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大脑。2010年9月；133(9): 2612–2625.
2010年5月21日在线发布。 数字对象标识：10.1093/brain/awq105
预防性维修识别码：PMC2929329型
PMID：20495185

超氧化物是轴突损伤中细胞凋亡的相关信号

Akiyasu Kanamori公司,通讯作者1,* 玛丽亚·玛格达莱娜·卡特里内斯库,1,* 诺里科·卡纳莫利,1 卡特里娜·A·米尔斯,1 雷切尔·博宾,1和莱昂纳德·莱文通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

视神经病变是不可逆失明的主要原因，也是中枢神经系统轴突疾病的典型表现。主要事件是视网膜神经节细胞轴突受损，随后细胞体因凋亡而死亡。对这些和其他神经疾病的神经保护试验大多失败了，主要是因为动物的神经保护机制不一定能转化为人类的神经保护。我们开发了一种方法，用于成像活体动物神经元死亡信号的细胞内转导途径。使用纵向共焦扫描多激光眼底镜，我们确定了视神经横断后逆行标记的大鼠视网膜神经节细胞内超氧化物的产生。通过对其与玻璃体内注射的氢乙硫胺反应产物的实时成像，对超氧化物进行可视化，并通过特定产物2-羟基乙硫胺的差分光谱进行确认。视网膜神经节细胞超氧物在轴切开后24小时内增加，4天达到峰值，对侧无损伤眼未观察到。超氧物信号先于磷脂酰丝氨酸外化，表明超氧物生成是一个早期事件，先于细胞凋亡。玻璃体内聚乙二醇化超氧化物歧化酶阻断了轴切开术后超氧化物的生成，延缓了视网膜神经节细胞的死亡。总之，这些结果与超氧化物是视神经损伤后视网膜神经节细胞凋亡的上游信号相一致。超氧物早期检测轴突损伤可作为视神经病变患者的预测性生物标志物。

关键词：视网膜神经节细胞、轴突损伤、超氧化物、视神经病变、细胞内信号

介绍

视神经病变是中枢神经系统的一种主要轴突疾病，是导致不可逆性视力丧失的主要原因。视神经病变的神经保护试验通常未能显示疗效，因为它们在神经疾病方面也失败了（在Danesh-Meyer和Levin中进行了综述，2009). 未能将成功的动物研究转化为临床试验的原因有多种，但一个关键因素是难以证明患者的作用机制与实验室中的作用机制一致。

为了研究人类神经保护治疗的作用机制，我们研究了视神经损伤后的信号转导事件。大多数视神经疾病的最初损伤是视网膜神经节细胞（RGC）轴突的损伤，随后几天到几周后RGC发生凋亡（Berkelaar）等。,1994; 加西亚-瓦伦苏埃拉等。,1994; 雷恩和林登，1994; 奎格利等。,1995). 轴突损伤后RGC死亡的一个关键分子事件是细胞内超氧化物爆发（盖革等。,2002; 利芬等。,2003,2006; 阮（Nguyen）等。,2003; 斯旺森等。,2005). 我们假设，这种超氧化物信号可以作为细胞凋亡前的生物标志物体内成像。Cordeiro及其同事(2004)证明通过共焦扫描激光眼底镜（CSLO）可以在活体眼睛中成像RGC凋亡，然后依次观察（Cordeiro等。,2010)，使得在单细胞水平上评估神经保护疗法成为可能。为了准确定义超氧物信号在轴突损伤中的作用，我们利用多激光CSLO，将其用于共焦扫描激光成像体内在老鼠的眼睛里。为了测试超氧物的产生是否是一种有用的生物标记物，即细胞死亡程序固有的标记物，我们研究了横断术后RGC中凋亡标记物的表达是先于还是先于超氧物产生，以及超氧物水平的下调是否能防止RGC死亡。

材料和方法

材料

氢乙硫胺（二氢乙硫铵；HEt）来自BioChemika。与牛红细胞超氧化物歧化酶（PEG-SOD）结合的甲萘醌和聚乙二醇来自Sigma-Aldrich。1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚三碳菁碘化物[DiR；DiIC18（7） ]、Alexa Fluor 488-右旋糖酐、Alexa-Fuoro 488-膜联蛋白V、4-氨基-5-甲胺基-2′，7′-二氟荧光素（DAF-FM）二醋酸盐和鲑鱼精子DNA来自Invitrogen。黄嘌呤和黄嘌呤·氧化酶来自罗氏公司。人类红细胞过氧化氢酶（>50000 U/mg蛋白质；通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳≥95%）来自EMD Chemicals（Gibbstown，NJ）。罗丹明结合单叶灰树凝集素I（GSL-I）来自Vector Laboratories（加利福尼亚州伯林盖姆）。RGC-5细胞是Neeraj Agarwal博士慷慨赠送的礼物。

视神经横断术

动物实验由Maisonneuve-Rosemont医院研究中心动物护理委员会批准。雌性Long-Evans大鼠体重225-250克，来自加拿大查尔斯河。如前所述进行脑膜内视神经横断术（Kanamori等。右眼在氯胺酮（50 mg/kg）/甲苯噻嗪（100 mg/kg）麻醉下，左眼作为对照。间接眼底镜检查证实视网膜循环得到保存。患有妨碍成像的白内障或角膜问题的动物不再使用。

玻璃体注射

如前所述进行玻璃体内注射（Kanamori等。，按）。使用连接在10µl Hamilton注射器（内华达州里诺市Hamilton）上的32号针头，在颞上缘后部立即进行注射。以45°角通过巩膜缓慢注射HEt、DAF-FM、Alexa Fluor膜联蛋白V或PEG-SOD（4µl）。这种给药途径避免了视网膜脱离或晶状体损伤。假设成年大鼠眼睛的玻璃体体积为～56µl（Berkowitz等。,1998)，HEt和DAF-FM的最终玻璃体内浓度为～100µM(表1). 注射后将红霉素眼膏涂在眼球上。为了避免玻璃体内注射本身可能导致短暂的视网膜细胞损伤的可能性，总是在玻璃体内注射荧光染料后至少一天对CSLO上的阳性细胞进行计数。

表1

实验中使用的染料

姓名实验体积管理最终浓度来源目录编号。
HEt公司体内4微升玻璃体内100微米生物化学株式会社37291
无细胞分析不适用文化媒体100微米
RGC-5分析不适用文化媒体5微米
Alexa Fluor 488-annexin V共轭物体内4微升玻璃体内（见注释）Invitrogen公司A13201型
DAF-FM双乙酸酯体内4微升玻璃体内100微米Invitrogen公司D23844型
Alexa Fluor 488-右旋糖酐共轭物体内2.8微升上丘20毫克/毫升Invitrogen公司D22910型
DiR公司体内2.8微升上丘20毫克/毫升Invitrogen公司D12731号

AlexaFluor 488-annexin V共轭物的制造商未提供其在所售溶液中的浓度。它是在未经稀释的情况下从购买的产品中使用的。

共焦扫描激光检眼镜

市场上可买到的海德堡视网膜血管造影2（德国海德堡工程公司）通过添加基于光学工作台的动物成像平台（新泽西州牛顿市索拉布）和添加额外过滤器的能力进行了修改（见下文）。使用了两个内置激光器。488 nm激光用于激发氢乙硫醚-超氧化物产物2-羟基乙硫醚（OH-Et）、Alexa Fluor 488-annexin V、Alexa-Fluor 48 8-dextran，并对神经纤维层进行反射模式成像。使用788 nm激光激发DiR（激发745 nm，发射780 nm）。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下通过CSLO进行视网膜成像。用苯肾上腺素和阿托品扩张瞳孔。在整个成像过程中，使用平衡盐溶液维持角膜水合作用。使用30°视野和CSLO上至少50张图像的实时平均值（93%灵敏度）获得视网膜图像。根据染料的不同，使用中波长通道（488 nm激光激发，500至650 nm检测）或长波长通道（788 nm激光激励，800至900 nm检测）。通过CSLO偏振滤光片在488 nm处对神经纤维层进行成像，将焦点平面调整至视网膜内部（“无辐射成像”）。为了检查OH-Et或annexin V出现的时间进程，在每次治疗中都会获得紧邻视神经头的八个视网膜象限的图像，并对阳性细胞进行计数(图1).

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为awq105f1.jpg

CSLO视网膜成像地形图示意图。为了量化各种荧光阳性细胞的数量（例如OH-Et和annexin V），在靠近视神经头的每个视网膜八分之一处拍摄了八张图像。

OH-Et（567–586 nm）和Alexa Fluor 488（517 nm）的发射峰均在CSLO发射带通范围（500–650 nm）内。当对含有这两种荧光团的视网膜成像时，为了区分这两种荧光团，在CSLO光学模块前面放置一个短通滤波器（550nm；Asahi Spectra USA）。该滤光片阻止了OH-Et的发射，但没有阻止annexin V发射或激光激发（488 nm）。使用或不使用该过滤器进行成像。然后将这两幅图像分别伪绿色（500–550 nm）和红色（500–650 nm），并进行合并。在合并图像中，黄色表示annexin V阳性，红色OH-Et阳性。

视网膜神经节细胞的逆行标记和定量

通过立体定向向上丘注射Alexa Fluor 488葡聚糖或DiR逆行标记RGC。简单地说，将大鼠置于立体定向装置中（日本东京Narishige有限公司），并切开颅骨皮肤。通过钻取顶骨来暴露大脑表面，以便于染料注射。荧光染料（Alexa Fluor 488-dextran或DiR），浓度为20 mg/ml，总体积为2.8µl(表1)双侧注射于前角尾侧5.5和6.5 mm处，中线外侧1.2和2.2 mm处，距颅面4.5和5.5 mm处。为了量化视神经横断术后RGC数量的减少，用中波长CSLO滤波器对Alexa Fluor 488-dextran标记的视网膜进行成像。选择Alexa Fluor 488-右旋糖酐是因为它比其他逆行染料（Kanamori等。，按）。每次治疗均获得紧邻视神经头的四个视网膜象限的图像。为了在随后的治疗中对视网膜的同一区域进行成像，我们在可识别的视网膜血管所划定的区域内对RGC进行了计数。每个图像的每个区域中至少有100个标记的细胞由受试者在横切和处理状态下进行人工计数。将横断后所选视网膜区域的标记RGC数量与视神经横断前相应区域的标记细胞数量进行比较。

采集图像的注册体内

由于呼吸引起的微小运动，当使用实时信号平均法连续采集图像时，图像的角度和大小会发生变化。使用Photoshop CS3（Adobe）合并使用两种不同染料采集的图像。在去斑点并调整亮度和对比度之后，一个图像被转换为绿色，另一个图像被转换为红色。这些伪彩色图像被导出到新图像的相应绿色和红色通道中，其中蓝色通道被设置为黑色。使用自由变换模式，将红色通道中图像的角度和大小调整为绿色通道中的图像，以重叠视网膜血管。因此，彩色阳性细胞在合并图像中为黄色。由于大鼠眼睛，特别是周边视网膜的光学非线性，不可能完美地合并两幅图像。

组织学

安乐死后立即取出视网膜，在4%多聚甲醛中固定20分钟，清洗，平贴在玻璃载玻片上，并用表观荧光显微镜观察（蔡司Axio Observer.A1）。区分HEt的氧化产物（Robinson等。,2006)OH-Et使用395±5.5nm激发、500nm二向色性和562±20nm发射滤光片；以及用于乙炔/OH-Et的560±20 nm激发、595 nm二向色和630±30 nm发射滤光片。来自CSLO成像RGC的乙炔/OH-Et信号的相关性（488 nm激发）和来自整个支架上成像RGC信号的相关性通过邻近视网膜血管的登记完成。使用730±15 nm激发、770 nm二向色性和800±20 nm发射滤光片对用DiR逆行标记的RGC和之前用CSLO成像的RGC进行整体成像。

为了验证玻璃体内注射PEG-SOD在视网膜干细胞中的分布能力，对注射眼的视网膜冰冻切片进行SOD-1染色。简单地说，注射后一天，从眼球摘除的眼睛中取出角膜和晶状体，然后在4%多聚甲醛中固定30分钟。固定后，用增加浓度的蔗糖对眼睛进行冷冻保存，并将其冷冻在1:2的Tissue-Tek O.C.T.（Sakura，Finetake，CA）和20%蔗糖的混合物中。视网膜冷冻切片（8µm）用兔SOD-1抗体（1:200；密歇根州安娜堡Stressgen）免疫染色，然后用Alexa Fluor 488山羊抗兔免疫球蛋白G（1:200，Invitrogen）进行免疫染色，并用表观荧光显微镜进行检查。

为了检测小胶质细胞和超氧化物之间的空间关系，用HEt孵育视网膜，然后用罗丹明标记的GSL-I染色。在三只大鼠视神经切断后3天，玻璃体内注射HEt。第二天，视网膜被迅速切除就地，在4%多聚甲醛中固定，在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，并在0.2%Triton X-100中透化15分钟。在另一次磷酸盐缓冲盐水洗涤后，用GSL-I（1:200）对视网膜染色2小时以标记小胶质细胞。

细胞培养

RGC-5细胞在含有1 g/l葡萄糖、10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素的Dulbecco最小必需培养基中培养。细胞每48–72小时分裂一次，当～60–75%融合时，以1:20的稀释度在25 cm中重新放置2烧瓶置于5 ml细胞培养基中，并在37°C的加湿5%CO中培养2在实验中，将细胞接种到24孔组织培养处理过的微孔板上，并在含有血清的500µl培养基中预培养24小时，然后用甲萘醌或h处理2O（运行）2.

统计

结果显示为平均值±平均值标准误差（SEM）。未付款t吨-测试用于两组之间的比较，ANOVA和Tukey-Kramer测试用于多组比较。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

结果

视神经切断诱导视网膜细胞产生超氧物体内

视神经横断后，玻璃体内HEt（100µM）在横断后24小时开始产生CSLO可见的荧光细胞。这些细胞可以通过共焦聚焦于视网膜最内层定位到神经节细胞层，而在视网膜外层或无反应的眼睛中没有荧光。为了量化荧光细胞生成的时间进程，在指定的位置对从视神经头到中周的阳性细胞进行计数(图1)在独立组大鼠视神经切断后的不同时间(n个= 4–8). HEt在成像前一天注射。注射后阳性细胞数量迅速增加，最高达到66.2±11.7个细胞/场(n个=8）在横切后4天，然后减少6天至23.8±6.3个细胞/场(n个= 4) (图2).

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视神经切断导致成像时视网膜内出现OH-Et阳性细胞体内由CSLO提供。(A类)实验流程图。(B类)OH-Et-阳性细胞的概述由九幅CSLO图像的蒙太奇组成。(C类)视神经切断后CSLO检测OH-Et阳性的时间进程。OH-Et阳性率在第4天达到最大值。ONT=视神经横断。

为了检测轴切开术后一氧化氮的生成，在横断和纵向成像术后第1天玻璃体内注射DAF-FM，持续10天。尽管血管内皮细胞被DAF-FM强烈标记，但视网膜其他部位没有信号。

采用三种不同的方法来确定视神经切断和玻璃体内注射HEt后的荧光是否反映了2-羟基乙硫醇（OH-Et，HEt与超氧物的产物；图3)或乙炔（HEt的氧化产物）。首先，测量了OH-Et与乙炔的CSLO过滤器组的相对特异性。HEt在无细胞系统中与超氧化物/H孵育2O（运行）2由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶（X/XO）或H生成2O（运行）2（罗宾逊等。,2006). 添加鲑鱼精子DNA是为了模拟细胞内环境，其中OH-Et或乙炔与核DNA的结合会增加信号强度并改变发射光谱。在添加1 mM黄嘌呤和0.05 U/ml黄嘌呤·氧化酶（X/XO）或9.8 mM H后，在0、15、30和45分钟，在没有或存在1 mg/ml鲑鱼精子DNA的情况下，拍摄50µl体积的100µM HEt的CSLO图像2O（运行）2荧光强度是用ImageJ从数字化图像中计算出来的。在HEt和DNA存在下，X/XO产生的超氧物迅速增加了CSLO在无细胞系统中测量的信号(图4). CSLO对HEt与X/XO反应比与H反应更敏感2O（运行）2反应的HEt在30分钟时达到稳定。如果不添加DNA，HEt与超氧物或H反应产生的信号极小2O（运行）2此外，过氧化氢酶对HEt和X/XO反应产生的OH-Et信号没有影响（数据未显示）。因为X/XO同时产生超氧物和氢2O（运行）2这些结果表明，CSLO检测对OH-Et反应产物比乙炔反应产物更为敏感。

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氢乙硫胺的氧化产物。

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用CSLO检测HEt的氧化产物。HEt在含有或不含有DNA的X/XO或过氧化氢的微量离心管中培养。(A类)CSLO上的管子图像。(B类)当HEt与X/XO（正方形）和DNA（固体符号）孵育时，荧光迅速增加。相反，HEt与含有或不含（开放符号）DNA的过氧化氢（圆圈）孵育后，荧光增加最小。

第二种方法确认细胞荧光成像体内HEt注射后由超氧化物产生，使用PEG-SOD，其是细胞可渗透的并使超氧化物歧化。视神经切断后3天，玻璃体内注射PEG-SOD（最终浓度20 U/ml）和HEt。第二天对阳性细胞进行计数。PEG-SOD显著降低了OH-Et阳性细胞/视野的数量（无PEG-SOD眼为5.5±5.7对66.2±11.7；n个= 8;P（P）<0.001），与指示超氧化物存在的荧光一致。仅PEG的浓度就比之前显示的具有神经保护作用的浓度低100倍（Koob和Borgens，2006).

第三种方法用于评估CSLO对视网膜中超氧物与其他活性氧物种的特异性，该方法将CSLO成像中识别细胞的荧光与相应视网膜整体的荧光显微镜相关联。OH-Et和乙炔的激发光谱在中波长（540-580 nm）下相似，但在短波长（370-400 nm）下不同。在～396 nm激发时发出荧光的细胞为OH-Et-阳性，而在560 nm激发时产生荧光的细胞可能为乙炔阳性或OH-Et--阳性。因为我们使用的CSLO不包含可用于短波长激发的激光，所以我们对之前由CSLO成像的全视网膜进行了短波长激发荧光显微镜检查。通过关联单个细胞的荧光，我们可以确定CSLO荧光的细胞是否为OH-Et-阳性（Robinson等。,2006).

用荧光显微镜研究视网膜整体支架上的荧光细胞与CSLO图像上相应细胞的共定位(图5A–C）。可以使用395±5.5 nm激发滤波器检测整个支架上的超氧化物阳性细胞，以特异性激发OH-Et(图6A和B）。使用560±20 nm激发过滤器对乙炔和OH-Et进行非特异性激发。80个（74%）用560 nm过滤器激发时发出荧光的细胞中，有59个在用395 nm选择性过滤器激发时也发出荧光，这表明大多数CSLO阳性的细胞都含有OH-Et、HEt和超氧化物的反应产物。

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根据HEt的CSLO成像显示为荧光的轴切RGC包含OH-Et，HEt和超氧化物的产物，基于HEt的解剖相关性体内和体外通过荧光显微镜研究图像。(A类)覆盖在相应CSLO图像上的全安装视网膜的表观荧光显微镜概述.箭头表示荧光细胞。箭头表示同一船只上用于图像注册的相应位置。(B类)通过落射荧光显微镜成像的全视网膜，使用560±20 nm的激发来检测轴切除RGCs中的乙锭和OH-Et（箭头）。(C类)采用395±5.5 nm的激发，通过外荧光显微镜对全安装视网膜进行成像，以单独检测轴切RGC中的OH-Et（箭头所示）。(D–I型)利用CSLO实现OH-Et的共定标体内(D–F型)或通过荧光显微镜检查视网膜整体(G–I型)用DiR逆行标记RGC。D类和G公司，OH-Et，伪红色。E类和H（H），DiR，伪绿色。(F类)中插图的合并图像D类和E类. (我)的合并图像G公司和H（H）箭头表示位于RGC中的OH-Et。(J型和K（K）)罗丹明结合GSL-I染色的小胶质细胞(J型)可以使用检测罗丹明-GSL-I、OH-Et和乙炔的非选择性滤波器组（560±20激发，630±30发射）检测具有特征形态的小胶质细胞（箭头）。HEt的氧化产物（箭头）出现在这张图片上，但定位在焦平面之外。(K（K）)在同一场中用选择性滤波器组（395±5.5激发，562±20发射）检测OH-Et阳性J型。小胶质细胞对OH-Et不呈阳性。比例尺：50µm。(我)实验流程图A–C,J型和K（K）（顶部）。实验流程图D–I型（底部）。ONT=视神经横断。

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OH-Et可以通过荧光显微镜检测。(A类和B类)在510nm激发的OH-Et（黄色）和乙炔（红色）的发射光谱(A类)和396纳米(B类)，重画自（罗宾逊等。,2006). (A类)当在510 nm激发时，约40%的OH-Et荧光与乙炔荧光重叠。(B类)当在396 nm激发时，只有10%的OH-Et荧光与乙炔荧光重叠。(C类)OH-Et-选择性过滤器（黄色）和非选择性过滤器（红色）的光谱曲线。后者不能区分OH-Et信号和乙炔信号。(D类)通过X/XO或H氧化HEt的产物成像2O（运行）2放在显微镜载玻片上。将OH-Et-选择性（395±5.5 nm）激发滤光片的荧光强度与非选择性560±20 nm激发滤光镜的荧光强度进行了比较。与非选择性过滤器相比，OH-Et-选择性过滤器导致反应产物的荧光发射更多。(E类)经甲萘醌处理的RGC-5细胞通过氧化还原穿梭产生超氧物，与HEt反应。当用1µM或更高浓度的甲萘醌处理时，OH-Et特异性激发导致显著的RGC-5细胞荧光。

为了证实用于视网膜整体支架的荧光滤光片确实对OH-Et具有选择性，进行了两个程序。第一种是成像HEt被X/XO或H氧化的产物2O（运行）2对OH-Et-选择性（395±5.5 nm）激发滤光片和非选择性560±20 nm激发滤光镜的荧光强度进行了比较(图6C） ●●●●。当HEt被X/XO氧化时，OH-Et-特异性与非特异性荧光的比值为0.16±0.01，而当HEt由H氧化时，该比值为0.01±0.0022O（运行）2(P（P）< 0.001;图6D） ●●●●。其次，用甲萘醌（100 nM至100µM）处理RGC-5细胞（一种神经元前体细胞系），甲萘酮通过氧化还原循环（Nguyen）产生细胞内超氧化物等。,2003)，或H2O（运行）2（9.8 mM）培养30分钟。然后用HEt（5µM）孵育30分钟。用OH-Et-选择性和非选择性滤波器组对三个场进行成像，并用ImageJ计算每个细胞的平均信号强度。经1µM或更高浓度甲萘醌处理的RGC-5细胞在OH-Et-选择性过滤器组中产生的荧光显著高于基线水平(图6E） ●●●●。这些实验证实了OH-Et选择性滤光片检测视网膜整体支架上的超氧化物。

移位的无长突细胞占神经节细胞层的很大比例（Perry和Walker，1980). 为了准确测定视网膜中含有OH-Et阳性的细胞室，在右侧视神经横断前5天，通过向两侧上丘注射红外荧光染料DiR，对RGC进行双侧逆行标记。然后在横断术后3天将HEt玻璃体内注射到双眼，次日通过CSLO对视网膜进行成像。OH-Et和DiR图像分别为伪红色或绿色，并合并。CSLO可以观察到具有DiR荧光的单个RGC体(图5E） ●●●●。CSLO与RGC逆行标记对OH-Et阳性的共定位(图5D–F）表示RGC中产生了超氧物。由于在CSLO上从中波长滤波器切换到长波长滤波器需要改变焦距，这会影响空间定位，因此在视网膜整体支架中证实了OH-Et和DiR的共定位(图5G–I）。DiR与OH-Et阳性共定位，表现为核红色荧光，指示RGC中产生的超氧物。因为活化的小胶质细胞也能释放活性氧物种（Dringen，2005)用罗丹明偶联的凝集素GSL-I对整个坐骑进行小胶质细胞染色。OH-Et阳性未与GSL-I阳性小胶质细胞共定位(图5J和K）。

视神经切断后的细胞凋亡体内

Alexa Fluor 488-annexin V用于CSLO（Cordeiro）观察凋亡细胞等。,2004). 膜联蛋白V阳性轴切RGC的数量体内在视神经切断后4～10天，在独立的动物组中进行计数。图7C显示了视神经横断6天后视网膜的合成图像，其中含有膜联蛋白V阳性细胞。对之前CSLO损伤的视网膜的整个坐骑进行荧光显微镜检查，发现RGC的树突和轴突特征（Sievers等。,2003)在膜联蛋白V阳性细胞中(图7D） ●●●●。视神经横断诱导annexin V阳性细胞显著增加，在横断后6天达到峰值（570±53.7对28.8±5.7）；n个=4和6；P（P）= 0.007) (图7B） ●●●●。视神经横断后5-6天的凋亡高峰与之前的发现类似（Cordeiro等。,2004; Koeberle和Ball，1998).

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Alexa Fluor 488-膜联蛋白V阳性视网膜细胞成像体内视神经切断后CSLO检查。(A类)实验流程图。(B类)CSLO观察视神经横断后膜联蛋白V阳性的时间进程。CSLO的膜联蛋白V阳性在视神经切断后6天达到高峰。(C类)使用CSLO的复合模式对视网膜膜联蛋白V成像的概述。(D类)荧光显微镜下对应的视网膜面积，对应于平方英寸C类Annexin V阳性细胞具有RGC所特有的树突和轴突。ONT=视神经横断。比例尺：20µm。

2-羟乙硫基和膜联蛋白V阳性持续时间

研究了超氧化物的OH-Et和细胞凋亡的annexin V这两个标记物的出现和消失动力学。为了评估轴切RGC中OH-Et阳性的持续时间，在三只大鼠服用HEt后每12小时进行一次纵向视网膜CSLO成像。记录连续视野，假彩色，测量单个细胞内OH-Et出现和消失的时间。在研究的124个OH-Et阳性细胞中，73%在12小时后的下一次成像中呈阴性(图8C、 箭头），这意味着这些细胞中的超氧物持续时间<12h。剩余27%的细胞在0和12小时时呈OH-Et-阳性(图8C、 箭头），25%在24小时为阴性，这意味着这些细胞中的超氧物持续时间为12–24小时，2%在24小时呈阳性，但在36小时呈阴性，这表明超氧物存在24–36小时(图8B） 。

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视神经横断后单个细胞内OH-Et或Alexa Fluor 488-annexin V出现和消失的相对动力学。(A类)HEt实验流程图。(B类)在所研究的124个OH-Et阳性细胞中，73%在<12小时（黑色）呈阳性，27%在12-24小时呈阳性，25%在24-36小时呈阳性(C类)玻璃体内注射HEt后，在眼睛视神经切断后每12小时进行一次纵向视网膜CSLO成像。箭头表示12小时后下一次成像时OH-Et阳性细胞呈阴性，这意味着这些细胞中的超氧物持续时间小于12小时。箭头表示一个OH-Et阳性细胞，在24小时后呈阴性，这意味着该细胞中的超氧物持续时间为12-24小时。(D类)annexin V实验流程图(E类)每隔24小时用Alexa Fluor 488-annexin V对眼睛轴切视网膜进行纵向成像。在分析的250个annexin-V阳性细胞中，分别有43、41和16%在24、24–48和48–72小时内保持阳性。比例尺：20µm。ONT=视神经横断。

采用类似方法评估视神经横断后膜联蛋白V的动力学。每24小时对注射Alexa Fluor 488-annexin V的眼睛进行一次轴切视网膜纵向成像。横断后annexinV阳性持续时间的测量方法与OH-Et相同。在分析的250个annexin-V阳性细胞中，43、41和16%的细胞在24、24–48和48–72小时内保持阳性(图8E） ●●●●。这些实验表明，膜联蛋白V在同一细胞中保持阳性的时间比OH-Et长。此外，由于OH-Et阳性峰值（4天）早于膜联蛋白V阳性峰值（6天），这表明超氧物生成先于细胞凋亡。

轴切视网膜神经节细胞凋亡前产生超氧化物体内

进行第二种动力学分析，以阐明轴切断术后超氧化物生成与RGC凋亡之间的关系。对单个RGC进行双重标记和纵向成像。在视神经横断术后3天，玻璃体内注射HEt和Alexa Fluor 488-annexin V的1:9混合物（4µl）。从横断术后4天开始，每天使用和不使用短通（550 nm）滤光片进行视网膜CSLO成像，以区分Alexa Fluor 488-annexin V信号和OH-Et信号。连续的视野对齐，假彩色，并测量OH-Et（红色）或膜联蛋白V（黄色）阳性细胞出现和消失的时间(图9). 一些在横断后4天OH-Et阳性的细胞在第二天变成OH-Et阴性和膜联蛋白V阳性。这种OH-Et消失和膜联蛋白V出现的模式意味着超氧化物的爆发先于这些细胞的凋亡。对两个双标记视网膜的纵向观察显示，在最初OH-Et阳性细胞中，37、42或21%的细胞在1、2或3天后OH-Et呈阳性，随后annexin V呈阳性。这意味着在轴切RGC中，超氧物生成和凋亡之间存在24–72小时的延迟。

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(A类)实验流程图。(B类)Alexa Fluor 488-annexin V（绿线）和OH-Et（红线；由Robinson重新绘制）的光谱发射曲线等。,2006). 黄色区域表示550 nm外部短程滤波器通过并由CSLO传感器检测到的光谱部分（500–650 nm）。红色区域是CSLO传感器检测到的光谱，不带短程滤波器。因此，与Alexa Fluor 488-annexin V相比，当使用550 nm短程滤波器时，OH-Et荧光检测较差。这些结果通过单独注射HEt的大鼠得到了证实。(C类)轴切断后，RGC凋亡之前会产生超氧化物。RGC对OH-Et和annexin V进行双重标记，并在轴切开后4、5和6天进行纵向成像。为了区分Alexa Fluor 488-annexin V发射与OH-Et发射，在有或无短程（550 nm）滤光片的情况下拍摄视网膜CSLO图像。使用短通滤波器，只检测到annexin V（伪绿色）。如果没有短通滤波器，则检测到annexin V和OH-Et（伪红色）。合并显示膜联蛋白V阳性细胞为黄色，OH-Et-阳性细胞为红色。横切后第4天（D4），箭头所示细胞为OH-Et-阳性，第二天（D5）膜联蛋白V-阳性。在横切后第6天（D6），一个细胞变成膜联蛋白V阴性，另一个保持膜联蛋白V阳性。ONT=视神经横断。

超氧化物是轴切开术后视网膜神经节细胞死亡的诱导信号

轴切RGC中的超氧化物生成可能是轴索损伤的附带因素，而不是诱导凋亡的原因。为了评估超氧化物在轴索霉素诱导死亡信号中的功能作用，我们检测了PEG-SOD在视神经切断后减少细胞凋亡的能力体内玻璃体内注射的PEG-SOD（20 U/ml）进入RGC胞体，可检测为SOD-1免疫反应性增加(图10). 在视神经横断术后3天玻璃体内注射PEG-SOD，然后在横断术6天后玻璃体内注射Alexa Fluor 488-annexin V。24小时后计数Annexin V阳性细胞。横断术后7天注射PEG-SOD的眼睛中有109±48个凋亡细胞，而未经处理的横断眼中有492±62个凋亡细胞(n个= 4;P（P）= 0.02). 这表明细胞内超氧化物的减少显著降低了轴切断术后RGC的凋亡。

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细胞可渗透聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD）增加SOD-1的细胞内免疫反应性。(A类)实验流程图。(B类和C类)玻璃体内注射平衡盐溶液一天后，视网膜神经节细胞层出现微弱的结构性SOD-1免疫反应。(D类和E类)玻璃体腔内注射PEG-SOD后1天视网膜神经节细胞层有较强的SOD-1免疫反应。C类和E类与含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚复染的图像合并。ONL=外核层；INL=内核层；GCL=神经节细胞层；ONT=视神经横断。比例尺：20µm。

体内成像可以根据Alexa Fluor 488-dextran逆行标记的单个RGC体的识别能力，对随时间推移的实际RGC数进行连续量化(图11). 视网膜特定区域荧光RGC的相对数量在视神经横断前后通过连续成像进行量化。视神经切断后第7天和第14天，RGC的数量分别减少。玻璃体内PEG-SOD显著保存RGC活性(图11)分别在横断后7天和14天。

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细胞渗透性聚乙二醇化超氧化物歧化酶（PEG-SOD）可减少轴切术后RGC死亡。先前用Alexa Fluor 488-右旋糖酐逆行标记的RGC通过视神经横断进行轴切并进行纵向成像体内. (A类)实验流程图。(B类)未注射视网膜干细胞横断术后与横断前的存活率比较(n个=7，白色），眼睛玻璃体内注射平衡盐溶液(n个=8，黑色），眼睛注射PEG-SOD(n个=7，灰色）*P（P）< 0.05. (C类)使用Alexa Fluor 488-右旋糖酐的RGC系列图像。ONT=视神经切断；D=天。

讨论

共焦体内利用固有透明光学介质对视网膜进行成像是研究生物过程随时间变化的有力方法，并有可能检测细胞损伤的早期事件，作为评估疾病进展和治疗干预效果的生物标记物。这些数据表明，轴切术诱导轴切RGC细胞内超氧化物的爆发，早在视神经切断后24小时开始，4天达到峰值。无论是在群体还是单细胞的基础上，超氧化物的增加都发生在细胞凋亡前24-48小时，这是由细胞膜磷脂酰丝氨酸的外化所定义的。最后，细胞内超氧物的增加是轴切断术后细胞凋亡的信号，因为PEG-SOD清除超氧物既降低了RGC中的超氧物水平，又延缓了视神经切断后RGC的死亡。使用多激光共焦检眼镜可以同时检测细胞信号转导事件和识别细胞类型。

据我们所知，这是第一份证明细胞内超氧物可以作为神经细胞轴切断后死亡的信号的报告体内.我们以前的研究使用在体外在电镀后的前24小时内以及持续7天内，视神经挤压后的制剂显示超氧物增加（Lieven等。,2006). 这些研究被视网膜分离的影响所混淆，视网膜分离本身会导致近端RGC轴切开。目前的研究表明，轴切术后不仅会产生超氧物体内而且它先于细胞凋亡，使其成为潜在的上游生物标志物。

我们使用了几种方法来证明我们是在成像超氧化物，而不是另一种活性氧物种。尽管HEt经常用于成像超氧化物（Bindokas等。,1996; 德格利·埃斯波斯蒂，2002)，它可以被超氧化物以外的活性氧物种氧化，例如H2O（运行）2和过氧亚硝酸盐（赵等。,2003). 化学或酶促生成的超氧物与HEt反应生成OH-Et，这是一种荧光产物，不同于HEt的双电子氧化产物乙炔。OH-Et与乙炔的分子量不同，这可以作为高效液相色谱鉴别的基础（赵等。,2005). 然而，RGC仅占视网膜的一小部分，快速将RGC-HEt产物与其他细胞分离是不切实际的。OH-Et的最大发射波长为567nm，而乙锭的最大发射波长为610nm。不幸的是，当在同一波长下激发时，OH-Et和乙炔的发射荧光光谱有足够的重叠，从而模糊了它们的区别。相反，我们利用了最近的观察结果，即OH-Et具有集中在396 nm左右的独特激发波长光谱，这在HEt的其他氧化产物中是不存在的（Robinson等。,2006). 我们表明，OH-Et是由HEt与超氧物反应生成的，而不是与H反应生成的2O（运行）2.体内CSLO对动物进行成像，然后使用OH-Et特异性激发过滤器对相应的视网膜整体支架进行组织学检查，结果表明CSLO上识别出的单个细胞的荧光与HEt的超氧产物相对应。

其他方法用于显示细胞内信号是超氧物。PEG-SOD特异性清除细胞内超氧化物体内（谢里夫等。,2006). 玻璃体内HEt和PEG-SOD后荧光降低表明，与HEt反应的大多数活性氧物种是超氧化物。这些结果与超氧化物作为细胞内信号分子并启动细胞凋亡相一致，类似于神经生长因子衍生的神经元细胞（Greenlund等。,1995; 柯克兰等。,2007). 超氧物的增加不太可能是轴切开引起的线粒体功能障碍的副作用，例如细胞色素的作用c（c）释放（张等。,2003)或半胱天冬酶激活（Ricci等。,2003)，因为在单细胞水平上，超氧化物爆发先于轴切RGC的凋亡。这与作为信号而非凋亡结果的超氧化物生成更为一致。

活化的小胶质细胞是活性氧物种的有效来源（Dringen，2005). 视网膜小胶质细胞的激活峰值出现在RGC轴切开术后12天，因此在RGC死亡峰值之后（Garcia-Valenzuela等。,1994,2005; 索布拉多·卡沃等。,2007). 然而，有可能在轴切断后早期有少量小胶质细胞被激活，即使我们将超氧物定位于逆行标记的RGC，相邻的小胶质细胞或吞噬凋亡RGC逆行标记物的小胶质可能是真正的来源。为了解决这种可能性，我们在视神经横断术后4天，即超氧物生成的高峰，用小胶质细胞标记物GSL-I对视网膜整体进行染色。当时不仅小胶质细胞很少，而且它们没有与OH-Et共定位，这表明小胶质细胞不是超氧化物的重要来源。

利用CSLO连续成像技术分析视神经切断后单个细胞内视网膜超氧化物的出现和消失动力学。大多数细胞的OH-Et保持时间<12小时，但实际时间可能较短，因为角膜遮蔽阻碍了以较短的间隔获取图像。一小部分在长达36小时的时间内保持阳性，这可能反映了在没有超氧物的情况下OH-Et的持续存在。Annexin V阳性细胞保持荧光的时间更长，这与Cordeiro及其同事的观察结果一致(2004). 与膜联蛋白V阳性细胞相比，在任何给定时间，荧光持续时间的差异将导致OH-Et阳性细胞数量相对较少，这与导致大多数（如果不是全部）RGC凋亡的超氧物生成一致。此外，CSLO对低荧光水平的敏感性限制可能会低估可见OH-Et-阳性或膜联蛋白V阳性细胞的总数。

线粒体是产生超氧物的主要场所（Cadenas等。,1977; 霍格等。,2008). 我们以前的在体外使用MitoSox Red和电子传递链抑制剂的研究表明，RGC轴切断后产生超氧物的来源可能是线粒体（Lieven等。,2006). 因此，我们推测线粒体产生的超氧化物由体内但由于OH-Et荧光通过与核DNA结合而大大放大，CSLO的分辨率仅在细胞水平，因此我们无法确定这一点。根据Cordeiro及其同事的发现，我们使用了一种单一的凋亡标记物，即磷脂酰丝氨酸的外化(2004)这伴随着损伤RGC中caspase 3的激活。更接近的标记，如细胞色素c（c）释放可能先于产生超氧物，尽管如果这是真的，那么这并不能解释细胞内传递SOD阻止RGC轴切术后死亡的能力。

总之，视神经横断导致RGC衍生的超氧物爆发，可以通过实时共焦成像在活体动物中进行评估。直接体内观察结果表明，在已鉴定的RGC中，超氧化物的升高先于细胞凋亡，并且清除超氧化物可以防止视神经切断后RGC的损失。这些发现与RGC轴切断后作为细胞凋亡信号的细胞内超氧化物爆发相一致，并增加了在凋亡前早期检测轴突损伤的可能性，这可能对视神经病变患者具有临床实用价值。

基金

这项工作得到了加拿大卫生研究院（MOP 84211）、加拿大创新基金会、加拿大研究主席计划、国立卫生研究院对L.A.L.的资助（资助编号：R21EY017970号)以及蒙特勒大学光学研究基金会。

致谢

作者感谢Santiago Costantino博士在成像方面的技术建议。

词汇表

缩写

CSLO公司共焦扫描激光检眼镜
DAF-FM公司4-氨基-5-甲氨基-2′，7′-二氟荧光素
DiR公司1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚三碳菁碘化物
GSL-I公司 单叶灰树凝集素I
HEt公司氢乙硫胺
OH-Et（OH-Et）2-羟基乙硫醚
聚乙二醇-超氧化物歧化酶聚乙二醇与牛红细胞超氧化物歧化酶偶联
RGC公司视网膜神经节细胞
X/XO黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶

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文章来自大脑由以下人员提供牛津大学出版社