老年动脉粥样硬化小鼠的心脏和血管变化：性别的影响
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1,2和
1 蒂亚戈·MC·佩雷拉
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣多联邦大学。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
布伦诺·诺盖拉
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣多联邦大学。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
利马Leandro CF
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣多联邦大学。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
马塞拉·波尔图
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣托联邦大学，Av。Marechal Campos 1468，维多利亚州，ES 29043-900，巴西
何塞·A·阿鲁达
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣多联邦大学。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
埃利萨多·巴斯克斯
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣多联邦大学。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
2巴西西班牙维多利亚州Emescam健康科学学院研究中心
Silvana S Meyrelles公司
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣托联邦大学，Av。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
1转基因和心血管控制实验室，生理科学研究生项目，健康科学中心，埃斯普-里托圣多联邦大学。巴西ES 29043-900，Vitoria，Marechal Campos 1468
2巴西西班牙维多利亚州Emescam健康科学学院研究中心
通讯作者。 收到日期：2010年7月22日；2010年8月19日接受。
版权©2010 Pereira等人；被许可方BioMed Central Ltd。 摘要
背景
虽然高龄被认为是多种疾病的危险因素，但性别对年龄相关性心血管疾病（如动脉粥样硬化过程和瓣膜病）的影响仍未完全阐明。本研究旨在使用载脂蛋白E敲除（ApoE KO）小鼠评估老年人主动脉瓣的形态和功能以及血管损伤。我们的假设是动脉粥样硬化雄性小鼠中与年龄相关的晚期心血管变化加剧。
方法
通过血管造影术评估主动脉瓣反流的级别（0至4）。此外，通过组织化学分析评估了老年雄性和雌性ApoE KO小鼠的血管脂质沉积和衰老，并将结果与野生型C57BL/6J（C57）小鼠进行了比较。
结果
92%的雄性ApoE KO小鼠和100%的雄性C57小鼠出现主动脉返流。相比之下，在年龄匹配的雌性ApoE KO和C57小鼠中，主动脉瓣返流的比例分别为58%和53%。以C57组为参考值，主动脉组织学分析显示ApoE KO小鼠（雌性：1.86±0.15；雄性：1.89±0.68）的主动脉发生外向（阳性）重塑。主动脉的组织化学评估显示，只有ApoE KO组出现脂质沉积和血管衰老，这在雄性小鼠中更为明显。
结论
数据表明，雄性参与主动脉瓣反流的进展，高胆固醇血症和雄性参与老年小鼠脂质沉积和血管衰老的发生。
背景
尽管一些研究已经将高龄作为心血管疾病的危险因素[1,2]性别对与年龄相关的心血管性能的影响尚待完全阐明[三,4]. 这个问题很重要，因为心血管老化中的性别差异，如动脉粥样硬化过程和瓣膜疾病，可能有助于解释女性长寿的部分原因[5,6].
在过去几十年里，新的研究工具的出现，包括纯合载脂蛋白E敲除（ApoE KO）小鼠，有助于了解动脉粥样硬化过程和心血管疾病[7,8]. ApoE是肝脏合成的极低密度脂蛋白的一种成分，介导含ApoE的脂蛋白颗粒与低密度脂蛋白受体的高亲和力结合，并负责这些颗粒的细胞摄取[9]. 因此，ApoE KO小鼠出现明显的高胆固醇血症和自发动脉粥样硬化[9-11]. 在这个实验模型中，性别的影响只在年轻成年小鼠的富含胆固醇的西式饮食中被报道[12,13]但老年人和性别对心血管功能的影响尚未阐明。
在本研究中，我们的假设是，高龄会影响动脉粥样硬化小鼠的心血管结构，这在雄性小鼠中可能会加剧。在正常的饮食中，ApoE KO小鼠受到体内血管造影和在体外组织化学分析以表征瓣膜和主动脉的形态。
材料和方法
动物
老龄雄性和雌性小鼠（18个月大）随机分为四组：C57（雌性：n=26；雄性：n=22）和ApoE KO（雌性：n=28；雄性：n=23）。动物取自圣埃斯皮里托联邦大学转基因和心血管控制实验室的动物设施。老鼠被喂食正常的食物和水随意并分别置于温度控制室（22°C）中，光/暗循环12h。所有程序都是根据动物研究机构指南进行的，并且这些协议之前已经由动物使用机构伦理委员会（CEUA 001/2009）批准。
血管造影分析
用氯胺酮/甲苯噻嗪（91.0/9.1 mg/kg，IP）麻醉小鼠，并将装有肝素化（10 UI/mL）生理盐水的聚乙烯导管（PE10-PE50）插入右侧颈动脉进行造影剂灌注。将每只小鼠置于仰卧位置，使用血管造影X射线系统（日本岛津公司）以5帧/秒的速度在0°和45°下获取图像。使用手动注射器进行X射线血管造影，该注射器被控制为可重复输送0.15 mL/s含35%碘的非离子造影剂（Telebrix；然后记录每只小鼠的序列图像，并使用定量冠状动脉分析软件（日本岛津公司QCA）分析主动脉内径。根据Pujadas的研究，通过连续收缩后对比度的强度、范围和持续性来评估主动脉瓣反流（AR）的检测，并根据严重程度（0-4）进行分类[14].
心肺参数
测量肺的湿重，然后将组织置于60°C的烘箱中24小时。肺的含水量（%h2O） 确定如下[15]：%H2O=（湿重-干重）/湿重×100。心脏湿重用于确定心脏重量/体重比。
组织学瓣膜和血管加工
实验结束时，用过量的硫喷妥钠（100 mg/kg，IP）对小鼠实施安乐死，并通过左心室灌注磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4；0.1 M），然后在100 mmHg的压力下使用甲醛（4%）固定溶液。在固定液中放置一夜后，主动脉的血管周围脂肪组织被移除。将主动脉瓣和上行主动脉部分嵌入24%明胶溶液中，然后使用低温恒温器（Jung CM1800；Leica，Wetzlar，Germany）以10μm的厚度进行横截面。对于每只动物，将主动脉横切面安装在明胶涂布的载玻片上，并用Oil-Red-O（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）染色以检测中性脂质，用苏木精（Sigma-Aldrich）染色以进行瓣膜形态分析，该分析由独立研究者完成。切割心脏时要格外小心，以便横向切割瓣膜。为了进行纵向分析，心脏被石蜡包埋，并在纵切面上切割，切片厚度为8-12μm。玻片用苏木精-伊红染色以检测细胞数和厚度。玻片还用Masson三色染色以检测是否存在纤维化，用von Kossa染色以进行钙化分析。将残留的整个主动脉纵向切开并染色面对面用于脂质沉积和血管衰老活动。
衰老活性β-Gal染色
通过β-半乳糖活性进行衰老染色，如Minamino等人所述[16]. 简要地，面对面主动脉样品在37°C下在新制备的β-半乳糖苷染色溶液（pH 6.0）中培养24 h，该染色溶液含有2.4 mM 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖甙（X-gal，Sigma-Aldrich）、4.7 mmol/L亚铁氰化钾、4.9 mmol/L铁氰化钠、150 mmol/L-氯化钠、1 mmol/L-MgCl2和40 mmol/L柠檬酸。衰老分析是通过检测酶反应产生的蓝色来进行的，图像是用照相机拍摄的（美国佳能公司）。使用美国国立卫生研究院（NIH）图像程序（Image-J 1.35 d，NIH，Bethesda，USA）对衰老进行量化，检查人员对实验组不进行观察。
形态测量学
主动脉和瓣膜的图像是用连接到显微镜的彩色摄像机（日本东京日立VKC150）拍摄的（美国宾夕法尼亚州中心谷奥林巴斯AX70奥林巴斯）。由一名对实验组不知情的考官使用徕卡图像程序（2100徕卡EWS；Leica，Wetzlar，Germany）和NIH图像程序进行分析。程序是用刻度幻灯片校准的。通过使用4倍物镜，血管横截面积（V加拿大标准协会)计算管腔横截面积。将每只动物的V值除以血管重塑率加拿大标准协会按V平均值加拿大标准协会在C57组中，每个样本被分为无重塑（0.95-1.05）、向内重塑（<0.95）或向外重塑（>1.05）。在左心室中，每组7只小鼠测量了瓣膜的最大厚度和至少10个心肌细胞的宽度。
血浆胆固醇水平的测定
从每只动物的颈动脉采集血样（200μL），并使用商业比色试剂盒（巴西贝洛奥里藏特Bioclin）测量血浆总胆固醇。
统计分析
连续变量以平均值±SEM表示。采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，然后采用Tukey事后（post-hoc）测试组间连续变量的多重比较。学生的t吨-适当时对独立样本进行测试。分类变量以频率表示，并使用Fisher精确检验进行比较。显著性水平设定为p<0.05。
结果
表总结了体重和心脏重量、心肌细胞大小、肺含水量和血浆胆固醇水平的平均值。在实验时，C57组和ApoE KO组的体重没有差异。正如预期的那样，ApoE KO雌性（4.1倍，p＜0.001）和雄性（6.7倍，p＜0.001）的总血浆胆固醇水平显著高于C57组的雌性和雄性。与老年雌性ApoE KO小鼠相比，老年雄性小鼠的血浆胆固醇水平显著升高（93%；p<0.001）。根据心脏重量/体重比和心肌细胞大小，与C57或ApoE KO组的雌性动物相比，雄性动物未观察到心肌肥大。此外，两组之间未观察到肺含水量增加。
表1
C57和ApoE KO的体重和心脏重量、心肌细胞大小、肺含水量和血浆胆固醇水平。
| 组 |
|---|
|
|
|---|
| 参数 | 第57页 | 阿波E KO |
|---|
|
|
|---|
| 女性 | 男性 | 女性 | 男性 |
|---|
| 体重（g） | 31 ± 0.9 | 33 ± 0.7 | 30 ± 0.5 | 32 ± 0.7 |
| 心脏重量/体重比（mg/g） | 5.9 ± 0.4 | 5.7 ± 0.4 | 6.0 ± 0.4 | 5.9 ± 0.3 |
| 心肌细胞宽度（μm） | 15 ± 0.1 | 15 ± 0.2 | 15 ± 0.1 | 15 ± 0.1 |
| 肺含水量（%） | 76 ± 0.6 | 76 ± 1.2 | 75 ± 0.5 | 76 ± 0.9 |
| 血浆胆固醇（mg/dL） | 81 ± 4 | 96 ± 7 | 336 ± 32* | 650 ± 92#* |
通过血管造影和注射碘化造影剂，我们发现与老年女性相比，老年ApoE KO和C57男性主动脉瓣返流显著（图，底部面板）。将ApoE KO和C57动物分组时，主动脉瓣返流（1-4级）雄性小鼠的比例（96%）显著高于雌性小鼠（51%）（p=0.0008）。当分析仅限于胆固醇含量正常的C57组时，雄性动物主动脉瓣反流的比例显著高于雌性（100%对53%；p=0.006）。高胆固醇血症ApoE KO组也观察到类似结果（92%对58%；p=0.02）。图的上面板显示了一例无主动脉瓣反流的老年女性的典型血管造影（左图）和一例主动脉瓣返流的老年男性的典型血管造影（右图）.
性别对老年正常和高胆固醇血症小鼠主动脉瓣返流的影响。顶面板：典型的血管造影显示男性主动脉瓣返流（右图），而女性主动脉瓣返流则未显示（左图）。底部面板：散点图显示C57和ApoE KO组男性与女性相比主动脉瓣反流的严重程度（等级：0=无，1=轻，2=轻，3=中，4=严重）。水平条表示每组的中间值。使用Fisher精确检验计算p值，并显示比例之间的统计显著性。每组动物的数量显示在括号中。
图显示了心脏组织学检查结果，显示老年男性与C57组女性相比主动脉瓣增厚（分别为106±4 vs 32±5μm；p＜0.001），更显著的是，老年男性与ApoE KO组女性相比主动脉瓣增厚（分别为186±3 vs 69±6μm；p＜0.001）。老年男性心脏瓣膜纵切面分析（图)ApoE KO小鼠小叶海绵层主要表现为无细胞性、糖胺聚糖转化和纤维化。在C57或ApoE KO动物中未观察到瓣膜钙化。
正常胆固醇C57和高胆固醇ApoE KO组雄性和雌性小鼠主动脉瓣的典型显微照片。方形表示每个阀门的最大厚度。箭头显示C57组和ApoE KO组男性的瓣膜病变，如含铁血黄素沉积所示。切片用Oil-Red-O和苏木精染色。放大倍数：400×。
雄性高胆固醇血症ApoE KO和正常胆固醇血症C57小鼠纵轴上主动脉瓣的典型显微照片。样品用苏木精-伊红（HE）、马森三色（MT）和von Kossa（VK）染色。黑色箭头表示ApoE KO小鼠海绵层（HE、MT和VK）的弥漫性无细胞性和粘液样增厚。红色箭头显示瓣膜纤维化，主要在ApoE KO小鼠中伴有致密胶原（MT）。放大倍率：250×。
如图所示，主动脉四段的血管造影分析未显示各组之间内径的显著差异.
主动脉内径（平行红线）的典型血管造影分析分为四段：A） 升主动脉-左颈总动脉；B） 左颈总动脉-主动脉下段胸段；C） 主动脉下胸段-右肾动脉；D） 主动脉的下胸段-髂总动脉的分叉。为了更好地可视化，a和B图像以45°的角度进行，而C和D图像以0°的角度进行。
图（底部面板）总结了升主动脉横截面积的数据，显示所有组的管腔面积相似。然而，女性的血管面积显著增加（2364±192μm2)男性（2869±102μm2)ApoE KO小鼠与C57小鼠相比（1274±175和1517±283μm2分别为；p<0.05）。因此，以C57动物为参考值，在雌性（1.86±0.15）和雄性（1.89±0.68）ApoE KO小鼠中均观察到正向（>1.05）血管重塑。图的顶部面板显示了升主动脉横截面的典型显微照片，表明ApoE KO与C57小鼠相比存在向外的血管重塑。
顶面板：升主动脉横截面的典型显微照片，显示高胆固醇血症ApoE KO与正常胆固醇血症C57小鼠相比血管直径增加。切片用油红-O和苏木精染色（放大倍数：400倍）。底部面板：条形图，显示C57（n=6）和ApoE KO（n=5）小鼠的平均血管（白色条）和管腔（黑色条）横截面积。数值为平均值±SEM。括号中的数字表示正重塑率（>1.05）*与C57组的血管面积相比，p<0.05。
在主动脉的组织化学评价中（图)，仅在ApoE KO组和主要雄性动物中观察到钙沉积（面板A）。En脸全主动脉分析（B组）显示雌性和雄性ApoE KO小鼠的脂质沉积更大（0.21±0.04和0.35±0.05 cm2)与C57小鼠相比（0.11±0.01和0.12±0.01厘米2（p<0.05）。面板C显示代表性面对面血管衰老分析（β-gal阳性细胞）。雌性和雄性ApoE KO小鼠的主动脉染色面积增加（0.025±0.02和0.19±0.08 cm2与C57小鼠相比（0.010±0.008和0.016±0.009 cm2（p<0.05）。
正常胆固醇血症C57和高胆固醇血症ApoE KO小鼠两性主动脉的形态学分析。（A） 显示钙沉积严重程度的典型显微照片（Von-Kossa染色；放大倍数：250倍）和en面ApoE KO小鼠（B）脂质沉积（Oil-Red-O染色）和（C）血管衰老（X-gal，pH6.0）的图像，主要在雄性，但在雄性或雌性C57小鼠中均不存在。
讨论
本研究描述了正常和高胆固醇血症老龄小鼠的功能和结构瓣膜和血管的性别变化。我们观察到，在正常胆固醇血症（C57）和高胆固醇血症（ApoE KO）小鼠中，男性是主动脉瓣返流进展的重要因素。除男性外，高胆固醇血症也有助于老年小鼠血管衰老的发生。相反，ApoE KO小鼠主动脉的外向（正向）重塑不受性别影响。
用于研究人类心血管疾病的诊断成像方法也已在大鼠身上使用[17]并且对小鼠有局限性[8,18]. 通过血管造影测量主动脉内径时，我们偶然观察到老年雄性小鼠主动脉瓣返流。与年龄相关的瓣膜改变和超声心动图参数仅在少数研究中描述[19-21]但没有研究性别对这些参数的影响。据我们所知，这项研究首次报道，与年龄匹配的雌性小鼠相比，老年雄性小鼠主动脉明显反流，与胆固醇水平无关。这一发现似乎并非由于雌二醇的保护作用，因为这一结果在去势女性中也得到了证实（数据未显示）。此外，我们必须考虑到，观察到的性别差异可能不仅仅反映了循环激素水平的差异[22].
主动脉瓣异常导致的主动脉瓣错接导致主动脉瓣返流[8]. 在我们的研究中，观察到的主动脉瓣返流与瓣膜厚度增加有关。在其他实验啮齿动物模型中也观察到了这一点[17,19,23]和人类[24]. 尽管主动脉瓣反流是一种慢性疾病，其特征是心脏容量超负荷，会导致进行性心脏肥大并最终导致收缩功能障碍[25,26]未观察到代偿性心肌肥厚和肺含水量。这一发现与人类研究结果一致，研究表明主动脉瓣返流在心力衰竭发生前几十年内通常无症状[17,27]. 研究还表明，由于对左心室射血的影响，瓣膜返流可能受到所用麻醉剂类型的影响[28,29]. 在本研究中，我们使用了氯胺酮和甲苯噻嗪混合物，这是在小鼠图像分析过程中最常用的麻醉剂[28,30]. 尽管有报道称，这种麻醉剂可以通过降低心率来影响主动脉瓣反流[19,23]在我们的研究中，男性和女性在导管插入术后具有相似的变时活动。
瓣膜病通常主要发生在左侧瓣膜，尤其是主动脉瓣，这可能是由于机械应力、尖部增厚、炎症和尖部柔韧性降低导致的反流[31]. 与上述研究一致，我们还观察到两组老年雄性小鼠的角膜缘增厚、胶原沉积、无细胞性和主动脉瓣返流。此外，性别和高胆固醇血症对瓣膜病变的影响仅在流行病学研究中有报道[6,32]. 我们的数据首次表明，男性和高胆固醇血症会导致瓣膜退行性变，而不会加重主动脉瓣返流。
在我们的研究中，血管造影还显示C57和ApoE KO组的主动脉内径保持不变。体外分析证实了这一发现，并显示主动脉向外重塑。大动脉的血管重塑被认为是两种临床观察到的适应性结构变化[33-35]和实验[7,34,36]针对各种情况的研究，如动脉粥样硬化、高血压和内腔梗阻。ApoE KO小鼠的主动脉重塑在幼年动物中未建立[7,37]但在13个月大时被检测到[38]. 在我们的研究中，我们观察到，与正常动物（C57）相比，18个月大的ApoE KO小鼠仍保留主动脉血管腔。因为过度补偿是人类冠状动脉重塑反应的一个特征[39]，我们建议，其他人也是[33,40]认为老年ApoE KO小鼠是研究晚期大动脉重塑机制的良好模型。
尽管ApoE KO小鼠的主动脉重塑在两性中相似，但血管衰老和脂质沉积受雄性影响。衰老细胞显示端粒进行性缩短[41]，阴性基因表达调节因子[42]，血管扩张剂表达减少[43,44]增加促炎分子[16]，有助于动脉粥样硬化的进展和血管老化的发病机制[45,46]. 在本研究中，我们通过β-半乳糖活性评估衰老，这被认为是目前可用的最佳标记之一。与其他研究一致[41,42]，我们观察到高胆固醇血症促进炎症和血管衰老。本研究的新颖之处在于发现男性和高胆固醇血症对血管衰老和血管脂质沉积具有附加作用。虽然雌激素似乎通过激活雌激素受体减缓衰老[22,47]卵巢切除不会导致C57雌性小鼠的血管衰老，也不会加剧ApoE KO雌性小鼠的衰老（数据未显示）。此外，卵巢切除并没有改变血浆胆固醇水平。基于其他发现[48]我们假设内源性和/或遗传因素可能对血管衰老的发展至关重要。
En脸主动脉图像显示，老年ApoE KO小鼠的脂质沉积和血管衰老主要分布在主动脉弓，这是一个湍流区。这一发现证实了其他人的假设[42,46,49]与动脉粥样硬化刺激相关的高内皮细胞转换位点可以促进端粒缩短，并可能诱导衰老。我们还可以预计，氧化应激和DNA损伤会导致血管衰老（或副血管），从而进一步促进动脉粥样硬化。
总之，正常胆固醇血症（C57）和高胆固醇血症（ApoE KO）老年小鼠均表现出主动脉瓣返流，但男性的比例高于女性。无主动脉瓣返流的女性比例显著，这为针对性别的保护机制提供了可能性。另一方面，在高胆固醇血症小鼠中观察到的血管外（正）重塑在性别之间没有差异。有趣的是，在老年小鼠中，只有血管脂质沉积和衰老受到高胆固醇血症和男性的影响，这突出了这一重要的自发性动脉粥样硬化模型中血管疾病进展的性别差异。虽然需要进一步研究来揭示这些发现的机制，但目前的数据在了解影响心血管疾病发展的性别方面取得了重大进展，以改进预防、诊断并对老年男女制定适当的干预措施。
作者的贡献
TMCP进行了动物实验、数据分析、统计并起草了手稿。BVN有助于血液采样和组织样本病理学。LCF和MLP有助于组织学和衰老分析。JAA参与了研究设计并监督了血管造影分析。ECV构思了研究设计并准备了手稿。SSM构思了这项研究，参与了其设计和监督，并对手稿进行了批判性修订。所有作者阅读并批准了最终手稿。
致谢
本研究得到了国家科学技术发展委员会（CNPq）、国家科学技术开发署（FAPES）和维多利亚市科学技术基金（FACITEC）的支持。我们感谢卡西亚诺·安东尼奥·德莫雷斯大学医院（HUCAM）、洲际医学院、维丘病理实验室和马科斯·丹尼尔实验室使用他们的设施。
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