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胃肠病学。作者手稿；PMC 2011年8月1日发布。
以最终编辑形式发布为：
胃肠病学。2010年8月；139（2）：609–619.e6。
2010年6月18日在线发布。 数字对象标识：1053/j.gastro.2010.04.050年10月10日
预防性维修识别码：PMC2929702型
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院203274
PMID：20438729

钙调神经磷酸酶1（Rcan1）调节因子控制成人胰腺的生长可塑性

格热戈兹·T·古尔达,1 斯蒂芬·克罗齐,1 宝安记,2 斯蒂芬·A·恩斯特,三 克雷格·D·洛格斯顿,2 贝弗利·罗瑟梅尔,4和约翰·威廉姆斯1,5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景和目标

胰腺外分泌的生长受胃肠激素调节，尤其是胆囊收缩素（CCK）。CCK驱动的胰腺生长需要钙调神经磷酸酶（CN），它激活NFAT（活化T细胞的核因子），但调节这种反应的遗传基础和反馈机制尚不清楚。

方法

含有蛋白酶抑制剂（PI）的食物刺激胰腺生长，诱导内源性CCK的分泌。在Affymetrix 430A芯片上进行PI模拟的表达谱分析，并通过FK506抑制CN。通过用“flox on”Rcan1小鼠培育弹性蛋白酶Cre（ER）转基因（TG），实现了CN抑制剂Rcan1（钙调磷酸酶1的调节因子）的外分泌胰腺特异性过表达。

结果

通过qPCR证实，CN抑制剂FK506阻断了38个基因的表达。CN依赖基因与生长相关过程相关，而其启动子在NFAT和NFAT/AP1位点富集。ChIP验证了多个NFAT目标，包括Rcan1、Rgs2、HB-EGF、Lif和Gem。其中一种是CN反馈抑制剂Rcan1，在胰腺生长的1-8小时内诱导了50倍以上，FK506对其有强烈抑制作用（>99%）。为了研究其在胰腺生长中的作用，我们以可诱导、腺泡特异的方式过度表达Rcan1。Rcan1过度表达抑制了CN-NFAT信号传导，如NFAT-luciferase报告子和qPCR所示。最重要的是，在Rcan1过度表达小鼠中，外分泌胰腺大小、蛋白质/DNA含量和腺泡增殖的增加均被阻断。

结论

我们描述了适应性胰腺生长，确定了Rcan1是一种重要的新反馈调节因子，并坚定地确定了这种反应需要CN-NFAT信号。

关键词：Rcan1、NFAT、钙调神经磷酸酶、胰腺、生长

简介

充足的胰腺消化酶供应对食物的消化和吸收至关重要。在饮食变化或受伤后保持其功能1正常静止的外分泌组织会迅速膨胀。胃肠激素胆囊收缩素（CCK）是成人胰腺生长的关键调节因子，对这种反应是必要的和充分的2外源性CCK的使用导致胰腺大小增加在里面培养中腺泡细胞的体内和稳健增殖。本研究中使用的另一种模型涉及喂食含有蛋白酶抑制剂（PI）的食物诱导CCK内源性分泌增加三CCK通过其G蛋白偶联受体发出信号，激活MAPK、mTOR和钙调神经磷酸酶。然而，这些早期信号事件如何转化为生长尚不清楚。

钙/钙调素依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶（CN或PP2B）已被证明是适应性反应的重要介体，如T细胞增殖、心肌肥大、成骨和肺成熟4.CN激活多个底物，包括一个由四个活化T细胞核因子（NFATc1-c4）转录因子家族组成的转录因子。在基础状态下，NFAT被严重磷酸化，并被隔离在细胞质中，但在受到刺激后，由于CN介导的去磷酸化作用，NFAT迅速穿梭到细胞核中。迄今为止，CN-NFAT轴在生长中的作用主要是在心脏中。组成活性CN或NFATc4的表达足以产生心肌肥厚5最终导致心力衰竭6使用CN抑制剂CsA和FK506，我们的实验室表明CN对CCK介导的外分泌胰腺生长也很重要7最近，我们还发现CCK激活NFAT在体外和体内，以依赖CN的方式8尽管如此，CN-NFAT的激活如何导致生长以及这种适应性反应的反馈调节仍不清楚。

NFAT是炎症的特征性转录调节因子。CN-NFAT通路也参与了一系列其他反应，但这些NFAT调节基因相对较少被鉴定。在研究的最初阶段，我们对胰腺生长2小时的点进行了全基因组转录谱分析。我们鉴定并分析了38个基因的转录调控，这些基因都是在PI喂养下增加的，并且被CN抑制剂FK506阻断。然后，我们将重点放在38个靶基因中的一个，重新的古拉托钙里奇内里n个1（Rcan1/Dscr1/Mcip1），一种CN活性的内源性抑制剂，具有多种替代转录物。在心脏中，外显子4转录物由CN-NFAT控制，而外显子1转录物的表达独立于该途径9在这里，我们测试了Rcan1作为适应性反馈抑制剂的作用，并与外分泌胰腺的肌肉增生形成对比。我们证明，在整个胰腺生长的早期过程中，Rcan1的持续、CN依赖性增加。我们发现Rcan1抑制CCK刺激的CN-NFAT信号传导。最重要的是，我们注意到，随着组织特异性、可诱导表达Rcan1，CCK诱导的腺泡细胞增殖和胰腺生长几乎被消除。我们的研究表明，Rcan1是胰腺生长的一个重要的新调节因子，这种反应需要CN-NFAT信号。这些结果代表了第一个界定激素介导的外分泌胰腺生长的分子定义反馈机制。

实验程序

材料

蛋白酶抑制剂（PI）camostat由小野制药公司（日本大阪）提供。TaqMan逆转录和扩展™PCR试剂盒购自罗氏公司（瑞士巴塞尔）。抗体和所有其他试剂列于补充材料.

动物和治疗

动物实验，包括PI喂食和FK506注射，概述于补充材料或按前面所述执行8为了在胰腺腺泡中过度表达Rcan1，我们培育了FLAG-Rcan1[Rcan1]转基因小鼠10使用弹性蛋白酶（ER）-Cre[Ela-Core]小鼠11，如前所述生成。Rosa26-LacZ报告鼠来自Jackson Laboratories。所有小鼠菌株均通过PCR和引物进行基因分型补充表二（C）如前所述，检查β-gal的表达12.

细胞培养

前面描述了稳定转染CCK-AR的NIH 3T3细胞13HEK-293和266-6细胞是从ATCC（Rockville，MD）获得的，所有细胞都按照说明培养。如前所述，从6-8周龄雄性小鼠中分离出胰腺腺泡8.

RNA分离、生物信息学和微阵列分析

RNA分离、cDNA合成和PCR遵循前面描述的程序14根据制造商的协议，在密歇根大学微阵列核心对Affymetrix 430A基因芯片进行cDNA合成、杂交和荧光信号优化。详细方法和计算分析概述于补充材料.

定量、实时RT-PCR和蛋白质印迹

使用TaqMAN试剂反转录1μg总RNA。如前所述，使用Bio-Rad I-Cycler IQ进行实时PCR14.使用Primer3设计引物15基于GenBank检索到的基因序列(补充表IIA). 如前所述进行蛋白质印迹8.

ChIP和RT-PCR

使用ChIP-IT表达（活性Motif）对266-6细胞和分离的胰腺腺泡进行ChIP。使细胞未经处理或用CCK或A23187刺激，并在室温下在1%（266-6个细胞）或0.75%甲醛（分离的腺泡）中固定10分钟。应用甘氨酸溶液，收集细胞，进行裂解和超声处理。预先清除25μL的每个染色质样品，用G蛋白琼脂糖珠封闭，并与适当的抗体孵育。在65°C下孵育4小时，洗涤、洗脱复合物并逆转交联。然后用蛋白酶K处理样品2小时，纯化DNA并用于PCR。PCR扩增中使用的引物补充表IIB.

胰腺生长的量化

如前所述，测定体重、蛋白质、DNA浓度和基于BrdU的腺泡细胞增殖16用CellProfiler定量DAPI染色的细胞核™软件符合作者的说明17而BrdU阳性细胞是手工计数的。BrdU标记细胞的百分比是BrdU阳性细胞核与DAPI染色细胞核的比率，平均为每只动物3-5个场。

荧光素酶报告分析

NFAT-核糖核酸酶腺病毒6是JMolkentin博士（辛辛那提大学）送的礼物。高浓度（≥1011如前所述，产生NFAT-luciferase、AdRcan1和对照β-gal/EGFP腺病毒的PFU）8。对于在体外Rcan1表达，分离的腺泡与AdRcan1预孵育，然后与5×106NFAT-luc腺病毒PFU治疗1小时，最后用CCK治疗5½小时。对于在里面体内Rcan1过表达，从TAM注射Ela-Cre（ER）/Rcan1或同窝对照中分离的腺泡用5×106NFAT-luc的PFU处理30分钟，然后处理5½小时。Rcan1-荧光素酶构建物是CGlembotski博士（圣地亚哥州）的礼物，并用Superfect试剂（Invitrogen）转染到AR42J NIH 3T3细胞。对于所有荧光素酶分析，用PBS清洗细胞，在报告裂解缓冲液（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）中进行裂解，并在Berthold光度计中进行测量。每种条件的分析基于3次以上的分离，每个制剂3次重复，标准化为裂解液中的蛋白质浓度。

统计

多个数据集的比较通过单向方差分析进行分析，然后在Graphpad Prism上进行Dunnett或Bonferroni的后验，并表示为平均值±SE。使用双尾Student’st吨-测试。大型微阵列数据集最初通过方差分析与接受F检验的组的p值进行比较。然后按所述导出错误发现率和相关的q值18.

结果

PI诱导和CN依赖基因的RNA微阵列分析

我们对CCK驱动胰腺生长的2h时间点进行了全基因组表达谱分析，特别关注CN依赖基因。从禁食过夜或禁食和再喂含PI的食物2小时的小鼠中获取胰腺RNA，并注射3mg/kg FK506或载体，然后与Affymetrix 430A基因芯片杂交（4只小鼠/组，共16个芯片），如图1A，顶部。PI喂养导致81个基因表达显著增加（>3倍，q≤0.08），2个基因表达减少，而FK506显著阻止了38个基因的PI诱导表达。38个基因中的前12个，我们称之为钙调神经磷酸酶（CN）依赖性基因，被FK506抑制>90%，列于表一而剩下的26个和整个微阵列在补充材料强调CN对胰腺生长的重要性，CN依赖基因占PI喂养诱导基因的三分之一(图1A，底部）。用qPCR独立检测了PI-feeding诱导和FK506强烈抑制的6个基因(图1B). 结果与微阵列所见的变化密切相关。作为额外的对照，我们检测了CCK缺陷小鼠。这些动物对PI没有表现出显著的胰腺生长反应，它们的qPCR表达谱与FK506处理的小鼠几乎相同(图1B). 大多数CN依赖性基因似乎在生长、细胞间通讯、转录调控或负反馈中发挥作用(补充表一); 基因本体（GEO）注释的统计分析证实了这些观察结果(补充图1). 对38个CN依赖基因和81个PI诱导基因的网络关联分析显示，它们与生长、分化和应激反应相关的概念有显著重叠(图1C，粗线条）。有趣的是，NFAT和AP-1这两种转录因子先前被CCK激活，也与我们的两组基因有关。

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胰腺生长中PI诱导和CN依赖基因的特征

(A类)上图：微阵列实验的实验设计。箭头显示了生物学意义上的比较：PI-feeding改变了基因（红色），FK506抑制了基因（蓝色）。底部：PI喂养显著增加了81个基因的表达（>3倍，q≤0.08），而FK506显著（>70%，q≤0.05）阻断了38个基因。(B类)从四组（n=3-8/组）小鼠的胰腺中获取RNA样本：(1)对照组小鼠隔夜禁食，(2)小鼠隔夜禁食，再喂PI-chow 2小时(3)与之前相同，除了用3mg/kg FK506和（4）CCK缺陷小鼠每天预处理两次外，隔夜禁食并参考PI。条形图表示qPCR相对于空腹对照的平均±SEM表达#与2h PI（黑色条）相比，p<0.05和#<0.01。(C类)38个CN依赖基因和81个PI诱导基因的分子概念网络关联，表示为两个浅绿色节点。网络中的每个节点代表一个分子概念或一组生物相关基因，在图例中用颜色编码。节点的大小与基因的数量成正比，连接表明在统计学上显著增加（p<0.005）。与增长/分化相关概念的链接以蓝色显示。

表一

FK506抑制PI-feeding诱导的众多基因

GenBank接入基因符号产品功能注释PI折叠感应%被FK506抑制
NM_019466.1号加拿大1钙调神经磷酸酶1调节剂钙信号、磷酸酶调节器与肌肉发育30.599.5
NM_020013.1号Fgf21型成纤维细胞生长因子2生长因子，细胞外间隙33.899.2
BI558298号Zfp703型锌指蛋白703未知，致癌？7.9798
NM_032540.1号克尔凯尔血型蛋白质分解30.297.1
NM_007707.1号社会保障3细胞因子信号转导抑制因子3细胞生长，胰岛素信号负调控因子34.596.6
NM_009061.1号2卢比G蛋白信号转导调节因子2细胞周期，G蛋白偶联信号，6.3494.3
NM_009311.1号塔克1速激肽1炎症反应、突触传递、疼痛10.394.2
NM_007679.1号Cebpd公司CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP），δ转录调控18.993.3
NM_013689.1号科技细胞质酪氨酸激酶蛋白质磷酸化，信号转导6.6492.3
纳米_026473.1管6微管蛋白，β6基于微管的运动，聚合12.792.1
U10551.1号机组宝石GTP结合蛋白，在肌肉中表达小G蛋白，GTPase信号11.291
NM_008580.1号地图3K5丝裂原活性。激酶激酶5MAPKKK级联、磷酸化、凋亡15.190.6

通过胰腺生长的全基因组表达谱确定了38个CN依赖性基因中的前12个（FK506抑制>90%的基因），顺序为FK5060抑制%。整个列表显示在补充材料列为GenBank Accession、Mouse Genome Informatics（MGI 3.54）基因符号、产品名称、基因本体（GEO）分子功能注释、蛋白酶抑制剂（PI）的折叠诱导和FK506对该诱导的抑制百分比。

CN依赖基因的NFAT调控

基于上述发现，我们接下来评估了NFAT作为CN依赖基因转录调节器在胰腺生长中的潜在作用。我们检索了这38个基因及其大鼠和人类同源基因的非编码调控序列，进行了外显子比对，并搜索了保守的NFAT结合位点。在三个物种中，任何至少有一个NFAT位点保守的基因都被称为“NFAT调节型”，而在该组中，具有多个近距离位点的一个子集则称为“高置信度”。不包含任何三向保守位点或无法对齐位点的基因分别被称为“不太可能”或“未确定”。使用两种计算工具MatInspector进行独立分析™和rVISTA，产生了大量重叠的结果(图2A). 根据相同的分析，几乎所有实验建立的与免疫系统相关的“金标准”基因都被发现受NFAT调节，而在随机选择的基因中仅发现少数且没有高置信度的鉴定(图2B). 与许多其他转录因子一样，NFAT作为更大的调节“模块”的一部分控制基因表达使用Genomatix中的框架工人工具™软件中，我们发现了几个与CN或CN-NFAT信号有关的统计上代表性过高的模块(补充图2A). 然后对众所周知的NFAT/AP1转录因子复合物进行与NFAT类似的分析，确定几个包含该保守启动子模块的CN依赖基因(补充图2B和C). 计算分析是一个很好的出发点，尽管结果可能并不总是反映生物学。为了实验验证我们的预测，我们通过染色质免疫沉淀（ChIP）分析检测了几个具有已知生长相关功能的高置信NFAT调节基因。钙离子载体A23187处理小鼠胰腺266-6腺泡细胞和CCK处理原代胰腺腺泡均刺激NFATc1与5个CN依赖基因启动子区结合(图2C和D).

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描绘NFAT调控基因

(A类)近端启动子（MatInspector™)获得并对齐了38个CN依赖基因的小鼠、大鼠和人类直系同源基因的调控区（rVISTA）。注意，MatInspector™没有自动检索RCAN1第4外显子转录的近端启动子。通过人工检索，RCAN1是一个高置信度的鉴定。(B）MatInspector分析了21个实验建立的启动子、NFAT调节基因（金标准）和一组21个随机基因™采用与（A）相同的方法和标准进行评估。（C）A23187刺激NFATc1与五个CN依赖基因启动子结合的染色质免疫沉淀（ChIP）分析，计算预测NFAT将调节这五个基因的启动子。对266-6个细胞进行了研究。Pol II结合被用作转录活性基因的读出，EF1α的引物集被用作对照。（D）在原代分离的小鼠腺泡细胞中进行CCK刺激NFATc1与（C）中相同的五个CN依赖基因启动子结合的ChIP分析。

在胰腺生长过程中强烈诱导Rcan1

作为FK506最敏感的基因，在喂食含PI的食物诱导的前三个基因中(表一)，Rcan1表达似乎与胰腺生长密切相关。为了检测胰腺生长早期过程中Rcan1表达的变化，我们从禁食过夜或禁食并参考含有PI的食物1-8小时的小鼠中获取RNA和蛋白质。PI喂养使Rcan1 mRNA持续增加50倍以上(图3A)而Rcan2和Rcan3的表达与CN-NFAT通路无关19，未更改(图3A). 26kDa第4外显子RCAN1蛋白发生了平行变化(图3B)而外显子1较大型的水平没有改变（数据未显示）。CCK还剂量依赖性地激活了Rcan1启动子驱动的荧光素酶报告子，并且这种作用被FK506阻断后显示为CN依赖性(图3C). 作为额外的对照，我们检查了喂食的效果。在禁食小鼠中，循环CCK的浓度通常为0.5–1 pM，在喂食标准饮食的动物中，CCK的含量增加到3–5 pM，而喂食含PI食物的动物，CCK浓度增加到~15 pM16在喂食对照组或CCK缺乏小鼠中，Rcan1表达没有明显增加(图3D).

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含PI的食物增加RCAN1表达

将小鼠禁食一晚，再喂含PI的食物1-8小时，然后处死。(A类)随着喂食PI，RCAN1的mRNA表达显著增加（**p≤0.01，n=5-6），但RCAN2或RCAN3的mRNA没有显著增加。18S RNA作为对照。(B类)PI-喂食可显著诱导RCAN1的外显子4形式（*p<0.05或*p<0.01），在2h达到峰值。26kDa形式RCAN1和亲环素a（CycloA）负荷控制的代表性western blot显示在条形图上，该条形图量化了每个时间点5-6只小鼠的3个独立实验的结果。(C类)CCK在NIH3T3 CCK-AR细胞中以CN依赖方式激活Rcan1-荧光素酶报告子，呈剂量依赖性。（*p≤0.05，n=5–6）(D类)野生型小鼠胰腺24kDa RCAN1型和亲环素A（负荷控制）的代表性western blot，禁食、自由进食、隔夜禁食，并参考标准或含PI的饮食；CCK缺乏小鼠禁食并重新喂食含有PI的饮食。

可诱导的胰腺腺泡细胞特异性Rcan1在体内过表达

Rcan1表达的持续、CCK依赖性增加促使我们测试CN的内源性调节物是否可以作为CCK驱动的胰腺生长的反馈抑制剂。为了以可诱导、腺泡细胞特异的方式表达Rcan1，我们将表达三苯氧胺（TAM）诱导、弹性蛋白酶启动子驱动的Cre重组酶[Ela-Core（ER）]的小鼠与“flox-ON”FLAG-Rcan1小鼠杂交。我们使用免疫组织化学和western blots检测Cre蛋白。Cre在TAM注射Ela-Core（ER）小鼠的外分泌胰腺中表达，但在胰岛或导管中不表达(补充图3A)胰腺中，但唾液腺或肝脏中没有(补充图3B). 为了验证Ela-Core（ER）的组织特异性激活，我们将该菌株与Rosa26-LacZ报告小鼠杂交。β-半乳糖免疫组化显示，Cre重组酶在80%以上的胰腺腺泡中被激活，但在胰岛、血管或导管中没有激活(补充图3C)TAM注射Ela-Core（ER）/LacZ小鼠。在双转基因的唾液腺泡细胞或单转基因对照的胰腺和唾液腺中未发现β-半乳糖染色（数据未显示）。为了评估Rcan1转基因的腺泡特异性表达，我们从TAM注射Ela-Core（ER）/Rcan1小鼠或单个转基因小鼠的腺泡中制备RNA。FLAG-Rcan1转基因在不依赖CCK的双转基因小鼠的腺泡中表达，但在单转基因同窝小鼠中不表达(补充图3D). 相比之下，三组未注射动物的腺泡均表现出CCK诱导的内源性Rcan1信息的同等表达。在TAM注射Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠中，RCAN1蛋白也强烈表达(补充图3E，车道2），但不适用于注射TAM的野生型动物，也不适用于车辆注射的双转基因动物；肝脏中未发现转基因表达(补充图3E，车道4-6）。最后，为了测试Rcan1过度表达的剂量依赖性效应，我们使用了第二个独立生成的“Flox-ON”Rcan1动物系10称为“Rcan1（a）”小鼠。Ela-Cre（ER）和Rcan1（a）小鼠杂交产生的双转基因后代的转基因表达降低了约8倍（数据未显示）。

Rcan1是CCK驱动的胰腺CN-NFAT信号的抑制剂

接下来，我们测试了在CCK介导的胰腺生长中，Rcan1过度表达是否抑制CN-NFAT信号。作为CN-NFAT激活的读数，我们使用了一个先前特征化的NFAT-luc（NFAT-lu）报告子8CCK在与对照β-gal/GFP腺病毒孵育的原代分离胰腺腺泡中诱导了该报告基因的强大、剂量依赖性激活(图4A). Rcan1的表达也阻断了NFATc1GFP向细胞核的移位(补充图4). 同样，在TAM-注射Ela-Core（ER）/Rcan1同窝小鼠的孤立腺泡中，CCK诱导的NFAT-luc报告子的剂量依赖性反应在很大程度上被消除(图4B). 因此，体内Rcan1的表达导致CN-NFAT信号传导的功能性抑制，与腺病毒介导的过表达的功能性抑制相当。Rcan1的Acinar特异性过表达体内然而，并没有改变核糖体蛋白S6和4E-BP1的CCK依赖性磷酸化，这是mTOR的两个众所周知的下游靶标，mTOR是PI诱导的胰腺生长的关键信号（结果未显示）。有趣的是，Rcan1还抑制了PI诱导的许多（但不是所有）38个CN依赖性FK506抑制基因的激活(图4C，与相比表一和图1B). 经过仔细检查，PI-feed中Rcan1显著抑制的基因与我们对NFAT调节基因的计算预测一致(图2A)这意味着Rcan1抑制作用的NFAT特异性倾斜。

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RCAN1过度表达在功能上抑制CN-NFAT通路

(A类)CCK在与RCAN1或β-gal/GFP腺病毒孵育的孤立腺泡中对NFAT-核糖核酸酶报告子的剂量反应激活（n=3，*p<0.05与时间零点；#p<0.05与对照病毒）。(B类)注射TAM的Ela-Core（ER）/Rcan1或野生型同窝雄鼠新鲜分离的腺泡中NFAT-luciferase报告子的剂量反应激活（n=3，*p<0.05与时间零点；#p<0.05与对照组）（C）用禁食对照组和Ela-Core（ER）/RCAN1或禁食并喂食含PI2小时的野生型窝鼠的RNA样本进行RT-qPCR。所有小鼠均注射TAM。所示为一组八个基因相对于空腹对照的平均±SEM诱导（n=4-7；#p<0.05 vs.2h PI野生型）。

Rcan1过表达阻断胰腺CCK驱动的腺泡增殖

Rcan1转基因明显抑制CN-NFAT信号，因此我们询问腺泡细胞特异性Rcan1过度表达是否足以抑制CCK驱动的胰腺腺泡细胞增殖。注射TAM的野生型和Ela-Core（ER）/Rcan1小鼠禁食，用对照组或含PI的食物喂养2天，并用BrdU治疗。在Ela-Core（ER）/Rcan1和正常饮食喂养的对照组中，只有不到0.5%的细胞在细胞核中掺入BrdU(图5A). 在喂食含PI饮食的野生型小鼠中，BrdU掺入量显著增加，Ela-Cre（ER）/Rcan1小鼠的这种增加基本上被阻断(图6A). 此外，BrdU并入形态可识别的、淀粉酶染色的腺泡细胞(图5B).

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RCAN1转基因阻断腺泡细胞增殖体内.（A）

注射TAM的野生型小鼠和Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠禁食并参考标准或含PI的食物2天，用BrdU处理，2小时后处死。BrdU免疫染色的代表性载玻片为红色，DAPI为蓝色，覆盖为粉红色（白色箭头）。在3-5只小鼠上进行的实验结果被量化为总DAPI染色中BrdU染色的%细胞**与标准食物相比p<0.01#与野生型喂食含PI的食物相比，p<0.05。（B）BrdU（粉红色细胞核/白色箭头）并入形态成熟、表达淀粉酶（绿色）的腺泡细胞。

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RCAN1的Acinar特异性过表达阻断胰腺生长

（A）注射TAM的野生型和Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠喂食标准或含PI的食物10天。年龄和体重（BW）匹配小鼠胰腺的代表性照片。正方形为6×6mm。（B）野生型和Ela-Core（ER）/RCAN1小鼠的相对胰腺重量，喂食标准或含PI的食物0–10天。所有动物都预先注射了TAM；n=3-5，**p<0.01与第0天相比##与当天野生型喂食含PI的食物相比，p＜0.01。（C、D、E）第7天胰腺相对重量（C）、蛋白质（D）和DNA含量（E）的变化；注射TAM的野生型、Ela-Core（ER）/RCAN1和单转基因窝鼠（n=4-6）喂食标准或含PI的母猪（**p<0.01 vs野生型；##p<0.01 vs.野生型PI）。

Rcan1过表达阻断CCK介导的胰腺生长

最后，我们测试了腺泡细胞特异性Rcan1过度表达是否也足以抑制胰腺生长体内我们比较了注射TAM的Ela-Core（ER）/Rcan1和喂食标准或含PI食物长达10天的对照组。在野生型动物中，与吃标准食物的同窝动物相比，喂食含PI的食物导致胰腺的总大小大幅增加(图6A). 胰腺重量相对于体重增加了一倍多，在第7天达到峰值(图6B). 然而，在Ela-Core（ER）/Rcan1小鼠中，PI诱导的CCK驱动的胰腺生长在整个时间过程中完全消失(图6). 在第7天点对4-6只小鼠/组进行的详细研究证实了这些发现，注射TAM的野生型和单转基因喂食含PI的母鼠的相对胰腺重量增加了一倍，但Ela-Core（ER）/Rcan1窝鼠几乎没有生长(图6C). 有趣的是，表达低水平Rcan1的Ela-Core（ER）/Rcan1（a）系表现出中间表型；与喂食标准食物的对照小鼠相比，生长增加，但与喂食含PI食物的对照鼠相比，生长减少(图6C). 在标准饮食或含PI饮食7天后测量的胰腺蛋白质和DNA含量显示出与生长平行的变化(图6C和D). 这些最后的数据表明胰腺生长的增生性质，并与我们的BrdU掺入数据和以前的工作一致7.

讨论

胰腺的生理生长是对高蛋白饮食、吞咽过度、妊娠和哺乳的反应20然而，控制这种适应性反应的分子机制尚不清楚。在这里，我们检测了CCK介导的胰腺生长的表达谱。我们专注于CN-NFAT信号轴，确定了几个新的生长相关NFAT调节基因。我们还证明，其中一个基因Rcan1作为CN/NFAT依赖性反馈抑制剂发挥作用，控制成人胰腺的生长可塑性。

我们的表达谱结果验证并扩展了过去的工作。我们表达谱中显著改变的基因集与之前显示为激活CCK的途径相关的分子概念有显著重叠，包括MAPK-AP114、Rho-SRF21和NF-κB22除CN-NFAT-Rcan1外，我们的工作还指出JAK-STAT及其抑制剂Socs2和Socs3是调节这种反应的另一个信号(补充表一和未发布的数据）。我们的38个CN依赖基因中有几个与生长、分化和代谢的调节有关。FGF21已被证明对肝脏再生和β细胞存活至关重要23β细胞转分化与胰腺癌24而Socs3用于肝脏的增殖和血管生成25我们认为，这些和其他膜结合的旁分泌/自分泌介质改变了局部微环境，促进增生或分化，从而指导胰腺生长。部分切除后的肝脏也显示出类似的机制26和胰腺炎后的胰腺27大体上，我们的结果表明CCK介导的胰腺生长与这些再生反应有很多共同之处。

NFAT是炎症的转录介质。然而，它们作为生长或组织稳态的调节因子的作用并不明确。我们的工作是对全基因组表达的最详细分析之一，它是与CN-NFAT信号相关的适应性反应的基础。我们预测了一组相当大的新的与胰腺生长相关的NFAT调节基因，并表明NFATc1与选定的高质量鉴定的启动子结合。ChIP增加NFATc1结合的时间框架对应于CCK刺激的腺泡中NFATc1-GFP的核穿梭8以及其他细胞类型中NFAT易位的动力学。最后，NFAT对DNA的亲和力本质上较低，因此在复合物或模块中发挥作用。NFAT的已知伙伴包括心脏中的GATA-4、肺中的C/EBP、肌肉中的MEF2和免疫细胞中的AP-1/Foxp328复杂依赖效应决定了NFAT以组织或刺激依赖方式结合的时间、亲和力和结果。在这里，我们确定了CN依赖基因中的几个丰富的转录模块，包括众所周知的协同NFAT/AP-1复合物29作为一个聚合位点，转录复合物可以解释为什么抑制单个通路足以破坏整个生理反应。

在胰腺生长的早期，Rcan1表达增加，内源性Rcan1强烈抑制CCK诱导的CN-NFAT信号传导。这使我们形成了本研究的中心范式：CCK介导的CN激活导致NFAT的核移位和激活，NFAT依赖性诱导Rcan1，最终Rcan1介导的抑制CN。然而，CN-NFAT-Rcan1轴抑制生长的确切方式尚不清楚。一个理由是RCAN1阻止增殖；另一种可能是RCAN1限制血管生成。NFATc1已被证明可以调节血管内皮生长因子（VEGF）的表达30而过度表达Rcan1的小鼠由于血管生成减弱，肿瘤形成减少31Rcan1在唐氏综合征（Down Syndrome）中也有较高水平的表达（Rcan1也被称为唐氏症候群临界区1或DSCR1），可能会降低这些患者对实体瘤的敏感性。CCK还增加了白血病抑制蛋白（Lif）启动子的表达和NFATc1结合。最近研究表明，Lif可以调节视网膜病变中的微血管密度和VEGF表达32Rcan1在血管生成调节中的直接或间接作用无疑是未来研究的一个有希望的领域。

最后，我们的研究表明，Rcan1转基因过度表达足以完全阻止胰腺生长。Rcan1的先发制人表达将CN-NFAT-Rcan1信号固定在永久“关闭”位置，与CCK无关。这种组织特异性遗传方法避免了药物的副作用，如免疫抑制、肾脏和神经毒性，而诱导性过度表达则先于可能的发育缺陷或代偿性改变。Rcan1也抑制了许多被CN抑制剂FK506阻断的基因，但不是所有。有趣的是，Rcan1似乎只显著抑制CN依赖性基因，我们也通过计算预测这些基因受NFAT调节。其他地方也提出了Rcan1对CN抑制作用的NFAT特异性偏斜，但主要基于生化证据33.

胰腺组织细胞命运和可塑性调控的最新进展为胰腺炎、胰腺癌和糖尿病的治疗带来了新的希望。我们的工作和胰腺发育的表达谱34，胰腺炎35和胰腺癌36是进一步综合研究的基础。与此相关的是，NFATc1在胰腺癌中被不当激活37Rcan1的作用尚待研究，但至少两个人类胰腺癌样本微阵列中Rcan1信息的显著下调很可能证明其重要38–39.

总之，我们检测了CCK介导的胰腺生长早期点的表达谱。我们通过计算和实验检测了几个与生长相关的基因，重点是内源性CN调节因子Rcan1。Rcan1在整个生长反应中表现出强烈、持续的表达，并显著抑制CCK模拟的CN-NFAT信号。最显著的是，Rcan1的诱导性外分泌特异性表达在里面体内完全阻断腺泡细胞增生和伴随的CCK驱动的胰腺生长。我们的工作确定了一种重要的新反馈机制，该机制界定了适应性胰腺生长，并提供了确凿的证据，证明CN-NFAT轴对于这种激素介导的适应性反应是必要的。

补充材料

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致谢

赠款支持：该研究得到了NIH拨款DK 59578（JAW）和P30 DK-34933（密歇根州胃肠肽中心）的支持。GTG得到了系统与综合生物学培训拨款（T32 GM008322）和医学科学家培训计划的支持。其他赠款支持包括DK52067（CDL）、R21 DK068414（BJ）、DK-0077423（SJC）和HL072016（BAR）。我们还使用了由NIH5P60 DK20572资助的密歇根糖尿病研究与培训中心的形态学和图像分析核心。

我们感谢Linda Samuelson（密歇根大学）对CCK缺陷小鼠的帮助，感谢Bradley Nelson在免疫组织化学方面的帮助，以及Scott Tomlins和Arul Chinnayian实验室（密歇安大学）在生物信息学方面的帮助。

脚注

财务披露：无

不存在利益冲突

在手稿中的作用：GTG=研究设计、数据采集/分析/解释、起草和修订的手稿、知识内容、统计分析；SJC=数据采集、知识内容、修订稿；BJ=知识内容，修订稿；SAE=数据分析/解释、技术支持、知识内容；CDL=知识内容、修订的手稿、获得的资金；BAR=研究设计、知识内容、技术支持、修订稿；JAW=研究设计、修订稿、知识内容、获得资金

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