鲜血。2010年8月19日；116(7): 1025–1034.
全体会议文件
全基因组DNA甲基化分析揭示了套细胞淋巴瘤药物开发的新靶点
,1中，* ,1中，* ,2 ,三 ,1 ,1 ,1 ,4 ,5 ,6 ,4 ,4 ,5 ,1 ,1 ,6 ,7 ,6 ,5 ,2和
1 维奥莱塔·莱斯琴科
1阿尔伯特·爱因斯坦癌症中心，阿尔伯特·爱因斯坦医学院，纽约布朗克斯；
裴玉国
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
大卫·T·杨
三威斯康星大学麦迪逊分校病理学与实验医学；
托比亚斯·盖伦
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
亚当·彼得里奇
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
Yiting余
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
伊冯·雷玛（Yvonne Remache）
4新泽西州哈肯萨克大学医学中心；
马克·A·维尼格
5马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所血液科；
萨维斯·拉菲克
6哥伦布俄亥俄州立大学血液肿瘤科；和
温德汉·威尔逊
5马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所血液科；
阿米特·维玛
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
艾拉·布伦瑞克
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
娜塔拉詹·穆图萨米
6哥伦布俄亥俄州立大学血液肿瘤科；和
布拉德·S·卡尔
7威斯康星大学医学与公共卫生学院医学系，麦迪逊
阿德里安·维斯特纳
5马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所血液科；
萨米尔·帕雷克
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
1纽约布朗克斯阿尔伯特爱因斯坦医学院阿尔伯特爱因斯坦癌症中心；
2纽约威尔-科内尔医学院医学系；
三威斯康星大学麦迪逊分校病理学与实验医学；
4新泽西州哈肯萨克大学医学中心；
5马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所血液科；
6哥伦布俄亥俄州立大学血液肿瘤科；和
7威斯康星大学医学与公共卫生学院医学系，麦迪逊
通讯作者。 *V.V.L.和P.-Y.K.对本研究做出了同等贡献。
2009年12月8日收到；2010年4月19日接受。
- 补充资料
[补充方法、表格和图表]
GUID:81A1D18F-053E-4F83-A538-6CCC46A81A65
GUID:74656C56-EE5C-46C0-BA2A-6DB32115CABF
指南：EEDB828B-990C-4766-88DB-36009986DC8F
摘要
套细胞淋巴瘤（MCL）是一种主要由淋巴结套区的原始B细胞（NBCs）引起的不治之症。我们用HELP分析了MCL患者的全基因组甲基化(血红蛋白II通过连接酶介导的PCR扩增微小片段，发现与正常NBC相比，启动子甲基化模式存在显著异常。利用生物学和统计标准，我们进一步鉴定了4个高甲基化基因CDKN2B、MLF-1、PCDH8、和HOXD8型和4个低甲基化基因CD37、HDAC1、槽口1、和CDK5型当异常甲基化与mRNA水平的反向变化相关时。对MCL患者样本的独立队列进行免疫组织化学分析，证实93%的患者存在CD37表面表达，验证了其作为MCL治疗靶点的选择。用小型模块化免疫药物（CD37-SMIP）处理MCL细胞株导致表面CD37表达强烈的细胞株的活性显著丧失。用DNA甲基转移酶抑制剂dectabine处理MCL细胞株可逆转异常的高甲基化，并与组蛋白脱乙酰酶抑制剂suberoylanilide hydroxamic acid协同诱导高甲基化基因和抗MCL细胞毒性。我们的数据显示MCL中存在显著的异常启动子甲基化，并表明差异甲基化基因可以作为MCL治疗益处的靶点。
介绍
地幔细胞淋巴瘤（MCL）是一种侵袭性且大多是无法治愈的B细胞恶性肿瘤，占非霍奇金淋巴瘤（NHL）的5%。MCL起源于淋巴结滤泡外套层的原始B细胞（NBCs），其特征是t（11,14）染色体易位导致细胞周期蛋白D1过度表达(CCND1号机组).1然而，小鼠模型过度表达CCND1号机组如果没有其他致癌基因，例如MYC公司，不会发展为淋巴瘤，2这意味着MCL还涉及其他致病机制。Cip/Kip蛋白在活性CDK4/cyclin D复合物的形成中起着重要作用。在MCL以外的NHL中，p27（Kip）蛋白的表达与肿瘤的增殖活性呈负相关。三细胞凋亡相关基因，如BCL2级也发现使用不同的方法可以改变MCL。纯合子缺失BIM公司在MCL中也发现了BCL2家族的成员。4
表观遗传改变，如基因启动子甲基化，已被证明有助于实体和血液恶性肿瘤的发病机制。5分析MCL患者样本甲基化的单焦点研究显示关键基因（如细胞周期调节因子）的甲基化过高第14页农业研究基金和CDKN2A型,6,7蛋白磷酸酶SHP-1型8和Rho–腺苷三磷酸酶第1部分.9然而，这些研究没有将甲基化与NBC进行比较，NBC是这些恶性细胞的正常对应物。10一些证据表明NBCs是MCL的起源细胞，包括免疫球蛋白重链突变状态、t（11,14）染色体断点分析、，11基因表达微阵列。12,13为了更全面地了解MCL中异常DNA甲基化，我们使用纯化的正常NBC作为对照，对MCL DNA甲基化和基因表达进行了全基因组分析。我们报告，与正常NBC相比，启动子DNA甲基化在MCL基因组中异常分布，我们确定了异常的高甲基化和低甲基化基因，为该病的合理靶向治疗提供了依据。
方法
患者样本
根据赫尔辛基宣言，在知情同意后进行任何治疗之前，从新诊断为MCL的患者身上获取组织和血样。样品采集和实验室研究符合机构审查委员会和赫尔辛基协议。CD19编号+美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）治疗的22名患者的细胞在冷冻前通过磁珠从外周血或信息提取产品中分离纯化，以确保其纯度高于90%血红蛋白II通过连接介导的聚合酶链反应（HELP PCR）分析富集微小片段。在哈肯萨克大学医学中心接受白血病期MCL治疗的14名患者的外周血或卵清蛋白产物在没有任何选择的情况下被冷冻，但外周血的差异计数或同时进行流式细胞术分析足够高，以确保CD19纯度大于85%+B细胞。对于对照组，纯化正常免疫球蛋白D阳性（IgD+)通过使用磁珠分选，从Montefiore（Bronx，NY）儿童医院接受常规扁桃体切除术（非肿瘤适应症）的10名健康捐赠者的标本中获得NBC。
用HELP进行DNA甲基化分析
使用标准的高盐程序从样品和细胞系中分离基因组DNA，并按照前面所述进行HELP分析。14,15该检测使用比较性等裂殖体分析，在基因组尺度上询问胞嘧啶甲基化状态。简单地说，样本中的基因组DNA被甲基胞嘧啶敏感酶消化血红蛋白II与消息传递程序一、 对DNA甲基化有抵抗力，然后血红蛋白II和消息传递程序通过连接介导PCR扩增I产物。PCR条件已经过优化，可以扩增200到2000碱基对（bp）之间的片段，从而确保优先扩增胞嘧啶磷酸鸟苷（CpG）二核苷酸区域。然后用特定的染料标记每个组分，并将其共杂交到设计用于覆盖的微阵列上血红蛋白基因组中的II个可扩增片段（HAF）。15两种限制性内切酶对DNA的差异消化血红蛋白II（甲基化敏感）和消息传递程序I（甲基化不敏感）检测微阵列探针中覆盖的基因组DNA的甲基化。HELP方法和条件的详细描述已在之前发布。14,15DNA甲基化被测量为对数(血红蛋白二/消息传递程序一） 比率，范围为−5.91至5.73，其中幽门螺杆菌II反映了基因组的低甲基化部分消息传递程序我代表整个基因组参考。使用花青素标记的随机引物（9-mers）标记组分，然后将其杂交到人类HG17定制设计的寡核苷酸阵列（50-mers）上，该阵列覆盖位于基因启动子和印迹区域的25 626个HAF。HAF被定义为包含在2个侧翼之间的基因组序列血红蛋白在200至2000bp范围内发现的II个位点。阵列上的每个HAF由15个随机分布在微阵列幻灯片上的探针表示。所有用于微阵列杂交的样品均在Roche-NimbleGen服务实验室进行处理。使用GenePix 4000B扫描仪（Axon Instruments）进行扫描。通过分位数归一化校正PCR片段长度偏差。如Thompson等人所述，对HELP微阵列进行了进一步的质量控制和数据分析。16所有微阵列数据均已提交至基因表达综合库（登录号：。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE19243”，“term_id”：“19243”，”extlink“：“1”}}GSE19243标准).17
基因网络与基因本体分析
创新路径分析软件和注释、可视化和综合发现数据库19用于进行网络组成分析。血红蛋白HELP微阵列上的II-可扩增片段被注释到最近的基因，与转录起始点的最大距离为5千碱基。
MassARRAY EpiTyper定量DNA甲基化分析
如前所述，通过MassARRAY（Sequenom）的矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对HELP结果进行验证。20简单地说，使用Sequenom EpiDesigner设计了针对亚硫酸氢盐转化基因组DNA的PCR引物，以覆盖侧翼血红蛋白给定HAF的II站点以及任何其他站点幽门螺杆菌在下游站点上游2000 bp和上游站点下游2000 bp处发现II个站点（补充表1中显示的引物序列，可在血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。然后，将来自亚硫酸氢盐处理的基因组DNA的PCR扩增产物在体外转录成单链RNA，然后与内核糖核酸酶进行碱基特异性切割反应（T特异性或C特异性切割）。甲基化通过引入亚硫酸氢盐处理的基因组DNA中的C到U序列变化影响碱基特异性裂解质量信号模式，并表现为通过碱基特异裂解从反向链产生的G/A。裂解产物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测，并通过EpiTYPER软件v1.0（Sequenom）进行分析。裂解产物中的这些G/A变化导致每CpG 16Da的质量偏移，代表未甲基化和甲基化DNA的信号对模式。质量信号的存在/缺失表明了被询问序列中CpG的甲基化状态，成对质量信号的峰面积比率可用于估计甲基化的相对量。MassARRAY EpiTyper能够在大样本队列中以高分辨率对大序列进行定量筛选，而不存在因克隆硫酸氢序列中分析的克隆数量有限和焦序列中测序距离较低而容易产生偏差的缺点。MassARRAY与传统的亚硫酸氢盐克隆序列或亚硫酸氢焦序列之间的直接比较显示出高度相关性和可比性。21,22
细胞培养和药物治疗
细胞系Granta 519、HBL-2、JeKo-1、JVM-2、Mino、SP-49、SP-53、UPN1和Z138在37°C和5%CO的增湿培养箱中生长2添加有10%胎牛血清（FBS；双子生物制品）的RPMI 1640培养基（Cellgro），2mM我-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素G和100μG/mL链霉素（Cellgro）。将德西塔滨（DAC；Sigma-Aldrich）溶解在1mM浓度的无菌水中，并在−80°C下储存。细胞计数并以1×10的浓度播种6将细胞/mL放入6孔或12孔板中。对于甲基化阵列实验，添加DAC以达到0.1、0.5或1μM的浓度，并持续暴露2天。对于存活率和基因诱导研究，在第0天、第1天和第2天向细胞中添加DAC，以达到0.1或0.5μM的浓度。在第3天评估生存能力。在DAC和亚甲酰苯胺羟肟酸（SAHA）联合处理的情况下，细胞在第0天暴露于0.5或1μM SAHA。对于抗体细胞的体外治疗，细胞悬浮在密度为1×10的培养基中6细胞数/mL。CD37-SMIP（Trubion Pharmaceuticals）治疗使用5μg/mL浓度，剂量反应研究除外。以10μg/mL的浓度使用曲妥珠单抗（Genentech）和利妥昔单抗（Genertech）。在添加一级抗体5分钟后，将交联剂（Fc特异性）山羊抗人IgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc）添加到细胞悬浮液中，浓度为一级抗体的5倍（即5μg/mL为25μg/mL）。对于所有CD37-SMIP实验，使用一组相同浓度曲妥珠单抗处理的样品作为同型对照。此外，收集了一组未经处理的样品作为培养基对照。
细胞活力
按照制造商的说明，使用荧光测定法（CellTiter-Blue；Promega）测定细胞活力。在处理后48或72小时计算每个处理孔中的活细胞数。细胞（100μL；105将细胞）置于96 well板中（每个条件重复8次），并向每个孔中添加20μL CellTiter-Blue试剂（Promega）。与染料、荧光（560）孵育1小时后前任/590相对长度单位)使用Polarstar Optima微板阅读器（BMG Labtechnologies）进行测量。根据标准曲线的线性最小二乘回归计算每个处理孔中的活细胞数。将药物处理细胞的细胞活力标准化为其各自的未处理对照。根据制造商的规范，手动计数细胞，并在Countess自动细胞计数器（Invitrogen）上进行确认。
CD37的免疫组织化学和流式细胞术
使用先前组装的组织微阵列（TMA），其中包含14例MCL，通过免疫组化双核细胞周期蛋白D1蛋白表达证实。使用传统水浴技术切割四微米厚的切片，并在室温下干燥过夜。将TMA载玻片在60°C下加热30分钟，以熔化石蜡，然后通过二甲苯、分级乙醇和dH脱蜡和再水化20次洗涤。内源性过氧化物酶被过氧化物酶（Biocare Medical）阻断，而非特异性结合被背景终止剂（Biocear Medical）最小化。使用Avidin和biotin试剂盒（Biocare Medical）阻断内源性生物素。染色采用单克隆小鼠抗CD37（克隆IPO-24；Santa Cruz Biotechnology），稀释1:200，然后使用生物素化二级抗体、链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物、染色剂二氨基联苯胺和苏木精复染。对于流式细胞术，用RPMI和10%FBS清洗细胞一次，并用小鼠抗人异硫氰酸荧光素共轭抗CD37（克隆M-B371；Becton Dickinson）在4℃孵育30分钟。然后在4°C和300°C下旋转细胞克5分钟后，再悬浮在含2%FBS的300μL PBS中，并用流式细胞仪进行分析。
自动定量分析定量免疫荧光
采用自动定量分析（AQUA）系统（HistorRx）评估MCL和良性淋巴组织（淋巴结和扁桃体）TMA核心CD37表达的定量。简单地说，通过分别用原代兔抗CD20抗体（多克隆；NeoMarkers）和小鼠抗CD37抗体（克隆IPO-24）标记，然后添加生物素化的山羊抗兔抗体和Alexa 555山羊抗鼠抗体（Invitrogen），定义了B细胞膜和该膜中CD37的表达，最后用链霉亲和素-辣根过氧化物酶和Alexa Fluor 647-Tyramide孵育。前面已经描述过使用AQUA进行自动图像采集和分析，23但是，简单地说，通过基于像素的区域设置来创建B细胞二元掩码，用于划分表达式算法，CD37表达式表示为每单位B细胞掩码面积的平均信号强度，作为AQUA分数。各组间CD37表达通过非配对t吨28个MCL组织核心和14个良性淋巴组织核心的AQUA评分测试。
凋亡检测、定量实时PCR和Western blot分析见补充文件1。
结果
与原始B细胞相比，MCL原始样本具有不同的基因组甲基化特征
对22例原发性MCL患者样本和10例来自健康供体的纯化NBC对照样本进行了DNA甲基化分析。使用HELP分析和定制的高密度寡核苷酸微阵列，对超过15000个基因启动子区域的50000个CpG的DNA甲基化进行了量化。14所有甲基化阵列都通过了严格的质量控制和分位数标准化程序。16主成分分析用于在无监督的情况下评估这些样品组之间的潜在甲基化差异。如中所示A、 DNA甲基化谱很容易将MCL患者样本和NBC区分为离散组，这表明启动子DNA甲基化的分布在这些基因组之间差异很大。差异的基础主要是患者样本中的低甲基化，如fold-change与P（P）差异甲基化基因的价值(B） ●●●●。通过上述截止值确定的位点的DNA甲基化比率的热图表示，可以很容易地显示MCL患者与NBC患者基因启动子的主要低甲基化(C类；补充表2-3）。
与正常的原始B细胞相比，MCL基因组明显甲基化（A）DNA甲基化数据的三维主成分分析，比较MCL患者样本（红色）和原始B细胞（蓝色）。（B） 甲基化差异（x轴）与显著性（y轴）的曲线图显示出明显的不对称性，与NBC相比，MCL患者的总体甲基化倾向较低。在我们的分析中，蓝点标记探针集达到了差异甲基化的两个标准（甲基化差异为1.5和P（P）< .001). （C） 热图中MCL和NBCs患者上述差异甲基化位点的甲基化（HELP数据）。刻度显示相对甲基化（红色表示低甲基化；蓝色表示高甲基化）。
MCL中异常DNA甲基化涉及癌相关基因网络，并与异常基因表达相关
进行监督分析，以确定MCL与NBCs中异常甲基化的基因。使用调节器t吨使用测试P（P）值小于.01和Benjamini-Hochberg校正用于多次比较(A） 与NBC相比，共鉴定出1168个差异性高甲基化和2598个低甲基化探针组，用于区分MCL细胞系和患者（见补充表4-5）。这对应于4110个差异甲基化基因，因为一些探针集代表双向启动子。
选择不同的甲基化基因进行验证（A）甲基化差异（x轴）与显著性（y轴）的曲线图，显示MCL患者和MCL细胞系与NBC相比的所选差异甲基化位点。不同甲基化的探针组用蓝色标记(P（P）< .01). （B） MCL患者顶部差异甲基化位点的灵巧途径核心分析与NBCs鉴定的比较HDAC1型和NFKB1型作为最显著富集路径中的中心节点。MCL患者中不同的低甲基化位点用红色表示，而不同的高甲基化位点则用绿色表示。（C） 甲基化[HELP log(血红蛋白二/消息传递程序一） 比率]在热图中表示的8个差异甲基化位点上进行验证。刻度显示相对甲基化，蓝色表示高甲基化，红色表示低甲基化。
为了识别由差异甲基化位点富集的通路和功能群，将4110个基因输入Ingenuity Pathway Analysis数据库和注释、可视化和综合发现数据库（见“方法”）。差异甲基化位点确定的顶级通路围绕关键细胞蛋白，如组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）和核因子κB1（NFKB1）转录因子(B） 因此，参与转录、转录调节和基因表达的关键细胞调节过程().
表1
DAVID基因丰富的功能群——MCL和MCL细胞系患者高甲基化基因的个体发育分析
| 基因个体发育术语 | 本杰米尼 |
|---|
| 转录 | 8.40 × 10−10 |
| 转录调控 | 5.70×10−10 |
| 转录调控，依赖于DNA | 1.30 × 10−9 |
| 基因表达调控 | 1.20 × 10−9 |
| 转录，依赖于DNA | 1.40 × 10−9 |
采用逐步方法整合DNA甲基化和基因表达阵列的数据，以选择具有潜在生物学重要性的基因进行验证。Affymetrix U133阵列用于从HELP用于甲基化分析的相同预处理活检样本中检测14500个基因。我们发现1413个基因座的mRNA水平在表达阵列平均值之上和之下都有反向变化，即表达低于阵列平均值的高甲基化基因，反之亦然（下文详细解释并在补充表6中列出）。从这组中，有8个基因(C） 选择具有以下特征的作为进一步研究的候选者。（1） 低甲基化基因参与癌症中已知致癌活性的生物过程控制途径，即细胞周期控制、凋亡：CD37型,24,25 HDAC1型,26 缺口1,27和CDK5型.28（2） 在MCL或其他肿瘤中起抑癌作用的基因，以及与NBC相比MCL中高甲基化的基因：CDKN2B型,HOXD8型,MLF-1型、和PCDH8型.
8个基因中的6个(PCDH8型,HOXD8型,CDKN2B型,CDK5型,HDAC1型,缺口1)达到差异甲基化阈值(P（P）<.01）在患者和MCL细胞系（补充图4A）中CD37型和MLF1级作为例外。然而，在我们的初步研究中，单位点DNA甲基化检测29患者和细胞系之间的启动子甲基化状态也显示出一致性CD37型和MLF1级.CD37特别有趣，因为它在B细胞表面强烈表达，使其成为B细胞NHL的一个有吸引力的靶点。24,25髓系白血病因子1(百万英镑1)胃癌患者样本中存在不同程度的高甲基化，30提示白血病中可能存在异常转录控制以外的作用。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2b(CDKN2B型)抑制细胞周期素依赖性激酶4和6，据报道在MCL中表现为表观遗传学沉默。6原钙粘蛋白8(PCDH8型)和同源盒D8(HOXD8型)已经发现在乳腺癌中被甲基化灭活。31,32细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）在乳腺癌的DNA损伤反应和细胞周期检查点激活中发挥作用。28HDAC抑制剂HDAC126和转录因子NOTCH127是治疗B细胞和T细胞恶性肿瘤的已知治疗靶点。
定量启动子甲基化测序证实候选基因的异常调控
为了证实8个候选基因的DNA甲基化确实与HELP分析的预测一致，我们对启动子区域进行了EpiTyper质谱定量DNA甲基化测序（补充表7）。22例患者样本来自用于HELP分析的同一组，另外14例MCL淋巴结样本用作独立的验证队列。在甲基化百分比以热图的形式绘制，每列代表一个CpG，每行代表一个样本。热图显示了MCL细胞系、MCL患者样本和NBC之间不同的甲基化模式。PCDH8型(A） 和MLF1级(B） 是高甲基化位点的例子，以及CD37型(C） 和HDAC1型(D） 是低甲基化位点的例子（补充图1中有其他热图）。我们发现具有统计学意义(P（P）<.001）所有8个基因启动子区MCL患者样本与NBC样本之间甲基化的差异，证实了我们的HELP结果（补充表7）。另外14个初级样本证实了在8个候选基因启动子测序的最初22个患者样本中发现的甲基化变化。
MassArray证实MCL和MCL细胞系患者与NBC对照组相比存在差异甲基化（A-D）MassArray数据的热图，比较MCL患者、MCL细胞系和NBC对照个体CpG中甲基化过甲基化基因的甲基化情况PCDH8型和MLF1级和低甲基化基因HDAC1型和CD37型。行对应单个样本，列对应单个CpG。底漆覆盖的区域，幽门螺杆菌所有位点、CpG岛、转录方向和基因启动都在加州大学圣克鲁斯浏览器中显示为轨迹。刻度显示相对甲基化（绿色表示低甲基化；紫色表示高甲基化）。
MCL中DNA甲基化与基因表达的负相关
我们通过比较HELP比率和2个阵列平台之间共同代表的12731个基因的mRNA表达，检查了10例MCL患者和10个MCL细胞系的甲基化与基因表达值的全基因组相关性。相关系数的分布表明具有高相关系数的基因的尾部非随机倾斜(R（右）>0.5）与标准正态分布相比(A） ●●●●。相关系数大于0.5的基因有3528个，占比较基因座的11.3%。这表明甲基化和基因表达之间存在微弱但非随机的全基因组相关性。接下来，我们比较了MCL患者中8个基因的mRNA表达水平和HELP甲基化状态(B） ●●●●。所有4个高甲基化位点的表达均显著降低(P（P）<.001）低于低甲基化位点的表达。通过Western blotting，候选基因的蛋白表达发生了甲基化(PCDH8型)和低甲基化(HDAC1型)基因被证明与甲基化状态相互作用(C-D）在3个MCL患者样本和3个MCL细胞系（MINO、HBL-2和Z138）中与3个NBC样本进行比较。通过Western blot和AQUA分别对NOTCH1和CD37进行类似验证，并通过定量实时PCR对HOXD8和MLF1进行验证(A-C；补充图5A-C）。
基因和蛋白质表达与甲基化相互作用（A）以分位数正态图表示的12731个基因中HELP比率和mRNA水平的相关性。相关系数的分布显示具有高相关系数的基因的尾部非随机倾斜(R（右）>0.5）与标准正态分布相比。（B） 10例MCL患者和10个细胞系的mRNA表达水平与信号强度呈函数关系。每个探针组的Log 2杂交强度表示基因转录物（y轴）mRNA表达的相对水平。高甲基化基因座用蓝色编码，低甲基化基因位用红色编码。误差条表示SD。（C-D）Western blot检测3个NBC、3个患者和3个细胞系（HBL2、MINO、Z138）中HDAC1和PCDH8的蛋白表达，并将肌动蛋白作为负荷对照。
CD37在MCL和MCL细胞系患者中表达，CD37-SMIP治疗对MINO具有细胞毒性（A）正常扁桃体对照组织的代表性中等倍（20倍原始放大）视图，显示B细胞滤泡的B细胞表达CD37，滤泡间淋巴细胞中缺乏表达。与生发中心的细胞相比，地幔区内的B细胞的膜和细胞质染色强度更大。（B） 组织微阵列中2mm MCL核心的代表性高功率（40倍）和低功率（10倍，插图）视图。使用安装在奥林巴斯BX41显微镜上的DP2-BSW 1.3版软件，使用奥林巴斯DP25数码相机拍摄图像，目标为10×/0.30、20×/0.40和40×/0.65。在Adobe Photoshop CS2 9.0.2版中，在不进行颜色或对比度操作的情况下调整图像大小。（C） 用免疫荧光AQUA检测CD20中CD37的表达+来自MCL病例和良性淋巴组织的B细胞显示在组织芯片上。柱状图表示28个组织核心的平均值，代表14例MCL，14个组织核心来自8例良性淋巴组织（6个淋巴结和2个扁桃体）；条形，1 SD双尾，未配对t吨测试，P（P）< .001. （D） 用异硫氰酸荧光素（FITC）结合抗CD37抗体和IgG1同型对照抗体流式细胞术评估6个MCL细胞系中CD37的表面表达。（E） 用CD37-SMIP、利妥昔单抗和曲妥珠单抗治疗后72小时，在存在交联Fc-特异性山羊抗人IgG的情况下，MINO细胞的存活率。通过Annexin V/碘化丙啶染色测定存活率，并将其归一化为对照。数据代表了3个单独的实验。
CD37在MCL患者样本和细胞系中表达，CD37-SMIP治疗对MINO细胞具有细胞毒性
甲基化和基因表达阵列分析确定，在MCL和MCL细胞系患者中，B细胞表面抗原CD37呈低甲基化和过表达。在一个由14名MCL患者组成的独立队列中，通过免疫组化进一步评估原发性MCL中CD37的表达。在福尔马林固定石蜡包埋的良性扁桃体对照组织上优化抗CD37（克隆IPO-24）抗体，以在成熟B细胞上显示染色，而在T细胞和巨噬细胞上不显示染色。B细胞卵泡显示出CD37表达的双重模式，其中套带B细胞的膜质和细胞质CD37表达强度高于生发中心B细胞(A） ●●●●。由训练有素的血液病理学家（D.T.Y.）评估细胞数量（频率）和CD37染色强度。如果超过80%的肿瘤细胞显示3的细胞质/膜染色模式，则认为染色阳性+0到4上的值或更大+主观强度标度，在2个核心之间平均。14个MCL样本中有13个（93%）在组织芯片上重复表达CD37。在所有阳性病例中均可见细胞质和膜的联合表达模式(B） ●●●●。表达似乎是一种全部或全部现象，单个阴性病例没有检测到染色，所有阳性病例在肿瘤细胞中都有强表达。使用CD20中蛋白质表达的定量评估+AQUA检测TMA上福尔马林固定石蜡包埋组织核心中的B细胞，MCL样本中CD37的表达显著高于良性淋巴组织活检中的表达(C） ●●●●。CD37在6个MCL细胞系中表达阳性(D） 流式细胞仪检测。用5μg/mL CD37-SMIP处理MINO细胞72小时后，在存在交联的Fc-特异性山羊抗人IgG的情况下，通过Annexin V/碘化丙啶染色评估存活率降低75%(E） ●●●●。用对照抗体利妥昔单抗和曲妥珠单抗分别导致70%和0%以上的细胞死亡。这些结果表明，CD37在大多数MCL患者中的表达水平高于正常NBC，并支持CD37-SMIP在MCL中的潜在治疗作用。
DAC与SAHA协同诱导MCL细胞甲基化抑癌基因和细胞毒性
DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂（如DAC）和HDAC抑制剂（如SAHA）在激活表观遗传沉默的肿瘤抑制基因方面相互合作甚至协同作用。33在2个特征良好的MCL细胞系MINO和Z138中评估了这些药物对异常甲基化和沉默的肿瘤抑制基因重新表达的影响，其中MLF1级,PCDH8型,HOXD8型、和CDKN2B型基因高度甲基化(A-B；补充图1A-B）和抑制(B） ，使用低浓度（0.5μM）的DAC持续3天，有或没有1μM SAHA。这种DAC浓度会导致广泛的DNA低甲基化，并诱导高甲基化基因的表达（补充图3A-D），而不会造成DNA损伤。9,34DAC和SAHA的联合使用使Z138细胞中MLF1、PCDH8和HOXD8 mRNA水平增加了5至15倍，而在MINO中PCDH8与CDKN2B的水平也增加了5到15倍(A；补充图3B和5D-F）。用DAC处理MCL细胞导致CCND1号机组,第27页、和第21页在MINO和Z138细胞系中BIM公司Z138电池中单独使用（补充表8）。在Z138细胞中，0.5μM DAC单独使用3天可使细胞活力降低40%，1μM SAHA可使细胞存活率降低60%，而联合使用可使细胞生存率降低90%以上(B） ●●●●。Chou-Talalay对细胞毒性和基因表达的协同作用进行了量化35使用Calcusyn软件得出的方程式，两种细胞系中SAHA和DAC的组合指数均小于1。尽管在MINO细胞中不明显，但与单独使用两种药物相比，使用DAC和SAHA治疗也会导致更大的细胞杀伤（补充图3E和6A-C）。另一种MCL细胞系HBL2在细胞毒性方面也发现了类似的协同作用（补充图6A-C）。
DAC与SAHA在Z138细胞的基因诱导和细胞毒性中的协同作用（A）实时PCR检测用DAC 0.5μM每日治疗3天前后Z138细胞PCDH8、HOXD8和MLF1的mRNA表达，SAHA 1μM（第0天单次给药）及其组合。数据代表了3个单独的实验。误差线显示SD。（B）Z138细胞每天用DAC 0.5μM治疗3天，SAHA 1μM（第0天单次给药）单独或联合治疗。通过药物治疗48小时后瑞沙唑啉的减少来测量细胞存活率（y轴）（分8个重复进行）。
讨论
在这里，我们发现胞嘧啶甲基化的分布在MCL细胞中受到严重干扰。本研究中使用的HELP平台允许查询位于14000多个启动子中的50000多个CpG，提供了比单位点分析或更有限的阵列平台更深入的DNA甲基化视图。DNA甲基化与基因表达呈负相关，使用MassArray定量DNA甲基化测序验证感兴趣的候选基因。通过比较MCL甲基化谱与从MCL正常对应物扁桃体NBCs纯化群体中获得的甲基化谱，可以准确确定异常DNA甲基化的构成。10
数据表明，与NBC相比，MCL中基因启动子低甲基化的优势令人惊讶。启动子的异常超甲基化和随后的抑癌基因沉默，如第14页农业研究基金和CDKN2A型已在MCL和其他肿瘤中描述。5,6相反，基因启动子异常低甲基化可导致具有致癌潜能的基因转录增加。Liu等人36已经表明CCND1号机组启动子是低甲基化的，这与RNA聚合酶II的募集和CCND1号机组MCL中的mRNA。DNA低甲基化也可能发生在基因间和非编码重复DNA片段中，它可能通过引起基因组不稳定或改变常染色质-异染色质相互作用而导致癌症发病。37例如，DNMT1低形态小鼠的DNA低甲基化与基因组不稳定性和T细胞淋巴瘤的发生有关。38,39我们的研究结果表明，启动子低甲基化和高甲基化同时发生，并且每一种都可能独立于MCL的发病机制。急性髓细胞白血病40卵巢和胃肿瘤已被证明具有类似的异常甲基化模式。37,41
DNMTs是向DNA或RNA添加甲基的酶。DNMT1主要负责半甲基化CpG岛甲基化，DNMT2将甲基转移到RNA而不是DNA，因此已被重命名为tRNA天冬氨酸甲基转移酶1（TRDMT1），DNMT3负责非甲基化Cp岛甲基化。42仅在我们的分析中DNMT3A型在MCL和MCL细胞系患者中显著低甲基化和过度表达（补充表6）。骨髓增生异常综合征中DNMT3A表达增加与异常基因沉默相关43和急性髓细胞白血病44并可与DAC等DNMT抑制剂靶向。DNMT3a可类似地介导MCL中的异常基因沉默，并易受MCL细胞系中DAC的抑制（补充图6B）。
几个低甲基化和上调的基因，包括HDAC1型,CD37型,25 缺口1,27和CDK5型,28在单基因座分析中得到验证。CD37是四跨膜分子家族的成员，在B细胞上表达，但在静止T细胞、自然杀伤细胞或巨噬细胞上不表达。45,46在B细胞发育过程中，CD37在从前B细胞阶段进展到成熟B细胞阶段的细胞中表达，并且在向浆细胞的终末分化中不存在。47在启动子甲基化程度较高的情况下，NBC中CD37的表达较低，这与NBC似乎准备进入生发中心反应但尚未完全关闭CD37的模型一致。CD37-SMIP是利用G28-1杂交瘤的可变区域和编码人类IgG1结构域的工程恒定区域开发的。25CD37-SMIP被设计成具有比肾小球过滤的分子大小更大的分子大小，延长了其半衰期，并赋予其相对于单克隆抗体的潜在优势。25CD37-SMIP在慢性淋巴细胞白血病的小鼠严重联合免疫缺陷异种移植物模型中在体外和体内显示出显著的活性。25缺乏CD37的小鼠在淋巴器官的发育或构成方面没有任何缺陷，但血清中的IgG1水平降低，T细胞抗原依赖性B细胞反应发生改变。48用CD37结合放射性碘-131治疗未经选择的B细胞NHL患者，只引起暂时性淋巴细胞减少，没有感染并发症，也没有导致免疫球蛋白水平的变化。49,50我们观察到与NBC相比，MCL患者和MCL细胞系CD37启动子中CpG的低甲基化，这表明启动子高甲基化的缺失有助于MCL中CD37的高表达。我们的结果可用于根据MCL临床试验中患者的CD37型启动子甲基化和基因表达，以确定对CD37-SMIP治疗有更高反应可能性的组。对MCL中这种和其他低甲基化/过度表达靶点的进一步研究可能会扩大针对这种疾病的治疗机会。
在MCL中发现了许多异常高甲基化基因。我们专注于CDKN2B型,6 MLF-1型,30 PCDH8型,31和HOXD8型32与NBC相比，MCL和MCL细胞系患者中具有肿瘤抑制功能且被发现高甲基化且表达较低的基因。报道的MCL患者中CDKN2B高甲基化的比例有很大差异，从9%7至62%6尽管使用了相同的PCR引物。在当前研究中，CDKN2B型经HELP分析评估，与NBC相比明显甲基化(P（P）<.001）和质谱(P（P）<.001），提供独立确认CDKN2B型所研究的大多数MCL患者的启动子高甲基化与Hutter等人的报告一致。6用DAC、SAHA或两者联合治疗Z138 MCL细胞株可诱导HOXD8型,PCDH8型、和MLF1级表达和细胞活性降低。DAC和SAHA的联合具有协同作用，这可能反映出多种抗MCL机制：（1）逆转肿瘤抑制基因的超甲基化（补充图3），（2）抑制HDAC1（这是一种已鉴定的低甲基化和过表达基因），以及（3）抑制CCND1号机组51翻译。即使是低剂量的这些药物在MCL细胞中也具有强大的细胞毒性协同作用，这表明这种组合在治疗MCL中的临床实用性。
总之，本研究显示MCL基因组甲基化显著且异常，并表明来自MCL患者和MCL细胞系的样本中存在新的基因靶点。异常甲基化的鉴定可能对MCL以外的恶性肿瘤的研究和治疗具有指导意义。低甲基化和过表达基因，如CD37，可直接作为治疗靶点。我们还证明了两种表观遗传药物DAC和SAHA联合使用的抗MCL潜力。鉴于迫切需要扩大MCL的治疗选择，以及DAC和SAHA在临床试验中的安全性，使用这种组合的表观遗传治疗可能是对抗MCL的一个有用的补充。更广泛地说，我们的数据支持一种研究全基因组启动子甲基化和基因表达的综合方法的基本原理，从而对人类疾病的生物学和治疗产生新的见解。
致谢
我们感谢爱因斯坦表观基因组学核心，特别是铃木Masako博士、John Greally博士、Paraic Kenny博士和Kenny Ye博士在阵列分析方面的帮助。我们还感谢Robert Gallagher医学博士、Barbara Birshtein博士和David Goldman医学博士对手稿的阅读和评论。
这项工作得到了化疗基金会的拨款和Paul Calabresi职业发展奖（K12 CA132783-01；S.P.）的支持；国家癌症研究所（R01 CA104348至A.M.；R01 HL082946至A.V.；P01 CA95426和P01 CA813534至J.C.B.和N.M.）；化疗基金会和塞缪尔·瓦克斯曼研究基金会（A.M.）；由Gabrielle Angel基金会、白血病和淋巴瘤协会以及Hershaft家庭基金会（A.V.）资助；以及D.Warren Brown基金会和白血病与淋巴瘤协会（J.C.B.和N.M.）。A.M.是白血病和淋巴瘤学者和Burroughs Wellcome临床转化科学家。
脚注
出版商或接收人承认美国政府有权保留文章版权的非排他性、免版税许可。
本文的在线版本包含数据补充。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节的规定，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：V.V.L.、P.-Y.K.、D.T.Y.和S.P.设计并执行了研究，分析和解释了数据，并撰写了论文；R.S.进行实验并提供重要试剂；T.G.和A.P.有助于数据分析；Y.Y.为统计分析提供支持；W.W.、I.B.、N.M.、B.S.K.和J.C.B.设计并执行研究和分析数据；Y.R.、M.A.W.和S.R.设计并执行了实验；K.S.S.、A.G.和A.W.贡献了重要试剂并设计了研究；A.V.和A.M.参与了研究设计，并对手稿进行了批判性审查。所有作者审查并批准了手稿的最终版本。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通信地址：Samir Parekh，Yeshiva大学阿尔伯特·爱因斯坦医学院，1300 Morris Park Ave，Chanin 302-D2，Bronx，NY 10461；电子邮件：ude.uy.nietsnie@hkerap.rimas.
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