天的血糖测量。禁食1小时后，测定第6天起的血糖水平。

肝糖原含量

将100毫克冷冻肝脏样品在6%高氯酸中均质，然后与100μg淀粉葡萄糖苷酶（Sigma）混合2小时。使用Amplex Red试剂盒（Invitrogen）测量葡萄糖。

蛋白质印迹分析

通过反复冷冻/解冻样品，提取小肝切片中的蛋白质，然后均质剩余组织，最后进行超声处理；用10%SDS-PAGE分离20μg/条提取物，然后转移到硝化纤维素膜上。本试验使用小鼠单克隆微管蛋白抗体（Sigma）、兔多克隆P-CREB抗体（Cell Signaling，Danvers，MA）或兔多克隆PEPCK抗体（Cayman Chemical Co.，Ann Arbor，MI）。使用归一化为微管蛋白的P-CREB或PEPCK的平均强度对所得印迹进行分析。

统计分析

所有误差线代表扫描电镜，通过除以标准偏差每组的平方根t吨进行测试以测量显著性。

我们感谢Klaus Kaestner博士对手稿的仔细阅读；Swain博士、Jaclyn Twaddle和消化与肝病分子研究中心形态学核心成员（P30-DK050306）；RIA/生物标记物的Heather Collins博士和宾夕法尼亚糖尿病中心（P30-DK19525）小鼠表型、生理和代谢核心的Ravindra Dhir博士负责样品处理；Jeff Golden博士阿尔克斯鞭打小鼠；Pedro Herrera博士Pdx1-芯老鼠；以及John Le Lay博士的技术援助和讨论。