在表达致癌Kras的小鼠中，急性胰腺炎显著加速胰腺癌的进展

摘要

介绍

胰腺导管腺癌（PDAC）是美国第四大癌症相关死亡原因，中位生存期为6个月[1]. PDAC通常被认为主要通过胰腺上皮内瘤变（PanIN）的进展而发生，从低级别PanIN（称为PanIN1A，-1B）到高级别PanIN（称为PanIN-2，-3），再到导管腺癌[2]. PDAC的特征是早期KRAS突变频率高，并且随着时间的推移会积累多种额外的遗传异常[三]. 通过靶向条件突变的Kras等位基因（Kras^G12D系列)使用Pdx1（PK模型）和Ptf1a启动子对早期胰腺祖细胞，然后对所有类型的胰腺细胞，强调致癌Kras足以启动PDAC[4]. 在这些模型中，米小鼠PanIN（mPanIN）的形成和进展忠实地再现了在人类PDAC中观察到的情况，并且在以后的生活中（8-12个月大的小鼠），这些小鼠模型发展为胰腺癌。

最近的研究表明，在胚胎发生期间，胰腺腺泡（以及一个模型的中心腺泡）细胞中致癌Kras的激活足以启动PDAC[5] [6] [7]慢性胰腺炎加速了PDAC的发展[5]. 在两个小鼠模型中，成年腺泡细胞中Kras致癌激活足以启动PanIN的形成，但一年后未观察到胰腺癌[6;7]. 然而，在另一个模型中，成年腺泡/中心腺泡细胞中致癌Kras的激活产生PDAC，但只有当小鼠在数周内给予高剂量的氯化物时，才会导致慢性胰腺炎样状态，伴有严重的纤维化和炎性细胞浸润[5]. 在小鼠身上的这些结果与流行病学研究一致，研究表明慢性胰腺炎患者患胰腺癌的风险增加16倍[8].

我们现在显示，PK小鼠模型在经历两次短暂的急性胰腺炎发作（不会诱发慢性胰腺炎样改变）后，迅速发展出高水平的PanINs，并表现出加速PDAC形成。

材料和方法

结果

急性胰腺炎导致病变进展

本研究中使用的小鼠模型是PK模型，其中Pdx1驱动的Cre重组酶开始在早期胰腺祖细胞中表达[10]. 在Cre介导去除LoxP位点（LoxP-stop-LoxP或LSL）包围的转录停止区后，突变的Kras等位基因在这些祖细胞中激活，随后在所有胰腺细胞类型中激活[4;13]. 到2个月大时，PK小鼠发育出数量有限的低级mPanINs，以及非常有限的腺泡到导管化生（ADM）区域。在6个月大时，观察到病变数量增加，但分级没有增加，同时出现广泛的ADM病变。经过8-12个月的滞后期后，这些动物偶尔会患上胰腺癌[4].

为了确定急性胰腺炎是否能加速mPanIN的进展和PDAC的形成，突变小鼠接受了由胆囊收缩素（CCK）类似物caerulein诱导的2次急性胰腺炎，该类似物结合并激活CCK受体[11;14]. 尽管事实上，与其他出版物中使用的剂量相比，我们在实验环境中使用的青霉素的剂量（50 ng/g体重/次注射，通过7次腹腔注射给药，48小时后重复给药）相对较低（100–400 ng/g重，2次8次注射）[15] [16]，我们观察到急性胰腺炎，在最后一次注射蓝绿色素后几小时出现明显水肿。不同时间点采集的胰腺切片的H&E染色显示，在24小时时，存在重要的炎症浸润，腺泡细胞迅速死亡，而一周后观察到胰腺完全再生（未显示），如所述[15]. 三组5-8只2至3个月大的PK突变动物接受了两次急性胰腺炎发作，并在30、60和80天后处死。早在两次急性胰腺炎发作后的1个月，所有经氯霉素治疗的PK胰腺均出现大量高级别mPanINs(图1C-D)以及广泛的ADM(图1B)而未经治疗的PK胰腺仅表现为孤立的低度病变和有限的ADM(图1A). 在所有接受过氯霉素治疗的对照动物中，无论有无突变，胰腺似乎都是正常的，在治疗后1个月偶尔出现炎症细胞（未显示）。到60天时，没有证据表明存在残余炎症。这些数据使我们得出结论，即使在没有慢性胰腺炎的情况下，两次急性炎症也会导致胰腺肿瘤快速进展，但仅在Kras致癌激活的情况下。

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图1

急性胰腺炎发作2个月后PanIN进展。未经治疗（A）和经氯霉素治疗的NK胰腺（B–D）的H&E染色。未经治疗的胰腺显示罕见病变（A），而经治疗的胰脏显示广泛ADM和大量mPanIN-1（B），以及高级别病变mPanIN-2（C）和-3（D）。岛屿（虚线轮廓）、正常管道（d）、mPanIN-1（空箭头）和mPanIN-2和-3（实心箭头）很容易看到。比例尺：A–B为100μm，C–D为20μm。

正如在人类PDAC中观察到的那样，虽然mPanIN-1病变显示出较低的增殖指数，但mPanIN-2和-3的增殖增加，Ki67染色增强证明了这一点(图2A). mPanINs还表达细胞角蛋白19（CK19），突显其上皮性质(图2B)Muc5a表达显示粘液堆积(图2C). 高粒度PanINs也显示Notch信号标记Hes1(图2D)和早期胰腺祖细胞标记物Pdx1(图2E)这两种药物均在PDAC早期被重新激活。ADM也被观察到，如腺泡（淀粉酶）和导管（CK19）标记物在相同细胞中的共同表达所示(图2F)正如其他人所观察到的[17].

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图2

急性胰腺炎后的高级PanIN特征。Ki67染色显示，与mPanIN-1相比，高级病变（a）的增殖明显增加（*）。高颗粒蛋白表达CK19（B）和Muc5a（C）。早期祖细胞Hes1、D组）和Pdx1（E组）的标记被重新激活；如预期，Pdx1也可见于胰岛细胞（虚线轮廓）。如CK19（绿色）和淀粉酶（红色）在同一细胞中共表达所示，可以观察到ADM（参见插图）。比例尺：20μm。

在接受AP的三组小鼠中，来自盲囊素治疗后80天组的两只PK动物出现PDAC。癌细胞呈局部浸润性，癌细胞呈导管样形态(图3A)并显示出扩散加剧(图3B). 此外，癌细胞的病灶被以平滑肌肌动蛋白（SMA）表达为特征的反应性基质所包围(图3C)表明存在活化的胰腺星状细胞。

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图3

PK小鼠在急性胰腺炎后发生PDAC。导管腺癌（A）的H&E染色显示许多细胞核增大、多形且密集，癌细胞呈导管样形态。如Ki67表达（B）所示，腺癌细胞高度增殖。它们被以SMA表达为特征的成纤维细胞包围（C）。比例尺：20μm。

讨论

Caerulein-induced acute pancreatitis是一种研究很深入的动物模型，在该模型中，Caerulein通常会导致轻度水肿性胰腺炎，这是一种自限性和高度重复性的胰腺炎。在该模型中，急性胰腺炎的发病是通过腺泡细胞内酶原的细胞内过早激活介导的，导致腺泡细胞死亡和与轻度胰腺水肿相关的炎症反应[18]. 虽然许多腺泡细胞在这一过程中丢失，但由于强大的腺泡再生反应，在大约一周的青霉素治疗后，胰腺功能完全恢复。

在本研究中，我们确定PK小鼠模型中的两次急性胰腺炎会显著加速高水平mPanINs的形成、Notch信号的重新激活以及向PDAC的进展。对氯霉素诱导的急性胰腺炎后事件的广泛描述表明，急性胰腺炎发作后24小时内，大量腺泡细胞发生凋亡，一周后，腺泡室完全再生[15]. 相比之下，导管、中心腺泡或内分泌细胞的凋亡或增殖没有增加[15]. 急性胰腺炎也会导致诸如Notch和Hedgehog等信号通路的快速激活，这在PDAC早期病变中被上调[15;19]. 综上所述，这些观察结果表明，急性胰腺炎诱导的腺泡细胞再生和关键信号通路的相关改变，以及致癌Kras激活，共同显著增加了胰腺恶性转化的倾向。因此，我们的研究结果表明，PanINs和PDAC可能来自外分泌胰腺的腺泡细胞室。

最近的几份报告支持腺泡细胞可能导致PDAC的概念。首先，通过使用弹性蛋白酶或Mist1启动子来表达Cre，限制腺泡细胞（在某些情况下还有中央腺泡细胞）中突变的Kras等位基因的激活，导致成年小鼠的mPanIN发育[6;7]和罕见的侵袭性PDAC[5]. 第二，激活Kras^G12D系列在Nestin谱系中，主要由腺泡细胞组成，导致mPanINs的发育，其数量和等级与PK模型中的相似[20]. 第三，在携带活化Kras的小鼠中，连续数周反复注射蓝绿色素诱发的慢性胰腺炎会导致PDAC进展^G12伏成人腺泡/着丝粒细胞的等位基因[5]. 第四，导管细胞、ADM病变和胰岛细胞显示纤毛；相比之下，在人类和小鼠模型中，胰腺腺泡细胞、所有级别的PanINs和胰腺癌细胞的特征是没有纤毛[21]表明PanINs、PDAC和腺泡细胞有共同来源。此外，血统追踪实验表明，新的腺泡细胞来源于先前存在的腺泡[16;22;23]. 综上所述，这些观察结果支持这样一种假设，即在激活突变的Kras等位基因背景下，胰腺损伤（如急性胰腺炎发作）诱导腺泡细胞增殖，可导致PDAC的生长和进展失控。

人类急性胰腺炎的恢复不一定导致不可逆转的损伤，并且与胰腺再生有关[24]. 在西方国家，急性胰腺炎最常见的病因是胆结石和饮酒[25]. 大量饮酒，与慢性胰腺炎无关，与PDAC发病率增加有关[26]. 可以想象，酒精可能通过诱发急性胰腺炎来发挥这种作用。然而，目前尚不清楚这种短暂的急性胰腺炎发作是通过促进胰腺中的促炎环境、诱导腺泡细胞再生爆发，还是通过上调参与胰腺胚胎发育和PDAC的信号通路和转录因子发挥作用[15]. 无论机制如何，如果在未来的研究中得到证实，本研究结果表明，预防急性胰腺炎可能是降低PDAC发病率的重要策略。

致谢

参考文献