Krüppel关联box（KRAB）域是最强大且分布最广的域之一哺乳动物中的转录抑制域(1,2); 它据估计，大约三分之一的300至700人Krüppel的锌指蛋白（ZFPs）Cys公司2伊斯2-类型包含N端的KRAB域(三)。该监管领域包括≈75个氨基酸，由两个相邻的模块组成，即KRAB-A盒子和KRAB-B盒子(三)，每个由单独的外显子编码(4,5)。什么时候？融合到异源DNA-结合域（DBD），KRAB-a盒沉默转染细胞中的基础转录和激活转录剂量依赖性方式和远距离(1,2,6,7)。这个转录沉默最近在分子水平上被联系起来通过物理演示实现染色质重塑几个不同KRAB域与转录中介因子1（TIF1）β，一种转录因子共升压因子参与异染色质介导的调节(8——10).TIF1β，也称为KAP-1(11)或KRIP-1(12)，被演示给与许多KRAB结构域相互作用，但不与缺乏镇压，以加强KRAB介导的镇压，并保持沉默直接与DNA连接时的转录(11——13)。这种沉默活性需要组蛋白去乙酰化(9)可能是由于组蛋白去乙酰化酶复合物的招募，称为N-CoR-1(14),和/或TIF1β与异染色质蛋白1（HP1）家族(9,10)，一类非组蛋白具有良好表观遗传基因沉默功能的蛋白质（有关审查，请参阅参考。15).
TIF1β是一个蛋白质家族的成员(8)还包括TIF1α，一种推测的核受体辅因子(8,16,17)和TIF1γ，其功能未知(18)。这些蛋白质由存在两个保守氨基酸区域：N末端RBCC（RINGKRAB-TIF1β中涉及的手指、B盒、线圈）图案协会(19)，以及包含PHD手指和溴代多巴胺，已知核蛋白的两个特征基序染色质水平的功能(20——22)。然而没有交互在TIF1γ和KRAB结构域之间进行了描述，这是一种酵母双杂交TIF1α和KRAB结构域之间的相互作用人KOX1蛋白(13,18)，暗示可能存在的串扰KRAB-ZFPs和核受体(23).
尽管有10多种独立的KRAB结构域蛋白，如人类KOX1公司(13)、ZNF133和ZNF140（参考。11和参考文献。其中），鼠标KRAZ1和KRAZ2(24)和大鼠Kid-1(12)，已显示与TIF1β，几乎所有这些相互作用研究都是由使用属于AB亚家族的KRAB结构域。除此之外亚科、人类和小鼠基因组包含另外两个远距离相关的基因组亚家族：一个携带经典KRAB-A盒子发散KRAB-B盒，命名为B，另一个包含经典A仅限于方框(25)。在本研究中，每个KRAB的个体成员测试亚家族的转录抑制和相互作用TIF1基因家族成员。与KRAB（AB）域类似，当靶向于哺乳动物DNA与异源DNA结合域的融合细胞。然而，与KRAB-B盒、KRAB-B盒或A亚家族的KRAB-A盒和锌指区对KRAB域。通过使用双杂交相互作用分析，所有KRAB测试的结构域与TIF1β相互作用，但与TIF1α或TIF1γ，表明TIF1β可能在三个不同亚科的共挤压转录KRAB-ZFP。
材料和方法
质粒。
本研究中使用的KRAB cDNA插入物（见图。)均通过PCR获得。MZF22和MZF13之前是通过筛选来自小鼠单核细胞系WEHI-274(25)。HZF4和6D从人骨髓单核细胞U-937 cDNA文库和小鼠睾丸cDNA图书馆（参考。26; 未发表的作品）。TIF1 cDNA用于本研究对应于人类TIF1γ和小鼠TIF1α和TIF1β（欧洲分子生物学数据库；参考文献。8,16,18)。对于瞬态在哺乳动物细胞中的转染研究中，显示的cDNA为克隆到pG4MolyII(8)。嵌合蛋白雌激素受体（ER）（C）-VP16，编码ERα的176–280氨基酸和VP16的413–490酸，以及报告基因17M2-ER元件（ERE）-G-氯霉素乙酰转移酶（CAT）(8)。用于酵母双杂交分析、DBD和酸性活化结构域（AAD）融合蛋白从酵母多拷贝中表达质粒pBL1和pASV3(27)。这些质粒表达在磷酸甘油激酶启动子的控制下插入。pBL1型包含HIS3标记并指导表位的合成（F区ERα）标记的ERαDBD融合蛋白。pASV3包含LEU2标记物和表达核定位VP16 AAD的盒，在所有读取帧中，在多链接器和终止密码之前。细节单个质粒构建的测序，可根据要求提供。
测试的各种KRAB域的示意图转录抑制和与TIF1家族成员的相互作用。KRAB A图案由条纹框表示。B图案和不同色调的盒子描绘了更具分歧的b主题灰色。数字是指氨基酸的位置。
瞬时转染。
COS-1细胞以及CAT和如前所述进行β-半乳糖苷酶检测(8).
双杂交相互作用分析。
酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖或选择性培养的酵母细胞通过醋酸锂程序转化培养基。酵母PL3（材料αura3-Δ1 his3-Δ200列2-Δ1 trp1∷3ERE-URA3（美国）; 裁判。27)转化子在补充有尿嘧啶的选择性培养基。制备酵母提取物并测定了5′-单磷酸鸟氨酸脱羧酶（OMPdecase）如上所述的活动(27).
抗体。
使用的单克隆抗体包括：(我)抗GAL4（），2GV3(8);(ii（ii）)抗VP16单克隆抗体，2GV4(27); 和(三)抗ERαF单克隆抗体F3对人ERαF区的作用(27).
结果
KRAB（AB）、KRAB（AB）和KRAB（A）领域。
三个KRAB域亚家族MZF22（AB）的个体成员，HZF4（Ab）、MTZ1（Ab）、MZF13（A）和6D（A）（图。; 另请参见材料和方法)进行转录分析当哺乳动物细胞中的启动子区域被激活时产生抑制。镀锌4包含每个KRAB结构域A盒的DBD融合蛋白，GAL4-MZF22（A）、GAL4-HZF4（A）和GAL4-MTZ1（A）生成GAL4-6D（A）并一起转染COS-1细胞含有两个GAL4结合位点（17M2）和一个β-珠蛋白（G）启动子-CAT融合前的ERE（17M2-ERE-G-CAT；裁判。8)。为了进行比较，还使用GAL4融合进行了分析包含源自人类KOX1的KRAB（AB）域的A框蛋白质[GAL4-KOX1（A）；参考。1]. 如图所示。 A–F，所有GAL4-A盒保险丝与GAL4相比，导致了对记者的剂量依赖性抑制独自一人。使用含有A的GAL4表达载体的饱和浓度从KOX1和MZF22的KRAB（AB）域导出的框（图。
A类和B类)。在类似条件下，GAL4-A箱包含来自HZF4和MTZ1 KRAB（Ab）域的A盒的融合抑制≈10-80倍（图。 C类和D类,分别），而在来源于MZF13和6D的GAL4-A盒融合体的存在KRAB（A）结构域（图。 E类和F类）。因此，类似于KRAB（AB）域的A框(1,2,6)、A框KRAB（Ab）和KRAB镇压活动。我们还研究了每个GAL4-A的能力盒融合蛋白抑制VP16介导的17M2-ERE-G-CAT记者。如图所示。ER（C）-VP16的存在表达质粒产生25倍的报告活性刺激，它被各种GAL4-A盒蛋白完全消除。
不同KRAB结构域的反转录特性。(A–F)所示GAL4的增加量瞬时转染表达质粒（3、10、30或100ng加入1μg 17M2-ERE-g-CAT报告子和1μg pCH110的COS-1细胞（表达β-半乳糖苷酶）。每个构造的褶皱压制通过使用未熔合物测量CAT相对活性来确定以GAL4表达载体为标准。值（±10%）代表三个独立重复转染的平均值内控β-半乳糖苷酶活性标准化pCH110。通过Western blot证实融合蛋白的表达通过使用针对GAL4 DBD的抗体2GV3（数据未显示）。
各种KRAB（AB）的A盒抑制VP16激活，KRAB（Ab）和KRAB域（A）。17M2-ERE-G-CAT（1μG）和pCH110（1μg）与ER（C）-VP16（100 ng）共转染COS-1细胞以及250 ng的GAL4-KRAB（A）融合蛋白。CAT活性表示为相对于测量的CAT活性未融合GAL4表达载体的存在（取100%）。值（±10%）代表三个独立重复值的平均值β-半乳糖苷酶活性正常化后的转染。
此前有报道称，B盒会增加镇压A盒的活动(28,29)。因此，我们测试了GAL4-KRAB融合子的转录活性MZF22、MZF4和MTZ1分别与B和B盒熔断，而MZF13和6D的A盒被熔合到各自的垫片上区域，包括A框和第一个锌指图案。抗体免疫印迹分析与GAL4相比，DBD在所有融合中的表达水平相似蛋白质（图。图例）。如预期，GAL4-KOX1（A+B）融合抑制转录比GAL4融合更有效仅包含KRAB A盒（45倍与10倍抑制，分别；图。A类)。镇压加剧在将MZF22 KRAB-B盒添加到MZF22 KRAB-A盒（图。B类)。相反，添加了HZF4和MTZ1 KRAB-b接线盒与各自的A接线盒之间没有连接显著改变相应的抑制活性融合蛋白[将GAL4-HZF4（A+b）和GAL4-MTZ1（A+b）与GAL4-HZF4（A）和GAL4-MTZ1（A）；图。 C类和D类]. 同样，添加MZF13和6D的间隔区域与其各自的A盒[比较GAL4-MZF13（A+垫片）和GAL4-6DGAL4-6D（A）；图。 E类和F类].因此，与B盒相比，B盒和间隔区都不是KRAB（A）结构域A盒的C端有助于抑制KRAB域的活性。
KRAB（AB）、KRABTIF1蛋白家族。
属于KRAB（AB）亚家族的许多KRAB结构域已经显示与转录辅助抑制因子TIF1β相互作用酵母，在哺乳动物细胞以及在体外(11——13,24).据报道，KRAB（AB）与酵母的双杂交相互作用TIF1β相关蛋白KOX1和TIF1α的结构域(13,18)。这个因此，采用酵母双杂交系统检测KRAB（Ab）和KRAB（A）可以与TIF1家族成员互动。DBD嵌合体由ERαDBD（残基176-282；图。A类)融合到每个KRAB域的A框，DBD-KOX1（A），DBD-MZF22（A）、DBD-HZF4（A）和DBD-MTZ1（A），与VP16的AAD之间的融合蛋白共表达蛋白质和任何一种TIF1家族成员（AAD-TIF1α，AAD-TIF1β和AAD-TIF1-γ；图。A类)，在酵母记者中含有三个ERE控制的URA3报告基因的菌株PL3（见图。A类和参考。27)。激活报告人通过测量URA3基因的OMPdecase活性来确定产品（图。 B类——G公司)。当与AAD控制，DBD-HZF4（A），但不是其他DBD-KRAB（A）融合蛋白质，激活了未融合DBD水平以上的报告基因（图。 B类——G公司)，表示HZF4的A框含有一个氨基酸序列，可以在酵母中进行反式作用，但不能在哺乳动物细胞中（见图。C类)，至少在目前实验条件（细胞系/报告体）。不OMP酶活性显著高于AAD对照组当各种DBD-KRAB（A）融合蛋白共存时检测到使用AAD-TIF1α或AAD-TIF1-γ，而在相同条件下条件下，观察到报告者在AAD-TIF1β（图。 B类——G公司)。因此，KRAB（Ab）和KRAB（A）域包含A框，与KRAB域一样，能够调节与TIF1β的特定相互作用。
酵母双杂交分析不同菌株之间的相互作用KRAB结构域和TIF1家族蛋白。(A类)示意图本研究中使用的酵母双杂交系统的表示。这个ERα的DBD（氨基酸176–282）和酸性活化VP16（氨基酸411-490）的结构域（AAD）未融合或融合到显示了测试相互作用的蛋白质（白盒）。URA3报告基因，受三种雌激素反应元件调节酵母报告菌株PL3中的（ERE3X）如下所示。(B–G类)KRAB（AB）、KRAB带有TIF1β的KRAB（A）域。表达指示的质粒将DBD-KRAB融合体与VP16一起引入PL3中AAD（作为对照）或VP16 AAD与TIF1α、TIF1β或畅通节能法γ。每种无细胞提取物的OMP酶活性测定如下以纳米基质/分钟/毫克蛋白质表示。这个值（±20%）表示至少三个独立值的平均值实验。注意，所有融合蛋白的表达均得到确认通过Western blotting，使用针对F区标签的抗体F3ERαDBD和2GV4分别对应VP16（数据未显示）。
包含A盒的DBD-KRAB保险丝与各自的B、B、，或间隔区，DBD-KOX1（A+B），DBD-MZF22，DBD-MTZ1（A+b）、DBD-MZ31（A+垫片）和DBD-6D（A+垫圈）检查酵母细胞中TIF1家族蛋白的相互作用。正如DBD-HZF4（A）所观察到的，DBD-HZF4（A+b）与未融合的AAD在背景水平上对报告基因进行反式激活（图。D类)。也观察到类似的报告者激活DBD融合包括6D间隔区[DBD-6D（A+间隔区）+AAD；图。G公司]，但与其他DBD-KRAB嵌合体无关测试（图。 B类,C类,E类、和F类)，表示6D间隔区可能包含自主交易激励功能。如前所述(18)，的KOX1的整个KRAB（AB）结构域与TIF1α和TIF1β相互作用，但不是TIF1γ[见DBD-KOX1（A+B）+AAD-TIF1α/β/γ；图。B类]. 然而，请注意与AAD-TIF1β获得40倍活化（图。B类).有趣的是，这种增强大约高出5倍与AAD-TIF1β与DBD-KOX1（A）共存时观察到的结果相比（图。B类)表明TIF1β与KOX1（A+B）的亲和力可能高于与KOX1的亲和力。如图所示。 C类——G公司，MZF22（A+B），HZF4（A+b）、MTZ1（A+b）、MZF13（A+垫片）和6D（A+垫圈）相互作用使用TIF1β，但不使用TIF1α或TIF1γ。正如KOX1所观察到的那样，DBD-MZF22（A+B）结合AAD-TIF1β激活了报告者在相同条件下测试的基因比DBD-MZF22（A）更有效条件（图。C类)]. 同样，更高级别的记者将MZF13的间隔区添加到MZF13 A盒[比较DBD-MZ13（A+垫片）和DBD-MZ13（A）；图。F类]. 相反，DBD-MTZ1（A）和DBD-MTZ（A+b）都是当与AAD-TIF1β（图。E类)。因此，B盒和C侧翼A亚家族A框的区域，而不是b框的区域可能有助于与TIF1β的相互作用。
讨论
除了经典的KRAB（AB）结构域外，人类和小鼠基因组包含KRAB（Ab）和KRAB(25)。这里，我们介绍证据表明这些KRAB变种的A盒，虽然距离遥远相关的(25)，表现出功能相似性。他们都压抑通过与异源DBD融合靶向DNA时的转录在哺乳动物细胞中，它们都与转录物相互作用增压器TIF1β。正如所证明的那样，互动是高度特定的由于缺乏与相关蛋白TIF1α和TIF1γ的结合。因此，尽管之前曾报道过双杂交相互作用人KOX1蛋白的整个KRAB（AB）结构域与TIF1α之间(13,18)，TIF1β可能代表TIF1基因家族的唯一成员参与KRAB介导的镇压。对此提供额外支持作用的特异性是最近发现缺乏TIF1β的小鼠植入后早期发育有缺陷(30)，这意味着至少在胚胎发育早期，TIF1的成员家庭虽然在结构上有联系，但却发挥着独特的非冗余性功能。TIF1β可能介导KRAB结构域的抑制功能尚未阐明。然而，有几条证据支持表观遗传机制涉及异染色质结合蛋白和组蛋白脱乙酰酶。已知TIF1β与HP1成员有关家庭(9,10)通过保守的基序直接与之结合(8,9)。HP1蛋白是与非组蛋白染色体相关的蛋白质主要是着丝粒周围异染色质，据信作为异染色质组装和沉默的调节器（参考文献中审查。15)。此外，据报道，TIF1β也是一种组蛋白脱乙酰酶复合物的组成成分(14)并拥有一个自治静默函数，它不仅需要HP1绑定，还需要也包括组蛋白脱乙酰化(9)。综上所述，这些结果和我们的目前的数据表明，所有KRAB的阻遏机制都是保守的域，包括KRAB（Ab）和KRAB变体，通过TIF1β及其伙伴的补充可能导致脱乙酰化和异染色质样复合物在细胞内特定位置的组装基因组。
关于保守B盒的功能知之甚少。尽管明显缺乏转录活性，B框显示为增加A盒的抑制活性(28,29)。这里，我们报告两种混合交互作用数据，虽然定性，但相互关联转录抑制数据也很好。KOX1和MZF22KRAB（AB）结构域在哺乳动物中表现出强烈的抑制活性细胞与TIF1β的相互作用比酵母细胞中的相应A盒。此外，我们的研究结果表明与B盒相比，高度发散的B盒不起作用哺乳动物细胞中KRAB结构域的抑制活性不会增强与酵母中TIF1β的相互作用。这些数据表明KRAB（AB）和KRAB与TIF1β的相互作用，以实现其沉默活性。相反，没有转录抑制之间存在相关性MZF13（A）和MZF12（A+垫片）及其各自的活动TIF1β结合活性。MZF13（A）和MZF13（A+间隔区）均被抑制具有类似效力的转录，而TIF1β的相互作用使用MZF13（A+间隔棒）比使用MZF1 3（A）更有效。尽管MZF13的间隔区如何调节TIF1β酵母细胞中的相互作用尚不清楚，我们的结果提高了有趣的是，这个区域可能会产生一种细胞特异性对TIF1β结合的影响。因此，TIF1β的招募单个KRAB-ZFP体内可能不仅取决于A框，但也位于C侧翼区域。
KRAB-ZFPs的生理功能目前尚不清楚。然而，这些潜在的DNA结合转录阻遏物可能在调节特定基因的表达中发挥重要作用在细胞分化和发育过程中它们的时间和空间调控表达模式（参见参考文献。25和参考文献。并发现TIF1β对早期胚胎发生(30)。进一步的分子和遗传学研究应该请允许我们阐明体内这么大的功能KRAB-ZFP家族并确定哪些互动和合作伙伴与这些功能相关。
