ANNOVAR：高通量测序数据中遗传变异的功能注释

下载注释数据库

为了注释变异对基因的功能影响，ANNOVAR需要从UCSC基因组浏览器下载基因注释数据集（基因/转录注释和FASTA序列）(12)并将其保存到本地磁盘。几个不同的基因注释系统，包括RefSeq基因、UCSC基因和Ensemble基因，可用于注释。如果计算机连接到Internet，则可以使用“–downdb”参数自动下载必要的文件。“wget”系统命令将用于下载，或者Net:：Ftp/LWP:：UserAgent模块（默认情况下，大多数系统中安装的标准Perl模块）也可以使用。用户可以指定不同的基因组构建，例如hg18（人类）、mm9（小鼠）或bosTau4（奶牛），只要它们可以从UCSC基因组浏览器注释数据库中获得。当通过Ensembl基因定义执行基于基因的注释时(13)，ANNOVAR将从Ensembl下载FASTA序列，因为UCSC基因组浏览器无法提供这些序列。

对于基于区域的注释，ANNOVAR需要基于用户特定的轨迹名称从各种UCSC基因组浏览器表下载注释数据库。或者，用户可以指定一个符合通用特征格式3（GFF3）的定制注释数据库，ANNOVAR可以识别与给定GFF3文件中注释的特征重叠的变体。例如，对于基于过滤器的注释，将突变与1000基因组项目或dbSNP中检测到的突变进行比较，ANNOVAR将从相应的网站下载特定的文件。ANNOVAR还可以下载所有人类非同义突变的预先计算的SIFT分数，以帮助通过基于过滤器的注释程序注释人类外显子。

扫描注释数据库

从输入文件读取变体时，ANNOVAR扫描存储在本地磁盘上的基因注释数据库，并识别内含子变体、外显子变体、基因间变体、5′/3′-UTR变体、剪接位点变体和上游/下游变体（默认情况下，距转录物小于阈值1 kb）。对于基因间变异，报告了最接近的两个基因及其距离。对于外显子变异体，ANNOVAR扫描注释的mRNA序列，以识别和报告氨基酸变化以及停止-增加或停止-减少突变。ANNOVAR还可以对许多类型的注释轨迹执行基于区域的注释，例如最保守的元素和预测的转录因子结合位点。这些注释必须由ANNOVAR下载，然后才能使用。最后，ANNOVAR可以筛选特定的变异，如1000基因组项目中频率>1%的SNP，或SIFT得分>0.05的非同义SNP。

为了自动化将大量变体减少为功能重要变体的一小部分的过程，annovar包中提供了一个脚本（auto_annovar.pl）。默认情况下，auto_annovar.pl通过多次执行annovar来执行多步骤程序，每次都使用几个不同的命令行参数，并生成包含最可能的因果变量及其相应候选基因的最终输出文件。对于隐性疾病，这个列表可以进一步缩小，以包括具有多个变异的基因，这些变异被预测为具有重要功能。

“可有可无”的基因汇编

基于这样一种假设，即在人群中具有高频率非感觉（停止-保持）突变的基因不太可能导致罕见的孟德尔病，我们利用1000基因组项目的数据编制了一份此类“可有可无”的基因列表。对于CEU、YRI和JPT+CHB人群，我们分别确定了具有非敏感突变的基因，其组合次要等位基因频率（MAF）>1%。例如，如果同一基因中的两个无义突变在CEU人群中的MAF分别为0.5和0.8%，则该基因将被视为可有可无的基因。该分析结果鉴定了1000基因组项目中的2064个基因。我们警告说，由于测序错误或比对错误，基因可能在这个列表中；例如，如果该基因有许多假基因，或者它存在于片段复制中。这个列表（约占所有注释的人类基因的10%）是有用的过滤步骤，可以进一步减少孟德尔疾病的潜在候选基因。

确定候选基因的遗传变异优先顺序

为了说明ANNOVAR在识别导致罕见孟德尔病的致病基因方面的作用，我们合成了一个包含约420万SNP和约50万indels的全基因组数据集。这些变体包括Illumina对男性受试者产生的所有变体(14)以及Miller综合征的两个已知因果突变（G152R和G202ADHODH公司基因）。米勒综合征是一种罕见的孟德尔病，最近通过对四个先证者进行外显子测序和对另外三个家族进行桑格测序解决了这一问题(三)因此，我们实验的主要目标是研究我们是否以及如何利用ANNOVAR来修剪罕见隐性疾病的潜在候选基因。此外，由于在使用PolyPhen的功能过滤器时，其中一个因果突变被预测为“良性”突变(三)，我们研究了是否可以使用替代的更快的过滤策略。我们承认，由于原始研究的完整变体数据不可用，因此我们必须依赖合成变体集来说明ANNOVAR在实际数据上的使用。

变体减少程序概述如所示图1我们首先对所有～470万个变异进行了基于基因的注释，共鉴定出24617个外显子SNV或indels。鉴于米勒综合征是一种罕见的孟德尔病，与Ng相一致等.研究(三)接下来，我们只关注了1166个外显子蛋白变化变体，并确定了4860个变体中属于高度保守基因组区域的一个子集。我们注意到Miller综合征的两个因果突变位于高度保守的区域，标准化得分分别为505和445（UCSC基因组浏览器中所有类型注释的标准化得分范围为0-1000）。PolyPhen在Ng中预测其中一个突变为“良性”等。如果Ng等。在过滤过程中使用PolyPhen预测(三)。我们证实SIFT也预测其为良性（SIFT得分=0.18）。接下来，我们从1000基因组项目和dbSNP 130版中筛选出变异，假设在公共数据库中观察到的变异不太可能是米勒综合征的因果变异。这种逻辑与两个外显排序研究中使用的逻辑相似(三，11)尽管他们没有利用1000个基因组项目数据集。这个过程给我们留下了413个变体。接下来，在减少的变异体集合中，我们评估了复合杂合子在同一基因中是否存在多个罕见变异体。有趣的是，该分析只剩下23个基因。最后，我们评估了这23个基因中的一些是否属于一组“可有可无”的基因，即1000基因组项目中具有高频无义突变的基因（>1%的受试者）。其基本原理是，这些基因不太可能导致一种非常罕见的孟德尔病，或者这些基因很容易在短阅读测序平台中出现测序和比对错误。三个基因(ZNF717型，工厂验收试验1，OR4C3型)被删除，剩下20个候选基因，包括因果基因DHODH公司上述每种方法都可以通过ANNOVAR中的不同参数执行，我们还提供了一个脚本，可以用来自动执行变量约简过程。对于约470万种变体，使用现代台式计算机只需约15分钟。

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图1。

使用合成数据集鉴定导致米勒综合征的基因。输入数据集包括由Illumina产生的受试者NA18107中的所有SNV和indels，以及已知会导致Miller综合征的两种变体。变量减少方法可以通过annovar包中的自动化脚本（auto_annovar.pl）实现。

上述分析并不一定表明我们仅通过对一个受试者进行测序就可以检测出罕见孟德尔病的因果突变，我们承认我们没有利用真正的外显子测序数据。然而，结果表明，通过ANNOVAR中的一系列步骤进行过滤可能有助于大幅减少候选基因的数量，使其成为少数可由人类管理的基因。在这方面，可以想象，通过传统的桑格测序技术，这20个候选基因可以在其他受米勒综合征影响的患者中测序，并且因果基因可能会从这些额外的测序运行中直接确定。

多个受试者的全异体变异数据分析

为了检验ANNOVAR在识别常染色体显性疾病基因方面的效用，我们接下来模拟了一项研究中的分析，该研究对来自HapMap受试者的8个外显子和来自Freeman-Sheldon综合征患者的4个外显元进行了测序(11)。八个HapMap外显子变异体的完整列表已公开，四个因果变异体在原始手稿中给出了身份。因此，我们合成了四个外显子组数据集，取四个HapMap外显子，并用Freeman-Sheldon综合征的已知因果突变对每个外显子进行补充。每个外显子数据集包含16 134到19 960个外显子变体。接下来，我们检查了变异体减少程序是否能够自信地识别致病基因(3令吉)来自四个外显子。

与原始出版物中的程序类似(11)，我们通过利用一个、两个、三个或四个受试者的变异来评估候选基因的数量。在检查一个受试者时，我们能够确定一组159个候选基因。在检测两名受试者时，候选基因的数量大幅下降至13个。当对三名受试者进行检查时，只剩下六个候选基因。当检查了四个受试者时，我们可以将候选基因列表缩减为四个(海德宁，KCNJ12号机组，COL4A6系列，3令吉)。如果我们随后使用SIFT分数(9)或PolyPhen分数(10)为了评估这四个基因的突变，我们可以进一步排除KCNJ12号机组和COL4A6系列作为致病基因。这项分析表明，当所有患者在同一基因上携带致病突变时，多个基因组的联合分析有助于确定显性孟德尔疾病的致病基因。然而，我们警告说，对于复杂疾病或存在多个致病基因的孟德尔病，用户需要在数据分析中考虑遗传异质性的可能性。

作者感谢郭怡然博士（费城儿童医院）和沈玉凤博士（哥伦比亚大学）对ANNOVAR的宝贵意见。我们感谢两位匿名审稿人对使用预先计算的SIFT分数进行注释和处理基于GFF3的注释数据库提出的建议。作者感谢宾利等和Ng等。用于公开其变体数据集以测试ANNOVAR。