靶向哺乳动物内质网的TA蛋白的最后一步由TRC40（也称为Asna1）介导2，4该因子通过其TMD直接与TA底物相互作用，并通过假定的受体靶向ER膜，以ATP酶依赖的方式释放TA蛋白以插入脂质双层。TRC40的酵母同源物，称为Get3，与其ER受体Get1和Get2（3）以及细胞溶质因子Get4和Get5（5-10）一起发挥类似的功能。在这两种情况下，TRC40/Get3必须通过识别疏水性TMD选择性高效地捕获TA蛋白，该TMD容易聚集、不适当的相互作用或被其他伴侣隔离。
为了研究TRC40如何有效捕获其TA蛋白载体，我们重新构建了这个事件在体外并分析了其需求(补充图S1)。在胞质部分存在的情况下，用嘌呤霉素释放含有tRNA束缚的TA蛋白（Sec61β）的蔗糖梯度纯化核糖体新生链（RNCs）。通过交联分析TRC40对放射性标记Sec61β的捕获。正如预期的那样，TRC40以TMD依赖和能量刺激的方式捕获释放到完整细胞液中的Sec61β。令人惊讶的是，大小分级细胞液中的TRC40无法捕获Sec61β，而Sec61β与我们暂时称为p38的未知蛋白交联(补充图S2)。TRC40捕获可以通过添加一个缺失的分数来恢复。进一步分馏证实，这种“捕获-刺激”因子与TRC40不同(补充图S3)。因此，TRC40在复杂环境中高效捕获底物需要额外的蛋白质因子，缺少该因子会导致与非TRC40蛋白质（例如p38）的底物相互作用，尽管TRC40可用。
我们假设捕获物刺激因子可能是向TRC40传递底物的中介体。这种因子应以TMD依赖的方式识别TA底物，在含有“捕获-刺激”活性的组分中发现，并且在TRC40饱和时更容易观察到。对完全细胞溶质中过度生成Sec61β的交联分析显示，两个相互作用的伙伴分别为~120 kD和35 kD，符合这些标准(补充图S4)。我们早期从大规模翻译反应中对Sec61β进行亲和纯化2包含约120 kD的相关产物（除了主要的TRC40带外），我们通过质谱鉴定为Bat3（也称为Scythe/Bag6）(补充图S5)。从网织红细胞裂解物中纯化的Bat3亲和力与~18kD和35kD的蛋白质共同纯化()我们通过质谱鉴定为Ubl4A和C7ORF20，因此我们建议将其命名为TRC35(补充图S5)。针对Bat3、Ubl4A或TRC35的抗体可以共同免疫沉淀其他两种成分，其中任何一种成分的亲和力缺失都会导致其他两种蛋白质的大量缺失(补充图S6)。因此，Bat3是胞质溶胶中稳定的异源三聚体复合物的一部分。
TMD相互作用蛋白复合物的鉴定一，显示了结合并从抗Bat3或抗GFP（对照）亲和柱洗脱的胞浆蛋白。HC和LC是IgG重链和轻链。b条在网织红细胞裂解液中翻译Sec61β（WT）、缺失其TMD（ΔTMD）的缺失构建体或插入不足的3R突变体，在抗Sec61β柱上纯化亲和力，并对指示产物进行免疫印迹。将总裂解物包括在内进行比较。斑点的放射自显影显示三种翻译底物的回收率相等。c（c）Sec61β的交联产物（来自混合蔗糖梯度组分6-9英寸补充图S4)在变性或自然条件下免疫沉淀。非免疫血清（N.I.S）作为对照。d日，通过体外翻译、交联和免疫沉淀分析含有来自指示蛋白质的TMD的Sec61β版本与Bat3和TRC40的相互作用。显示了每个底物（“底物”）以及交联反应的免疫沉淀产物的总转化反应的等分。e（电子），Sec61β的TMD发生突变，以改变其疏水性，如图所示。（f），分析每个结构与Bat3复合物和TRC40的交互作用b条通过放射自显影术分析总翻译产物的一小份，以可视化底物。
Bat3复合物与TA蛋白的TMD依赖性相互作用通过从在体外翻译反应()。此外，依赖TMD的~120 kD和35 kD交联到Sec61β(补充图S4)在分别用抗Bat3和抗TRC35抗体变性的条件下，或在非变性条件下用抗Ubl4A抗体特异性免疫沉淀()。通过交联对额外TA蛋白TMD的分析表明，TRC40和Bat3复合物均与靶向ER的VAMP2和Sed5 TMD相互作用，而与自发插入细胞色素b5（Cb5）或线粒体靶向Fis1或F1L的TMD均无相互作用()。这些底物之间TMD疏水性（长度或最大疏水性）的差异似乎是一个关键决定因素，因为改变Sec61βTMD疏水度以匹配Cb5、Fis1或F1L的疏水性，显著减少了与Bat3复合物和TRC40的相互作用(;补充图S7)。因此，Bat3复合物直接与几种ER-靶向TA蛋白的TMD相互作用，其底物特异性与TRC40相似。
我们推测，Bat3复合物负责TRC40高效底物捕获所需的刺激活性。在细胞溶质部分，Bat3免疫缺失（约95%）（也会耗尽Ubl4A和TRC35，而不会影响TRC40水平；和补充图S6)，TRC40对Sec61β的捕获减少，同时p38的捕获增加()；TRC40免疫耗竭后也观察到类似的效果，其中p38是主要的可溶性相互作用伙伴。用亲和纯化的Bat3复合物（使用抗TRC35抗体制备）将去除Bat3的提取物补充至原始水平(补充图S8)]完全恢复的TRC40捕获活动()。Bat3缺失对TRC40底物捕获的影响不仅仅是RNC释放试验的结果，因为在Bat3缺失的网织红细胞裂解物中全长TA底物的翻译也显示TRC40相互作用减弱，p38相互作用增加(补充图S9)。因此，TRC40在TA蛋白质从核糖体中释放出来时，需要Bat3复合物才能最大限度地高效捕获TA蛋白质。这些发现与最近的观察结果一致，表明Bat3的缺失会损害TRC40依赖性TA蛋白的插入11.
Bat3复合物通过TRC40介导底物捕获a、，将翻译提取物传递给抗GFP（对照）、抗Bat3或抗TRC40亲和树脂，并通过免疫印迹分析不同数量的每种耗尽的裂解物。b中，底物捕获分析使用总细胞溶质或细胞溶质免疫耗竭（“Δ”）和指示的亲和树脂。在此分析中（请参见补充图S1)，用嘌呤霉素释放放射性标记的Sec61βRNC，通过交联评估TRC40的捕获。显示了显示TRC40-Sec61β交联的凝胶部分。TRC40未能捕获底物通常导致38kD蛋白质（p38）捕获。“回补”通道是用亲和纯化的Bat3复合物（使用抗TRC35树脂制备；补充图S8)三种浓度跨越原始细胞液中的浓度。“模拟”回加样品是平行制备的，但使用了不相关的亲和树脂（抗GFP）代替TRC35亲和树脂(补充图S8)。第一道显示了缺乏交联剂的反应（XL）。每个反应的等分样品（交联前）也通过针对Bat3和TRC40的免疫印迹分析，以记录其在反应中的相对量。
尽管Bat3、Ubl4A和TRC35的生物化学功能尚不清楚，但后两种蛋白质在酵母中具有可识别的同源物（分别为Mdy2/TMA24/Get5和Yor164C/Get4），这些同源物已通过最近的生物化学、结构和遗传学研究进行了分析5-7，12，13.Get4和Get5形成稳定的复合物，可以与酵母TRC40同源物Get3相互作用5，7-10，12，13。Get4和Get5的缺失菌株出现现象复制Get1、Get2或Get3缺失5-7，所有五个基因在合成遗传相互作用阵列中聚集在一起5，7。这些观察结果表明Get4和Get5在Get3之前的一个步骤中插入TA，但其功能尚不清楚。
鉴于Bat3复合物促进TRC40-底物相互作用，我们假设Bat3复合体可能在核糖体捕获TA底物并将其转移到TRC40。这种模型要求Bat3复合物位于核糖体或其附近。事实上，含有TA蛋白的亲和纯化RNC在Bat3复合物中相对于空核糖体显著富集()。定量分析表明，Bat3复合物和SRP分别占含TMD RNC的~27%和~7%()。相比之下，用相同方法分离的真正SRP底物上的SRP占用率约为30%（参考文献。14;补充图S10)。值得注意的是，在含有突变TMD的空核糖体和RNC中观察到的Bat3复合物占用率<5%，说明了Bat3复合体招募的底物选择性。我们确认，我们的亲和纯化RNC制剂是tRNA相关的，这是根据它们对碱性水解和十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）选择性沉淀的敏感性来判断的(补充图S11)。还发现使用磁珠“上拉”策略选择性富集TA蛋白RNC上的Bat3复合物，以最小化聚集物的非特异性回收(补充图S12)。因此，如建议的SRP14当功能性TMD位于核糖体内时，Bat3复合物似乎被招募到核糖体中。
Bat3复合物捕获核糖体上的底物以转移到TRC40a、，在天然条件下从网织红细胞裂解物中纯化核糖体，并通过免疫印迹分析TRC40、Bat3、Ubl4A和SRP54。大约30-50%的SRP、2-5%的Bat3复合物和检测不到的（<1%）数量的TRC40是核糖体结合的。b、，通过免疫印迹分析Sec61β、缺乏TMD的版本（ΔTMD）和3R突变体的亲和力和大小纯化的RNC（来自60ul翻译反应）。为了进行比较，分析了0.5 ul翻译裂解物。L9是一种核糖体蛋白。放射自显影术证实每个基质的回收率相等。c、，核糖体、Ubl4A和SRP54的数量在总裂解物、纯化的空核糖体或纯化的RNC制剂中进行量化。图中显示了SRP54和Ubl4A的数量，归一化为100个核糖体，从多个独立纯化中平均得出（空核糖体n=3，Sec61β-RNC n=7，β（3R）-RNC n=6）。日期：，缺乏或补充重组斑马鱼TRC40的TRC40缺失裂解液中Sec61β的翻译被迅速稀释、交联，并通过离心分离成可溶性和核糖体部分。Sec61β、Bat3交联（用抗Bat3免疫沉淀）和TRC40交联显示在总（T）、可溶性（S）和核糖体（P）组分中。e、，缺乏或稳定过表达HA标记的人TRC40的HT1080细胞的细胞溶胶部分与抗HA树脂结合，并用TEV蛋白酶选择性洗脱（在HA标记和TRC40之间裂解）。通过免疫印迹分析Bat3、TRC40或SGTA（一种对照蛋白），分析洗脱产物和起始裂解物。注意，内源性TRC40存在，但在印迹暴露时不可见。当用HA肽而不是TEV蛋白酶洗脱亲和柱时，获得了相同的结果（数据未显示）。
对各种TMD从隧道内向核糖体招募Bat3复合物和SRP的能力的分析表明，它们与疏水性有普遍的相关性，而真正以ER为靶点的TMD（来自Sec61β、VAMP2和Sed5）的招募率最高(补充图S10)。然而，严格的一致性似乎不太可能，因为中等疏水性的Sec61β突变体（3A3G）在翻译后不能与Bat3复合物相互作用()尽管如此，还是通过调节核糖体内部的募集(补充图S10)。有趣的是，Bat3复合物没有与核糖体醚化底物交联(补充图S13)但仅在用嘌呤霉素释放或翻译终止时。这与SRP相反，SRP与核糖体上的底物接触，但在释放后不接触。因此，合成含TMD蛋白质的核糖体可以在TMD出现到细胞溶质之前的某个阶段招募SRP和Bat3复合物。在进一步翻译过程中，这两种复合物都留在核糖体上(补充图S10)但在底物释放后，只有Bat3复合物以TMD依赖的方式保持关联。因为SRP招募的变化不会影响RNC上Bat3的恢复，所以这两个因素可能不会相互竞争。然而，由于Bat3复合物的结合位点未知，这一点尚待确定。
在TA蛋白释放之前，Bat3复合物选择性募集到核糖体，这表明这可能是初始底物捕获的位置。因此，我们在TRC40缺失时寻找底物Bat3-核糖体中间产物。在TRC40缺失的裂解液中翻译的Sec61β约70%与核糖体相关，可与Bat3交联()。当重组TRC40包含在耗尽的翻译提取物中时，核糖体部分中Sec61β的比例降低到约30%，与Bat3的交联丢失，可溶性部分中的Sec61β交联到TRC40。非核糖体Sec61β-Bat3复合物也可以将底物转移到TRC40，因为该组分与含TRC40的组分孵育会导致Bat3交联减少，同时TRC40交联增加（数据未显示）。因此，Bat3复合物被招募到核糖体中，在那里它可以在翻译终止时与TA底物相互作用。这种假定的Bat3底物中间体，无论是在核糖体上还是在溶液中游离，都会转化为生产性Sec61β-TRC40靶向复合物。与此模型一致，Bat3和TRC40可以在无洗涤剂条件下通过共同免疫沉淀作用进行相互作用().
Bat3向RNCs的募集仅限于TMD合成和核糖体释放之间的时间段()这是一个似乎非常短暂的时间窗口。为了解释这个难题，我们通过执行TA蛋白合成的时间过程，结合用CTAB选择性沉淀tRNA-相关多肽来测量招募窗口。可用于蝙蝠3复合体募集的Nascent链几乎是全长的，但仍含有共价tRNA。在验证了与tRNA相关的全长物种可以选择性回收后(补充图S14)，我们量化了Sec61β合成过程中该人群的数量。在这个时间过程的5分钟内（首次检测到全长Sec61β链后约2分钟），CTAB沉淀了显著50%的全长Sec61()。随着翻译终止的发生和Sec61β链的积累，这一比例逐渐降低。实验数据与理论预期的比较(补充图S15)估计a t1/2第61节β终止约1分钟。
TA蛋白的翻译终止延迟a、，Sec61β合成示意图表明，能够招募Bat3复合物的新生链将接近全长，并包含共价相关tRNA（红星）。这种招募竞争性多肽应该在接近全长大小的凝胶上迁移，但会被CTAB沉淀，CTAB会选择性沉淀tRNA相关蛋白。b、，在网织红细胞裂解物中于25°C合成的Sec61β和Sec61β（ΔTMD）（均在C末端用相同的12个残基表位标签标记）的时间过程。在每个时间点，直接或在CTAB沉淀后分析样品。绘制了CTAB沉淀的全长多肽的总比例。虚线表示理论预期(补充图S15)对于t1/215秒和60秒的平移终止。c、，TA蛋白质通过预靶向中间体从核糖体穿梭到TRC40的模型，涉及Bat3复合物向核糖体的募集。
值得注意的是，Sec61β-ΔTMD（缺乏TMD）在每个时间点显示的tRNA相关多肽明显较少()对应于终止t1/2重要的是，两种结构的最后12个密码子（包含一个表位标签）是相同的，这与肽基转移酶中心附近残基的差异是终止率差异的基础相矛盾。我们测量的对照底物（Sec61β-ΔTMD）的平移延伸率（约1.5-1.8秒/残基）和约10倍较慢的终止率（相对于延伸率）与使用相同体外系统的早期估计一致15然而，Sec61β的异常长终止率表明TMD减缓了这种反应。Sec61β的终止延迟幅度（~1min）与在相同系统中类似条件下测量的SRP介导的伸长“停止”相当16这为Bat3综合体如何有足够的时间招募到隧道内包含TMD的RNC提供了一个合理的解释。调节终止的序列参数尚待确定，但鉴于早期的研究显示相对亲水序列具有类似的终止延迟，因此不太可能是简单的疏水性17.
我们的发现解释了TA蛋白的疏水性TMD在传递到ER膜的过程中如何安全地被屏蔽，避免不适当的相互作用和聚集()。我们的工作模型假设TMD在整个靶向过程中被屏蔽，首先是核糖体，然后是Bat3复合物，最后是TRC40。这些复合物之间的基质顺序切换可能受到严格控制，以防止TMD暴露于水溶液中。也许Bat3复合物调节TRC40的核苷酸循环和/或构象，以促进其与底物的结合。根据Get3（18-22）最近的晶体结构，有效的底物负载可能需要核苷酸依赖的从“开放”构象到“闭合”构象的转变18，19这也许得益于蝙蝠3复合体。在没有这种活性的情况下，TRC40的捕获速度较慢，这解释了为什么它在存在竞争性细胞溶质因子的情况下不能有效运行，但在纯化的系统中可以管理（数据未显示）。
因此，Bat3复合物在TA蛋白靶向中的作用可能不是绝对必要的23，但会提高保真度和效率。这种功能似乎是高度保守的，因为酵母有一个同源复合物（Get4和Get5），它显示了与Get3的遗传、物理和功能相互作用5-10，12，13，其缺失可能导致TA蛋白的聚集和部分定位错误5-7因此，Bat3复合物似乎代表了作用于核糖体的保守TMD选择性伴侣。Bat3复合物在核糖体上的结合位置，当TMD位于核糖体隧道内时它是如何被招募的，以及它的功能是如何与包括SRP在内的其他几个核糖体相关因子协调的24、NAC25和RAC26，仍然是未来研究的重要问题27.
