结果
间充质FGF10介导的旁分泌信号足以使邻近前列腺上皮发生组织学转化
逆转录病毒构建物旨在表达GFP或FGF10和GFP(补充图1A). UGSM感染了控制载体（GFP）或FGF10-GFP逆转录病毒。western blot证实分泌型FGF10的表达(补充图1B). FACS分析证实UGSM细胞感染率超过90%(补充图1C).
分离的成年小鼠前列腺细胞（1×105)与UGSM细胞结合（1×105)感染对照或FGF10表达载体并植入CB.17肾包膜下SCID/SCID老鼠(Xin等人，2003年). 8周后，处死小鼠，从肾脏上切下移植物(). 表达FGF10的移植物重量是对照移植物的两倍以上().
旁分泌FGF10的表达导致分化良好的腺癌和管腔和基底细胞的扩张。
答：野生型上皮再生组织的透照图像和重量（平均值±SD）（1×105)结合表达GFP或FGF10的间质（1×105)置于再生状态。
B类：FGF10 UGSM和GFP UGSM再生组织的H&E分析。
抄送：高倍（1000倍）放大FGF10诱导的腺癌，在a中显示非典型（箭头）、大细胞核（箭头和星号），在b中显示有丝分裂像（箭头）。
医生：使用抗E-cadherin、CK 5和P63抗体对再生组织进行免疫组织化学分析。
对照移植物的组织学分析显示上皮腺体两层厚，管腔分泌物丰富(). 相比之下，FGF10移植物显示出数量增加的小腺体结构，一层细胞厚，含有核质比增加的细胞，显著的多核仁，分散的凋亡小体，偶尔有丝分裂像(). 这些特征可诊断10/10独立旁分泌FGF10再生移植物中的高分化前列腺癌() (Shappell等人，2004年). 市售FGF10抗体无法通过免疫组织化学检测到该蛋白。因此，在FGF10表达结构中，由内部核糖体进入位点（IRES）忠实表达的GFP定位于再生移植物的间充质室(补充图1D). GFP的表达为间充质FGF10的过度表达提供了间接标记(补充图1D). 用全细胞角蛋白染色勾勒出上皮细胞的轮廓(补充图1D). western blot分析证实在三个独立的FGF10再生移植物中FGF10的表达增强(补充图1E).
为了表征扩张的上皮细胞群，对上皮标记物细胞角蛋白5（CK5）、CK8、p63和E-cadherin进行免疫组化(和补充图2). FGF10移植物的腺体表达E-钙粘蛋白(和细胞角蛋白8(补充图2A)证实了这些细胞的上皮性质。在表达FGF10的移植物中，我们检测到p63阳性细胞大约膨胀了三倍(，底部面板）。我们还观察到，与对照组相比，FGF10移植物的管腔细胞显著扩张(补充图2A). 旁分泌FGF10信号转导导致前列腺增生背景下腺癌的形成。以前的前列腺癌模型导致了内腔或神经内分泌癌的形成(Freeman等人，2003年;Greenberg等人，1995年;Majumder等人，2003年;Wang等人，2003年). 在我们的模型中，我们观察到表达CK8的管腔细胞的扩增()除了表达CK5/P63的基底细胞扩张外(补充图2B和底部面板）。
旁分泌FGF10信号转导促进类似人类PIN或前列腺癌的多灶前列腺癌的形成，并发挥其区域特异性作用。
答：两个相邻移植物的示意图，其中一个带有FGF10 UGSM（1×105)第二次移植正常UGSM（1×105)两者均与WT上皮结合。
B类：两个相邻移植物的组织学显示，一侧前列腺小管正常，另一侧分化良好的前列腺癌，提示旁分泌FGF10的局部作用。
抄送：FGF10 UGSM数量对数减少后再生组织的H&E分析显示有多灶癌的证据。a&b为癌，c&d为微侵袭癌旁PIN，e&f为多灶PIN，g&h为主要正常组织学。
医生：抗GFP染色间接检测增生区FGF10的表达。
旁分泌FGF10促进前列腺再生系统的局部转化
我们询问FGF10的转化作用是局部的还是超出了FGF10分泌细胞的来源。我们将一个FGF10分泌UGSM的移植物与另一个正常UGSM细胞移植物相邻(). 然后，我们建立了一系列FGF10分泌细胞的稀释序列，以便通过替换正常的UGSM以对数方式减少FGF10的分泌UGSM的数量(). 为了测量6周时再生上皮的增殖，小鼠腹腔注射溴脱氧尿苷（Brdu）（80 mg/kg），两小时后处死。采集移植物并用Brdu抗体染色(和补充图3). 在两个相邻移植物两端以及中间部分的四个独立的高倍视野中对Brdu标记的上皮细胞进行计数和平均。
将分泌FGF10的移植物放置在正常移植物附近时，发现两个明显不同的组织学区域(). 具有正常UGSM的移植物的一端显示正常的前列腺小管，而具有分泌FGF10的间充质的移植物的另一端显示分化良好的腺癌(). FGF10导致增殖上皮细胞数量的局部增加，如含FGF10区域上皮细胞对Brdu的摄取增加所示(补充图3). 与移植物癌侧相比，对照侧的Brdu摄取量减少了5倍，表明FGF10的作用是局部的(补充图3).
分泌UGSM的FGF10数量减少导致较轻的表型，表明旁分泌FGF10的转化作用是剂量依赖性的(). 在存在50%FGF10的情况下，观察到UGSM腺癌，而在FGF10稀释的移植物中观察到与可能的微创癌（1:10）和PIN（1:100）相邻的PIN进展，当分泌FGF10间充质细胞被稀释1000倍时，达到正常前列腺上皮。在1:10和1:100稀释的样本中，微小侵袭性腺癌和增生性小管出现在PIN病变和正常前列腺附近。这种疾病模式类似于人类前列腺癌和PIN的异质组织学表现(). 为了检测分泌FGF10的UGSM细胞的位置，在1:10和1:100稀释标本中检测GFP的表达作为FGF10间接标记(). 我们观察到在微侵袭性癌和PIN病灶附近存在GFP阳性的UGSM细胞，从而分泌FGF10(). 正常再生小管附近无GFP表达().
我们的数据表明，局部PIN和多灶腺癌可以通过改变邻近的癌基质细胞来重演，类似于FGF10过度表达间充质的旁分泌作用。
DN FGFR1抑制FGFR1信号转导逆转FGF10诱导的腺癌
我们假设，即使存在过量的间充质FGF10，阻断FGFR1和/或FGFR2信号也会导致正常小管的形成。为了验证我们的假设，我们构建了慢病毒载体来表达DN FGFR1和DN FGFR2，并在western blot上标记了更好的检测标志() (Li等人，1994年). DN FGFR1和DN FGFR2构建物编码跨膜结构域下游截断的蛋白质，并发出缺陷信号(Li等人，1994年). 慢病毒构建物表达红色荧光蛋白（RFP）以标记DN FGFR的表达部位。将分离的前列腺上皮细胞感染载体对照、DN FGFR1或DN FGFR2，并与等量的FGF10和WT UGSM结合，移植6-8周。
FGF10主要通过激活FGFR1诱导前列腺癌。
答：。用于表达标记DN FGFR1和DN FGF R2的慢病毒FUCRW载体。Western blot证实了两种显性阴性结构的表达。
B类：对照载体RFP、DN FGFR1-RFP或DN FGFR2-RFP再生的移植物重量（平均值±SD）与FGF10（5×104)添加到WT（5×104)无人值守地面传感器。
抄送：用载体控制RFP、DN FGFR1-RFP或DN FGFR2-RFP再生移植物的免疫荧光分析。与RFP或DN FGFR2-RFP再生腺体相比，DN FGFR1-RFP感染的小管显示细胞完全局限在简单的腺体和小管结构内，提示前列腺上皮正常。
与载体对照相比，任一DN构建体的表达导致形成更小的移植物(). 对再生的移植物进行荧光显微镜检查。与病媒对照组相比，由DN FGFR1或DN FGFR2组成的红小管的频率显著降低。我们回顾了再生组织的多个切片，以确定含有DN FGFR1或DN FGFR2的移植物中相对罕见的红小管。DN再生组织中红小管的大小减少和稀少可以用再生上皮中慢病毒DN结构的拷贝数和整合频率的变化来解释。在单个前列腺上皮细胞中高剂量的任何一种DN结构都可以抑制前列腺小管的再生，并且显微镜无法观察到慢病毒载体的低拷贝数。因此，本实验中收集的组织学数据是关于表达DN结构中间拷贝数的细胞组，通过RFP的表达进行可视化。
表达DN FGFR1的再生红细胞主要局限于类似正常前列腺上皮腺体的简单腺体和管状结构中(). 这些观察结果在四个独立的实验中得到了证实。大多数对照组RFP或DN FGFR2红细胞局限于可清楚识别的腺体和管状结构内，这些结构显示簇状并延伸至腺腔，提示上皮增生和/或PIN(). 在某些地区，与对照RFP组织相比，DN FGFR2再生腺体中发现的丛生和超细胞程度较少。这一发现表明，DN FGFR2表达产生了部分阻断效应，这可能是由于与FGFR1的非特异异构化所致(Dailey等人，2005年).
定量PCR分析表明，FGFR1的所有其他主要结合伙伴的表达水平(Zhang等人，2006年)除FGF7（FGF10的同源物）外，未发生显著改变(补充图4中的表2)比较WT和FGF10 UGSM时。这些发现排除了FGF10诱导FGF电路的可能性。
这些数据表明间充质FGF10主要通过上皮性FGFR1发挥作用，并验证了先前的数据，表明FGFR1的激活在前列腺上皮的肿瘤转化中起着重要作用(Freeman等人，2003年). 我们的数据还表明，即使在高FGF10微环境中，前列腺上皮中FGFR1信号的抑制也会逆转肿瘤表型。
旁分泌间充质FGF10增强导致上皮雄激素受体增加
多个在体外但没有体内研究表明，成纤维细胞生长因子肽过度表达或激活雄激素受体（AR）。体外研究表明，在没有雄激素的情况下，生长因子如KGF可以刺激AR的信使RNA水平(Planz等人，2001年). IGF-I、EGF和KGF可以在没有雄激素的情况下激活AR，这表明这些生长因子可以直接激活雄激素信号通路(Culig等人，1994年).
为了检测旁分泌FGF10对我们模型中AR表达的影响，对再生移植物获得的蛋白裂解物进行了western blot分析。当比较FGF10和控制再生移植物时，密度测定显示AR大约增加了四倍().
旁分泌FGF10导致上皮AR增加
答：Western blot显示，与对照再生移植物相比，FGF10中AR蛋白的表达增加了四倍。
B类：免疫组织化学证实，与对照再生组织相比，旁分泌FGF10诱导腺上皮AR增加。
免疫组织化学定位AR的表达。我们确定FGF10移植物中的大多数上皮细胞强烈表达核AR(). AR染色的相对强度显示，与对照组相比，FGF10再生移植物的腺上皮中AR蛋白表达水平较高().
与其他类固醇激素类似，AR会经历翻译后修饰，最终导致该受体的稳定性和活性增加(Faus和Haendler，2006年). 通过生长因子受体进行信号传递是实现翻译后修饰的一种机制(Reddy等人，2006年). 定量PCR显示，与对照再生上皮相比，从暴露于旁分泌FGF10的上皮获得的AR的mRNA水平没有显著改变（数据未显示）。这些结果表明，FGF10诱导的上皮AR增加可能在翻译后水平上介导。
旁分泌FGF10促进癌细胞雄激素非依赖性生存和增殖
通过生长因子受体的信号传递可以通过AR的扩增、现有AR激活的增加、共激活物/共阻遏物的调节以及稳定AR的翻译后修饰来促进前列腺癌细胞的雄激素非依赖性生长(费尔德曼和费尔德曼，2001年).
为了评估FGF10诱导的腺癌在雄激素戒断后是否存活，对携带由FGF10或对照间充质组成的移植物的动物进行阉割并随访6周。去势动物FGF10移植物的组织学分析显示高分化前列腺癌持续存在(). 相反，在WT间充质再生组织中，许多上皮细胞丢失，腺体结构残留、耗尽(). 我们的结果表明，FGF10诱导的前列腺癌细胞具有存活机制，能够在去势雄激素水平下增殖和存活。
旁分泌FGF10促进前列腺癌亚群雄激素非依赖性生存
答：FGF10和WT间充质再生移植物的组织学研究，取自去势动物。与正常WT再生移植物相反，在所有五个FGF10再生标本中均发现腺癌持续存在。
B类：AR在完整和去势动物FGF10移植物中的免疫组织化学定位。与完整移植物（a和b）相比，去势导致去势（c和d）中AR的部分细胞质转运。尽管FGF10再生组织（c&d）去势，AR的部分核定位仍然存在。
抄送：完整动物和去势动物移植物重量的比较分析（平均值±SD）。
采用免疫组织化学方法比较AR在完整和去势FGF10移植物中的定位和表达(). 完整FGF10移植物的腺体组织表达高水平的核AR(). 去势导致FGF10再生组织中AR的部分细胞质易位(). 然而，AR的部分核定位持续存在于大多数FGF10腺上皮中，并且有一些病灶继续具有AR的强核表达().
为了评估雄激素停药对FGF10再生组织增殖和凋亡的急性和慢性影响，对携带FGF10间充质移植物的动物进行去势，并在1周和6周时采集移植物。去势移植物的大小是6周时从完整动物身上采集的移植物的一半(). 我们分别使用Ki67免疫组织化学和TUNEL分析来量化去势后6周的增殖指数和1周的凋亡率(补充图5A和B). 我们统计并平均了五个高倍显微镜视野中Ki67或TUNEL阳性上皮细胞。用Ki67阳性细胞的百分比测量增殖减少（完整细胞为8%，去势细胞为4%），但没有达到统计显著性，去势后用TUNEL阳性细胞的百分率测量凋亡显著增加（完整细胞0.8%，去势为1.6%）(补充图5A和B).
去势后移植物尺寸减小、凋亡增加和增殖减少表明FGF10诱导的腺癌的一部分仍然依赖雄激素。剩余FGF10诱导的前列腺癌细胞和Ki67染色的持续存在表明，旁分泌FGF10信号可以促进这些细胞在去势雄激素水平下的存活和增殖。旁分泌FGF10诱导的AR急剧增加以及随后对雄激素残留去势水平的超敏反应可能是去势后存活癌细胞使用的一种生存策略。旁分泌FGF10对AR的雄激素非依赖性激活可能是导致FGF10诱导的腺癌亚群雄激素非依赖性生存的另一种机制。
FGF10诱导的PIN或腺癌的一个子集可连续移植
虽然通过致癌途径的慢性信号传导对于维持某些恶性肿瘤的转化至关重要，但细胞自主性改变足以在其他癌症模型中绕过这种持续依赖性(温斯坦，2002). 我们评估了暴露于FGF10的上皮细胞的转化是否会逃避或仍然依赖于这种生长因子的慢性旁分泌信号传导，并询问FGF10诱导的腺癌是否可以连续移植。将来自DS红色转基因动物的前列腺上皮与FGF10-GFP-UGSM重组并置于再生系统中。利用DS红色转基因动物表达红色荧光蛋白变体DS红色，为上皮细胞提供荧光标记。在再生8周后收获移植物，切碎，并消化成单个细胞。
FGF10-UGSM细胞稀释1000倍将导致再生系统中正常小管的形成(). DS红色游离单细胞（2×104)从FGF10中获得的再生移植物与WT上皮结合（2×104)WT间充质过多，表达FGF10的间充质细胞的数量将被稀释1000倍。这些细胞作为继发肿瘤植入。再生8周后，组织学分析显示，WT上皮靠近增生性细胞病灶的区域，具有均匀的上皮簇集、拥挤和核异型性(补充图6A，a-c). 免疫荧光显微镜显示WT和红小管形成双层大小管，结构正常，毗邻红色腺体簇，腺体簇内充满多层簇状上皮细胞，令人想起PIN(补充图6A，d-f). 这一观察结果表明，FGF10诱导的PIN可以在FGF10低微环境中持续存在。
从FGF10再生移植物中获得的DS红色游离单细胞经过FACS分类（R1），确保排除GFP阳性细胞的单细胞或双细胞（R2+R3）(). DS红色分选细胞（3×104)与WT上皮（7×10）重组4)作为辅助细胞，或与WT UGSM细胞（105)作为再生系统中的继发肿瘤。添加辅助细胞的移植物的组织学分析显示，除了显示细胞簇集、拥挤和少数病灶的区域外，还有多个正常小管，这些区域具有密集的微腺体结构，其中包含具有非典型核特征和较高核质比的细胞(). 对再生组织的免疫荧光显微镜评估显示，形成了一些类似正常腺体的双层大红色小管()，除其他区域显示小簇红小管外，让人想起高分化腺癌().
FGF10诱导的腺癌系列移植
答：再生小管移植实验和组织学示意图。
B类：再生组织的免疫荧光分析显示，许多WT和一些红色上皮腺体形成，具有类似正常小管（a和b）的单细胞层，以及与正常WT腺体相邻的多个小红色小管，使人联想到分化良好的腺癌（c和d）。
抄送：移植组织标本的组织学评估显示存在腺癌（a&e），表达FGF10的基质细胞无污染，表现为缺乏GFP染色（b&f）。撤回逆转录病毒感染的FGF10 UGSM细胞（c&d，g&h）后，癌再生组织显示出强烈的磷酸酪氨酸活化。
医生：在移植的再生移植物的癌区中观察到AR的持续强核定位（a和b）。
我们的研究结果表明，接触旁分泌FGF10 8周可能会诱导一部分上皮细胞持续形成异常的上皮结构，从增生到分化良好的腺癌，即使在这种生长因子水平较低的情况下也是如此。为了测试FGF10诱导的腺癌是否可以连续移植，我们将二级移植物分离成单个细胞，然后将其重新移植到三级移植物中(补充图6B). 在这些三级移植物中，与原发性和继发性肿瘤类似，我们观察到从上皮增生到高分化腺癌的异常上皮结构，这表明FGF10诱导的PIN/腺癌的一个子集是可连续移植的(补充图6B). 移植的二级和三级肿瘤的增殖率与原发性FGF10移植物相似，并且显著高于Ki67染色评估和量化的正常再生组织(补充图7).
为了确定可解释这种持续致癌表型的可能机制，在低水平FGF10中，对移植的DS红色再生组织（无辅助细胞）在二级和三级肿瘤中的磷酸酪氨酸活化进行评估。用泛磷酸酪氨酸抗体对移植组织进行免疫组织化学分析，发现癌再生腺体中有强烈的磷酸酪氨酸激活(和补充图8B). 在这些组织学标本中，GFP染色的缺失进一步证实了外源性生长因子表达的UGSM细胞被排除在外(). 在评估磷酸酪氨酸活性时，使用正常UGSM的再生组织作为阴性对照，使用FGF10 UGSM癌组织作为阳性对照(补充图8B). 在第二和第三次移植的再生组织中观察到AR的持续核定位，表明AR机制持续激活(和补充图8A).
间充质FGF10与细胞自主AKT的协同作用导致高度恶性肿瘤
我们试图评估在幼稚前列腺上皮细胞中结合两种事件的生物学后果，即通过间充质FGF10的“Outside-in”信号和激活AKT的细胞自主表达。我们之前已经证明，慢性活化的上皮性AKT可以导致PIN的形成，而上皮性AKT-AR的结合将导致癌的形成(Xin等人，2006年). 在这个模型中，旁分泌FGF10信号导致上皮AR增加。我们询问旁分泌FGF1信号是否可以与细胞自主激活的AKT协同作用。
用控制载体或激活的AKT感染前列腺单个细胞，并与表达UGSM或载体控制UGSM的FGF 10结合，放置在再生系统中。七周后收获移植物，称重()并对组织学进行了评估(). 与单独使用上皮AKT的移植物相比，向间充质FGF10中添加上皮AKT使移植物的尺寸增加了一倍多(). AKT和FGF10联合使用产生的移植物重量是单独使用FGF10时移植物重量的6倍(). 对三分之三再生移植物的组织学分析显示，存在间充质FGF10和上皮性AKT的低分化腺癌区域，由几乎完全失去腺体结构的非典型细胞构成(,补充图9). 间充质FGF10导致高分化腺癌的发生()上皮AKT单独导致PIN，PIN由上皮细胞分层定义，细胞核非典型性局限于腺结构内(). 利用免疫组织化学证实上皮细胞磷酸化AKT的表达(). GFP的免疫组织化学检测证实了FGF10-GFP或GFP的基质表达(). 我们的数据显示了旁分泌FGF10信号和细胞自主AKT之间的协同作用，暗示了基质和上皮扰动在恶性转化中的协同作用的重要性。
间充质FGF10与细胞自主AKT协同作用，导致进展性癌症表型和上皮AR显著增加
答：WT上皮与FGF10 UGSM、AKT上皮与WT UGSM和AKT上皮之间移植物的透照图像和相对重量（平均值±SD）。
B类：用FGF10 UGSM（a和d）、AKT上皮用WT UGSM进行H&E染色（b和E），AKT上皮再用FGF10 GGSM（c和f）进行再生组织的H&E着色。磷酸化AKT（g-i）和GFP（j-l）表达的免疫组织化学分析。
抄送：AR抗体的Western blot分析证实间充质FGF10存在时AR增加。文丘林用作加载控制。
医生：AR的免疫荧光检测显示，与对照组相比，FGF10间充质结合WT或AKT激活的上皮可能导致上皮AR表达增加。
为了确定旁分泌间充质FGF10和细胞自主AKT之间可能的合作机制，对再生的移植物进行了蛋白质印迹分析(). 我们之前观察到，与FGF10相比，AR的表达增加了四倍(). 同样，当比较由上皮性AKT和间充质性FGF10组成的移植物和仅由上皮性AKT组成的移生物时，蛋白质印迹密度测定显示AR蛋白大约增加了八倍(). 免疫组织化学证实AR主要在上皮细胞室过度表达(a和b与c和d之比，e和f与g和h之比）。这些数据表明，旁分泌FGF10信号转导导致上皮AR增加，而这一次要事件可与激活的上皮AKT协同导致进展性癌症表型。
讨论
历史上，在多种肿瘤模型中，基本生长因子被证明是致癌的(Kris等人，1985年). 例如，血小板衍生生长因子是伤口愈合所必需的肽，是最早描述的生长因子致癌基因之一(Doolittle等人，1983年). 我们已经证明，基质FGF10（前列腺发育的一个必要基因）的增强表达足以形成多灶腺癌，同时伴有上皮AR的增加体内前列腺癌模型。
与FGF10类似，AR对前列腺的发育至关重要(库尼亚和隆，1978年). 我们发现基质FGF10的增强表达足以增加幼稚和活化AKT前列腺上皮中AR蛋白的水平。有趣的是，在我们的研究中，与间充质FGF10再生移植物相比，利用慢病毒载体结合间充质GFF10在WT上皮中额外AR的表达没有明显的组织学差异(补充图10 A和B). 发展研究利用在体外无FGF10前列腺的器官培养系统表明，添加外源性FGF10可以诱导类似于添加睾酮的分支形态发生，而添加FGF10和睾酮并不能提供进一步的协同作用(汤姆森和库尼亚，1999年). 我们的发现与之前的观察结果一致，并表明旁分泌FGF10信号可以促进AR的激活。AR蛋白的增加可能是实现这种过度激活的机制之一。
据报道，在多达30%的前列腺癌中，AR基因的扩增被认为是雄激素非依赖性形成的重要机制(Chen等人，2004年;费尔德曼和费尔德曼，2001年). 生长因子调节环的扰动与进展为更具侵袭性的癌症表型相关，从而导致雄激素非依赖性转移疾病(Culig等人，2000年;Culig等人，2002年;Scher等人，1995年). 在我们的模型中，FGF10诱导的前列腺癌细胞亚群的存活，伴随着去势肿瘤中AR的部分核定位，表明雄激素去势水平中旁分泌间充质FGF10激活AR信号轴。
转化细胞，如Bcr-Abl诱导的白血病(Huettner等人，2000年)或ras诱导的黑色素瘤(Chin等人，1999年)，被发现对致癌信号“上瘾”，因此去除激活信号可以导致癌症表型的退化(温斯坦，2002). 可以想象，暴露于癌基因的细胞子集可能会经历随后的基因改变，从而避免对初始促生长激活途径的长期依赖(温斯坦，2002). 这种现象见于c-myc诱导的乳腺癌细胞亚群，在下调该癌基因后，这些细胞可以继续以myc非依赖性的方式生长(Boxer等人，2004年). 先前暴露于高水平FGF10的移植上皮中PIN或腺癌的形成表明，旁分泌FGF10诱导的上皮改变可能是“碰运气”机制。泛磷酸酪氨酸激酶活性的持续存在和AR在移植癌组织亚群中持续的核定位表明存在内在的遗传改变，导致该亚群细胞在低水平FGF10下存活和生长。AR的非遗传活性与几种酪氨酸激酶的激活有关，包括Src、PI3Kinase（磷脂酰肌醇3-激酶）和MAPK激酶（丝裂原活化蛋白激酶）家族受体(Kousteni等人，2001年;Sun等人，2003年). 相反，蛋白酪氨酸激酶的激活可导致AR的激活(费尔德曼和费尔德曼，2001年). 这些机制中的任何一种，联合或单独，都可以解释移植移植物中发现的持续癌症表型。
癌症进展可能是由多种协同遗传事件的积累引起的，这一概念已在最近的三个前列腺癌模型中得到证实(Gao等人，2006年;Xin等人，2006年;Zhong等人，2006年). 自分泌FGFR信号和PI3激酶途径之间的合作在体内PTEN缺失和FGF8b过度表达导致低分化腺癌的转基因动物模型(Zhong等人，2006年). 我们之前已经证明上皮AR和AKT之间的协同作用，导致腺癌抵抗雄激素消融的影响(Xin等人，2006年). PTEN和Nkx3.1的缺失是另一种可促进雄激素非依赖性前列腺癌的机制(Gao等人，2006年). 我们的研究强调旁分泌生长因子FGF10和上皮细胞自主激活AKT之间的协同作用。该模型强调了基质旁分泌和上皮细胞自主信号对低分化疾病发展的重要性。
这些数据表明，通过抑制旁分泌因子或直接抑制生长因子受体，结合其他治疗策略，如用于治疗前列腺癌的雄激素消融，靶向生长因子受体信号轴的重要性。靶向与成纤维细胞生长因子类似的生长因子信号级联也可能延迟雄激素非依赖性的出现，这是前列腺癌治疗中最大的临床挑战。
实验程序
质粒
通过RT-PCR从NIH 3T3细胞中获得编码FGF10的cDNA，并克隆到生态MSCV-IRES-GFP的RI位点（MSCV，小鼠干细胞病毒；IRES，内部核糖体进入位点）(Hawley等人，1994年). DN FGFR1和DN FGFR2(Li等人，1994年)标记并亚克隆到FU-CRW慢病毒表达载体的EcoRI克隆位点。FU-CRW是从FUGW导出的向量(Xin等人，2006年). 在FU-CRW载体中，FUGW载体的GFP编码序列被CMV驱动的RFP表达盒取代。将肉豆蔻酰化人AKT1亚克隆到FU-CRW慢病毒表达载体的EcoRI位点。
免疫组织化学
如前所述，将移植物固定在10%的福尔马林缓冲液中，并放置在70%的乙醇中(Xin等人，2003年;Xin等人，2006年). 制作4 um切片，并用苏木精和伊红（H+E）或CK5抗体（AF138，Abcam）、P63抗体（sc-8431，Santa Cruz Biotechnology）、E-Cadherin抗体（610-182，Transduction）、抗AR抗体（sc-1816，Santa Cruz Bietchnologies）、P AKT抗体（3787，Cell Signaling）、GFP抗体（ON Witte实验室生产的小鼠单克隆3C2-G2）、，抗Brdu（51-75512 Pharmingen）、泛磷酸酪氨酸（Upstate）、CK8（MMS-162P-Covance）和Ki67（Vector）抗体。为了显示CK5，使用了E-cadherin、AR、pAKT生物素化抗鼠IgG（RO627，载体生物技术）和生物素化抗兔IgG二级抗体。用荧光显微镜观察组织切片，并用DAPI（Vector Laboratories）进行复染。
西部印记
在由50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、0.1%SDS、0.5%SD、1%NP-40、1mM EDTA、1 mM PMSF、25 mM NaF、鸡尾酒蛋白酶抑制剂（Roche）和磷酸酶抑制剂I&2（Sigma）组成的RIPA缓冲液中手动溶解移植物和细胞。收集UGSM细胞48小时培养液中分泌的FGF10蛋白，用50%TCA（三氯乙酸）以4:1的比例沉淀，离心，造粒，用丙酮洗涤，风干，用2x SDS裂解缓冲液重新悬浮。用10M NaOH调节PH值。蛋白质裂解物（40-100ug）通过SDS-PAGE分离，然后使用AR（sc-816，Santa Cruz Biotechnology）、FGF10（sc-Santa Cruz biotechnoology）、Vinculin（Sigma）、anti-flag（Sigma-）和Erk2（sc-154，Santa Cruz Bietechnologies）抗体进行western blot分析。利用NIH ImageJ程序对蛋白质印迹数据进行定量(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/).
定量RT-PCR
使用ABI 7700实时PCR系统进行定量RT-PCR。底漆列于补充表1（补充图4）所有引物都跨越至少一个内含子。对每个引物对运行小鼠胎盘cDNA的标准曲线，并将目标基因的数量标准化为肌动蛋白的数量。
