内源性HMGB1调节自噬

HMGB1易位和增强自噬需要活性氧（ROS）依赖信号

活性氧是信号分子，在调节细胞存活和死亡的几种途径中起重要作用。事实上，许多诱导活性氧生成的刺激，如营养饥饿、线粒体毒素和缺氧，也会诱导自噬(图S2)。线粒体中ROS的形成是促进自噬的基本调节事件(Scherz-Shouval和Elazar，2007年)。内源性活性氧的主要来源是线粒体电子传递链（mETC；Scherz-Shouval和Elazar，2007年).

为了评估自噬过程中线粒体ROS生成与HMGB1易位之间的关系，我们用几种不同的mETC抑制剂处理细胞。鱼藤酮（Rot；复合物I抑制剂）、亚甲酰三氟丙酮（复合物II抑制剂）和抗霉素A（复合物III抑制剂）增加ROS生成、LC3点和LC3-II表达(图1、E和F)。通过亚细胞组分的成像细胞术和Western blot检测，这些mETC抑制剂还诱导HMGB1从细胞核转移到胞浆(图1、E和F)。在生理条件下，活性氧通过超氧化物歧化酶（SOD）家族成员、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶的作用从细胞中清除(Scherz-Shouval和Elazar，2007年)。正如预期的那样，SOD1和SOD2的敲低增加了饥饿和雷帕霉素诱导的Panc2.03细胞自噬和HMGB1易位(图1、G和H; 和图S3)。此外，N个-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种活性氧猝灭剂，其剂量依赖性抑制饥饿和雷帕霉素诱导的自噬和HMGB1易位(图1、G和H; 和图S3）。此外，饥饿和雷帕霉素增加了ROS/线粒体超氧化物水平，降低了SOD活性，但不影响过氧化氢酶活性或检测到的水平（图S2）。总之，这些结果与ROS信号是HMGB1易位和持续自噬所必需的概念一致。

HMGB1的缺乏限制了自噬

为了评估HMGB1在自噬中的作用，我们首先评估了野生型和HMGB1的自噬通量^−/−MEF公司。嗯1^−/−MEF在几种自噬刺激（包括H₂O（运行）₂雷帕霉素和饥饿(图2，A–C)。溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素或E64D治疗(水岛和吉森，2007年)诱导野生型中LC3-GFP点和LC3-II的表达进一步增加，但Hmgb1没有^−/−，机械工程师(图2 C)。类似地，敲低HCT116和Panc2.03细胞中的HMGB1也降低了LC3点的积累和LC3-II的表达(图S4)。此外，HMGB1在HMGB1中的表达上调^−/−基因转染后的MEF恢复了LC3点的形成(图2 D)。抑制自噬导致p62小体的大小和数量以及p62蛋白水平的增加(Bjørkøy等人，2005年)。HMGB1的缺失增加了p62小体的大小和数量以及p62蛋白质水平(图2 E)表明其降解依赖于HMGB1介导的自噬。超微结构分析表明Hmgb1^−/−与野生型MEF相比，MEF表现出更少的I型自噬体和II型自溶体(图2 F)。这些结果表明HMGB1确实是调节自噬的重要因素。

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图2。

HMGB1的耗尽抑制自噬。（A） HMGB1基因敲除抑制LC3突起的形成。HMGB1标准^−/−和HMGB1^+/+如图所示，用自噬刺激处理MEF，并用LC3抗体或GFP-LC3检测LC3穿孔形成，如材料和方法所述。*，P<0.05；**，P<0.005；和***，P<0.0005与Hmgb1^+/+组；n个= 3. UT，未经处理。（B） Hmgb1中LC3穿孔的代表图像^−/−和HMGB1^+/+描述了具有指定处理的MEF。A中报告了显示LC3点蓄积的细胞百分比。（C）在有或无溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素A（pepA）和E64D（10µg/ml）的情况下，饥饿处理3小时后，通过自噬分析LC3处理。**，与Hmgb1相比，P<0.05^+/+组；n个= 3. 肌动蛋白被用作加载控制。AU，任意单位。（D） HMGB1蛋白表达上调可恢复饥饿诱导的自噬。嗯1^−/−用HMGB1质粒或空载体转染MEF，然后饥饿处理3 h。通过成像细胞术分析检测LC3点形成。**，与载体组相比P<0.05；n个= 3. 无，未转染。（E） 饥饿处理3小时后，在溶酶体蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制素A（10µg/ml）和E64D（10μg/ml）存在或不存在的情况下，通过自噬分析p62处理**，P<0.005和***，P<0.0005与Hmgb1^+/+组；n个= 3. 代表性图像如图所示（左图）。（F） Hmgb1的超微结构特征^−/−和Hmgb1^+/+有或无饥饿（HBSS 3小时）治疗的MEF（a–e指自噬体和自溶体）。数据为平均值±SEM。

在正常条件下，HMGB1蛋白的5-10%位于胞浆中，具体数量取决于细胞类型(图1 A和图3 A)。此外，自噬刺激促进HMGB1向胞浆的移位(图1 A和图3 A)。为了评估HMGB1在自噬形成中的作用，我们创建了细胞质（无核细胞）。为了应对饥饿（HBSS），Hmgb1^+/+MEF细胞质仍能积聚LC3点(图3，A和B;Tasdemir等人，2008年)。相反，Hmgb1^−/−MEF细胞质中LC3点状细胞的水平低于HMGB1^+/+(图3，A和B)表明饥饿刺激的自噬需要细胞质HMGB1。

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图3。

细胞质HMGB1对自噬的抑制作用。嗯1^−/−和Hmgb1^+/+如材料和方法中所述，细胞松弛素B处理后，通过离心法将MEF剜除，然后用HBSS处理3h，并用共焦显微镜检测LC3点形成。（A） HMGB1细胞质中LC3点（白色箭头）和HMGB1（红色箭头）的代表性图像^−/−和Hmgb1^+/+描述了MEF。（B） 报告显示LC3点状细胞积聚的细胞百分比（*，P<0.05；n个= 3). 数据为平均值±SEM。

饥饿和雷帕霉素治疗都会增强某些细胞系的自噬并诱导凋亡(Maiuri等人，2007年)。因此，我们评估了HMGB1与这些条件下细胞凋亡的关系。Hmgb1中观察到细胞凋亡增加^−/−与野生型细胞相比，MEF通过使用膜联蛋白V染色的流式细胞术，通过发现增加的裂解聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和增加的caspase-3活化(图S5)。总的来说，这些数据表明HMGB1在促进自噬和限制凋亡方面起着重要作用。

HMGB1的耗尽促进持续的Beclin1–Bcl-2相互作用

在自噬过程中观察到的一个重要分子事件是Bcl-2–Beclin1复合物的解离(Pattingre等人，2005年)。抗凋亡蛋白Bcl-2家族调节Beclin1依赖性自噬(Pattingre等人，2005年)。因此，我们确定了HMGB1对Bcl-2和Beclin1之间相互作用的影响。MAPK激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）抑制剂PD98059和U0126抑制饥饿诱导的ERK磷酸化（p-ERK1/2）和Bcl-2(图4 A)。此外，HMGB1的敲除以及MEK/ERK抑制剂U0126的加入，在增强自噬的情况下阻断了Bcl-2–Beclin1的解离(图4、B和F)表明ERK1/2介导的Bcl-2磷酸化调节饥饿诱导的自噬。在MEFs、HCT116和Panc02细胞中，内源性HMGB1通过共免疫沉淀（IP[co-IP]）检测显示与Beclin1相互作用(图4、B、C和E)。敲除Beclin1抑制了未经处理的HMGB1野生型MEF中Bcl-2和HMGB1之间的相互作用(图4、B和D)表明HMGB1与Bcl-2的相互作用直接依赖于Beclin1。因此，通过与Beclin1结合并调节饥饿后细胞中Bcl-2的磷酸化，内源性HMGB1抑制Beclin1-Bcl-2之间的相互作用。

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图4。

HMGB1的缺失维持了Beclin1–Bcl-2的相互作用。（A） MEK抑制剂阻断饥饿诱导的p-ERK和Bcl-2。HMGB1标准^−/−和HMGB1^+/+在存在或不存在10µM U0126和20µM PD98059的情况下，将MEF饥饿6小时。通过co-IP或Western blotting评估蛋白质表达水平。（B） HMGB1的敲除限制了自噬刺激治疗过程中Bcl-2–Beclin1复合物的解离。HMGB1标准^−/−和HMGB1^+/+将MEF在有或无10µM U0126的条件下饥饿3 h。然后按照co-IP或Western blotting的指示分析蛋白质表达水平。（C） HMGB1在自噬过程中与Beclin1直接相互作用。用HBSS处理HCT116和Panc02细胞3 h，然后通过co-IP或Western blotting检测蛋白表达水平。（D） HMGB1与Bcl-2的直接相互作用依赖于Beclin1。在HMGB1野生型MEF中通过siRNA敲除Beclin1和Bcl-2，然后通过co-IP或Western blotting检测蛋白表达水平。Ctrl，control。（E和F）定量数据，证明HMGB1–Beclin1和Beclin1-HMGB1之间的相互作用，使用密度测定软件分析co-IP实验中的相对蛋白质带强度，如A–D所示**，P<0.005和***，P<0.0005；n个= 3. UT，未经处理。数据为平均值±SEM。

细胞培养

Panc2.03、Panc02、HCT116和Hmgb1^−/−和Hmgb1^+/+永生化MEF(Scaffidi等人，2002年)细胞在RPMI 1640、DME或McCoy’s 5a培养基中培养，该培养基补充有10%热灭活的FBS、2 mM谷氨酰胺和抗生素-抗真菌混合物（10000单位/ml青霉素和10000µg/ml链霉素；Invitrogen），在含5%CO的湿润培养箱中培养₂.

基因转染与RNAi

HMGB1-GFP或突变型（C23S、C45S或C106S；Hoppe等人，2006年)或pUNO1-HMGB1（InvivoGen）表达载体根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）转染到细胞中。结构物在匹兹堡大学核心测序实验室进行测序和确认。使用Lipofectamine RNAiMAX试剂（用于siRNA）或Lipofettamine 2000试剂（用于shRNA）将人SOD1/SOD2-siRNA、小鼠Beclin1–Bcl-2 siRNA（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、小鼠Beclin1短发夹RNA（shRNA）、人HMGB1 shRNA和小鼠ATG5 shRNA（Sigma-Aldrich）转染到细胞中根据制造商的说明（Invitrogen）。在基因转染和RNAi 48小时后，在随后的治疗之前改变细胞上的培养基。

蛋白质印迹

如前所述，在4–12%标准XT双三凝胶（Bio-Rad实验室）上溶解全细胞裂解物，并转移至硝化纤维素膜(Tang等人，2007b)。封闭后，将膜在25°C下培养2小时，或在4°C下与各种初级抗体培养过夜。在25°C下与过氧化物酶结合二级抗体孵育1小时后，根据制造商的说明，通过增强化学发光（赛默飞世尔科学公司）对信号进行可视化。使用凝胶电泳分析仪软件（媒体控制论）量化相对带强度。

细胞内活性氧和线粒体超氧化物的测定

细胞接种在96周的培养板中，并在给定的刺激下培养指定的时间。如前所述，ROS用细胞渗透染料CM-H2DCFDA（Invitrogen）和线粒体超氧化物（MitoSox）进行评估(Kang等人，2010b)。使用荧光板阅读器进行信号强度分析。

IP分析

细胞在4°C的冰镇放射免疫沉淀分析裂解缓冲液（Millipore）中进行裂解，细胞裂解物在12000时通过短暂离心10分钟进行清除克上清液中的蛋白质浓度通过双钦酸测定法测定。在IP之前，将含有等量蛋白质的样品在4°C下用蛋白质A或蛋白质G琼脂糖/琼脂糖预先洗脱3小时，然后用2-5µG/ml各种无关的IgG或特定抗体在蛋白质A或G琼脂酶/琼脂酶珠存在的情况下孵育2小时或在4°C下轻轻摇晃过夜(Tang等人，2007a，b条)。孵育后，用PBS对琼脂糖/琼脂糖珠进行广泛清洗，在SDS-PAGE电泳前，在2×SDS样品缓冲液中煮沸洗脱蛋白质。作为对照，用50mM DTT处理一部分裂解物以减少样品，如前所述(Anathy等人，2009年).

HMGB1易位和LC3点形成的图像细胞术分析

将细胞接种在96周的平板中，在各种刺激下培养一定时间，然后用3%多聚甲醛固定，并用HMGB1或LC3抗体染色。二级抗体是与Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 647荧光色素结合的山羊IgG。用荧光染料Hoechst 33342（Sigma-Aldrich）观察细胞核形态。使用成像细胞仪（ArrayScan HCS 4.0；Cellomics）在25°C下以20倍物镜收集成像数据。ArrayScan是一种自动荧光成像显微镜，用于收集放置在96 well微量滴定板中的细胞中荧光标记成分的空间分布信息。优化后，使用斑点探测器BioApplication（Thermo Fisher Scientific）采集和分析图像。分析每个处理组500-1000个细胞的图像，以获得每个细胞的平均核和胞浆HMGB1强度和LC3荧光点数量(Tang等人，2009年).

自噬分析

如前所述，通过成像细胞术进行内源性LC3点的所有分析(Kang等人，2010a)。通过细胞系中GFP-LC3（X.-M.Yin的礼物，匹兹堡大学，宾夕法尼亚州）聚集的瞬时表达进一步监测自噬囊泡的形成。通过从三个单独的实验中随机选择的100个细胞中计算阳性染色细胞的数量来确定GFP-LC3点状细胞的百分比。根据建议，在存在或不存在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64d/胃蛋白酶抑制素A）的情况下，通过Western blotting对饥饿后LC3-I/II的形成进行自噬通量测定(水岛和吉森，2007年).

对p62进行共焦显微镜分析，并对LAMP2/LC3进行共定位。使用激光扫描共焦显微镜（Fluoview FV-1000；Olympus），使用60x Plan Apo/1.45油浸物镜在25°C下采集图像，并使用Fluovie软件（FV10-ASW 1.6；Olympus）进行捕获和分析。随后通过Image-Pro Plus 5.1软件（媒体控制论）对图像进行水平和共定位分析。

如前所述，对自噬体和自噬溶酶体进行透射电镜评估(邵等人，2004)。简而言之，用2%多聚甲醛和2%戊二醛将细胞固定在pH为7.4的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中，然后在1%O中固定6 h_秒O（运行）₄用分级醇脱水后，将样品包埋在环氧树脂（epon）中。然后，用切片机（Ultracut R；Leica）切割薄片（70 nm），将其安装在铜网格上，用2%醋酸铀酰和1%柠檬酸铅进行后染色，干燥，并在25°C下使用透射电子显微镜进行分析（100CX；JEOL，Inc.）。厚切片切割（300 nm）并用1%甲苯胺蓝染色。在每种条件下，从随机选择的10-15个字段中采集数字图像。

细胞凋亡分析

使用FITC-Annexin V细胞凋亡检测试剂盒（BD；膜联蛋白V-FITC，碘化丙啶（PI）溶液和膜联蛋白V结合缓冲液）评估细胞凋亡。该试验包括用膜联蛋白V–FITC（一种与破坏的细胞膜结合的磷脂结合蛋白）和PI（一种能与穿透凋亡细胞的DNA结合的重要染料）对细胞进行染色。流式细胞仪分析（FACS）用于测定凋亡细胞的百分比（膜联蛋白V⁺/PI公司^负极)。用Western blotting分析测定裂解的PARP和裂解的caspase-3。

离心去核

HMGB1标准^−/−和HMGB1^+/+如前所述，在胶原蛋白涂层的微型套圈上生长的MEF被去核，只需稍作修改(Goldman等人，1973年;Miller和Ruddle，1974年)。为了将细胞剜除，将小盖片倒置（细胞侧朝下），放置在含有10µg/ml细胞松弛素B（Sigma-Aldrich）的1.5-ml Eppendorf试管的底部。在12000离心后克在60分钟内，从试管中取出小盖片，将细胞侧朝上放置在含有2 ml不含细胞松弛素B的培养基的6孔板中，用于随后的研究和自噬染色。

统计分析

数据表示为一式三份的三个独立实验的平均值±SEM。采用SPSS 12.0进行组间比较，采用单因素方差分析。当方差分析显著时，使用Fisher最小显著性差异检验对组间差异进行事后检验。p值<0.05被认为是显著的；在适用的情况下，报告了P<0.005和P<0.0005。

我们非常感谢与匹兹堡大学的蒂莫西·比利亚（Timothy Billiar）和莎拉·伯曼（Sarah Berman）以及外部同事吉多·克罗默（Guido Kroemer）、道格拉斯·格林（Douglas Green）、马修·阿尔伯特（Matthew Albert）、伊娃·谢格兹迪（Eva Szegezdi）和贝斯·莱文（Beth Levine）。我们还感谢审查人员提出的建设性建议。

该项目由国家卫生研究院（国家癌症研究所向M.T.Lotze提供的将NK和DC纳入癌症治疗拨款[1 P01 CA 101944-04]）和意大利癌症协会（M.E.Bianchi）的拨款资助。