UPR通路联合预防内质网应激介导的转录调控因子抑制引起的肝脂肪变性

内质网应激抑制维持能量和脂质稳态相关基因的表达

因为ATF6α是一种转录因子，我们推断附件6α缺失和脂质稳态的破坏可能最容易通过全局转录分析确定。TM激发8小时后的微阵列分析显示，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）(Adachi等人，2008年;Wu等人，2007年),附件6α缺失对基础基因表达影响不大(图2A和补充数据）。然而，当动物被TM攻击8小时时，ER应激调节基因的一个子集的表达被改变附件6α缺失(图2A). 其中大多数基因在野生型肝脏中受应激上调，在附件6α-阴性动物。与MEFs一样，ER伴侣和共同伴侣的表达(Erp72、Erp57、p58^IPK公司，94组)以及参与ERAD的基因(Derl3、Edem1)，在年减弱附件6α-空肝(图2B). 此外，编码促凋亡转录因子CHOP的基因的早期上调部分依赖于ATF6α。

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图2

体内持续内质网应激抑制代谢基因子集的表达。（A） 按照实验程序进行基因表达聚类分析和肝脏RNA转录谱分析。图示了4262个差异表达基因的平均表达水平。每个竖线代表一个基因。绿色表示低表达，红色表示高表达。（B，C）显示了微阵列分析中两个mRNA亚群的表达水平，并与车辆注射的野生型样本进行了标准化。注意，在没有内质网应激的情况下，这些基因的表达水平差异通常不显著。误差条表示平均值±S。每组三只动物的D.M。对于（B），所有显示的基因都显著（p<0.05）减少了TM在附件6α-缺失动物比野生型动物多。对于（C），两种基因型中显示的所有基因均受压力显著下调（p<0.05）。依赖ATF4的色氨酸tRNA合成酶(战争)在这里吗附件6α依赖性可能是因为附件6α-缺失小鼠刺激eIF2α磷酸化以应对TM挑战。（D） 实时RT-PCR分析用于评估野生型或附件6注射TM后8或48小时，α-无肝。误差线为平均值±S。来自2只（载具）或3只（TM）动物的D.M。表达值相对于β-肌动蛋白水平进行标准化，并相对于野生型未受挑战动物的表达水平进行显示。（E） 野生型或附件6通过免疫印迹法检测注射载体或TM（1 mg/kg）的α−/−小鼠的C/EBPα（长42kd，短30kd）或C-JUN（F，G）。在注射TM 48小时后，通过实时RT-PCR测定细分为不同类别的代谢基因的表达。对于（D、F、G和H）。红色字体表示与TM-challenged基因相比，基因的表达存在显著差异（p<0.05）附件6α-阴性动物对未受挑战的动物。

值得注意的是附件6参与肝脏脂质代谢的基因的α缺失和表达，与基因型之间的表型分离一致，基因型在激发后的晚些时候逐渐发展，而不是仅在激发后8小时表现得更明显。然而，我们观察到，与基因型无关的TM显著下调了脂稳态的一些关键介质(图2C和表S1). 其中包括编码转录因子和辅因子SREBP1、C/EBPα、PPARα、FOXO1和PGC1α的基因；脂质代谢成分包括微粒体甘油三酯转移蛋白（MTTP）、脂肪酸去饱和酶和合成酶（FADS1和FADS2；以及FASN）以及HMG-CoA还原酶。这种调节只对代谢基因的一个子集有选择性，因为许多其他基因的表达在内质网应激8小时后没有改变(表S1).

删除附件6α不会立即使细胞对压力敏感，相反，会使他们无法从持续的压力中恢复和适应(Wu等人，2007年). 事实上，肝脏对TM注射的最初反应附件6在内质网应激通路的激活方面，α-缺失小鼠与野生型小鼠非常相似，只有在野生型动物恢复后，基因敲除的动物才会表现出持续的内质网胁迫(图1A). 因此，我们推测附件6α缺失可能使动物对内质网应激敏感，不是因为ATF6α失去了对代谢基因表达的直接调节，而是因为未能适当改善内质网中的蛋白质折叠环境而间接导致肝脏持续应激，定量RT-PCR显示基因的表达百万吨/年,Srebp1号机组,第1页α、 和Ppar公司α在野生型和附件6注射TM后8小时，α-阴性动物，但在很大程度上附件6注射48小时后α-阴性动物(图2D). 的表达式C/ebp公司αmRNA和蛋白质也有类似的趋势，在两种基因型中都被TM快速抑制，但在附件6实验过程中的α-阴性动物(图2E和数据未显示）。C/EBPα蛋白通过翻译调控以长（p42）和短（p30）形式合成(Calkhoven等人，2000年)并且，与C/ebp公司αmRNA，两种形式在附件6α-阴性动物。我们还观察到c-jun公司在mRNA和蛋白质水平(图2E和数据未显示）。这是值得注意的，因为c-jun公司陪伴C/ebp公司α缺失(Flodby等人，1996年).

我们考虑了四种可能的机制来解释TM-challenged患者的脂肪肝附件6α-缺失小鼠：（1）肝脏脂肪酸从头合成增强；（2） 脂肪组织向肝脏的脂肪酸动员和摄取增加；（3） 减少肝脏对脂肪酸的氧化作用；（4）脂蛋白分泌减少。由于内质网应激后基因表达的基因型特异性变化在TM激发后的稍后时间点变得明显，我们使用定量RT-PCR来探测激发48小时后参与脂质和碳水化合物稳态的几类基因的表达，此时野生型动物已基本恢复。转录调节器C/ebp公司α（调节糖异生和脂肪生成），Ppar公司α（脂肪酸氧化和糖异生），第1页α（脂肪酸氧化和糖异生），Srebp1号机组（脂肪生成），以及糖类应答元件结合蛋白（与SREBP1共同调节脂肪生成）在持续内质网应激下均显著下调附件6α-空肝(图2F). 相比之下，其他监管机构包括C/ebp公司家庭成员，Ppar公司γ,奶油色、和Lxr公司α、 这些动物没有受到内质网应激的显著影响。与这些结果一致，我们对这些转录调控因子的关键靶点的表达进行了取样，发现参与脂肪酸氧化、糖异生和脂肪生成的基因在附件6α-阴性动物(图2G). 此外，参与脂蛋白合成和转运的基因也受到类似的抑制，这表明转录因子SREBP2的活性存在缺陷。免疫印迹证实，未分离和裂解形式的SREBP1和SREBP2在附件6α-空的动物，表明注射TM后其活动的主要调节是转录（数据未显示）。由于参与脂肪生成的关键蛋白（SCD1、FASN、DGAT2）在附件6α-缺失动物和调节新脂滴形成的关键蛋白[FIT2-（Kadereit等人，2008年）]未受到影响，肝脏中的新生脂肪生成不太可能是细胞溶质脂质滴形成的来源。同样，工厂1抑制意味着脂肪组织中脂肪酸的动员有限。综上所述，这些数据表明附件6由于脂肪酸氧化缺陷导致的α-缺失动物，可能因脂蛋白分泌受损而加重。支持这一观点的是，脂肪酸氧化过程中的微泡脂肪变性可能伴随着遗传缺陷(Rao和Reddy，2001年)和脂蛋白分泌(Raabe等人，1999年).

内质网应激感应通路协同维持体内平衡并恢复代谢基因表达

接下来，我们将注意力转向内质网应激导致这些转录因子抑制的机制。与基因型无关的内质网应激对代谢转录因子编码基因的快速下调不支持ATF6α直接调控这些基因的观点。相反，野生型和附件6α-空小鼠，当后者无法从TM刺激中恢复时，这种情况会加剧，这是由ATF6α间接调节的。野生型和附件6TM的α-零肝是指新业务流程1mRNA剪接和从剪接产物中产生的XBP1蛋白持续存在于后者中（图​（图1E1E级和S2系列). 因此，我们认为代谢基因表达的抑制可能依赖于通过IRE1/XBP1轴的信号传导。爱尔兰1α-和新业务流程1-由于肝脏缺陷，胚胎发育过程中无动物死亡(Reimold等人，2000年;Zhang等人，2005年). 为了避免这个问题，我们创造了一种动物爱尔兰1α等位基因，并在白蛋白启动子的控制下将其与表达CRE重组酶的小鼠交配，从而产生肝脏特异性缺失爱尔兰1α. 确认有效爱尔兰1α缺失，这些动物的Xbp1型TM注射对肝脏mRNA的影响(图S7).

代谢基因表达的抑制不是依赖于IRE1α，而是在肝脏特异性爱尔兰1α-无效动物，其方式与附件6α-阴性动物。两种形式的C/EBPα蛋白在爱尔兰1注射TM后30小时，α-空肝的程度远大于野生型动物，而C-JUN的表达上调(图3A). 特定于生活爱尔兰1注射后，α-无效动物出现脂肪肝（数据未显示），并显示Adrp公司以及参与脂质代谢的转录因子的抑制(图3B). 与相同附件6α-阴性动物，爱尔兰1在野生型动物中CHOP上调被大幅减弱后，α-缺失的肝脏显示促凋亡CHOP蛋白持续上调(图3A和3B). 因此，附件6α-零和爱尔兰1α-空肝对TM和代谢基因表达的扰动表现出相似的敏感性。而XBP1被提议调节脂肪基因的基础表达(Lee等人，2008年)，TM-induced steatosis is occurred in the presence of spliced or unspliced XBP1（图​（图1E，1E级,​、3A、，3A级,S2系列、和S7B系列)表明XBP1并不直接调节内质网应激诱导的微泡脂肪变性。

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图3

标准UPR的每一个分支都有助于防止代谢失调。（A） 野生型小鼠和肝细胞特异性缺失的小鼠爱尔兰1α用溶媒或TM（2 mg/kg）注射。如图所示，用免疫印迹法检测注射后30小时分离的肝脏蛋白裂解物。显示了C/EBPα的长（开放箭头）和短（闭合箭头）形式。注意，TRAPα糖基化抑制的明显差异可能是该蛋白本身是至少部分受IRE1α调节的UPR靶点的结果(长泽等人，2007年)而不是基因型之间TM的药理作用有任何差异。（B） RNA由野生型和红外线1α−/−肝组织样本来自（A），并通过实时RT-PCR进行分析。n=每组3只动物。（C） eIF2αS51A杂合或纯合敲除突变小鼠，由组成性表达的野生型eIF2 a floxed转基因拯救，在白蛋白启动子的控制下与表达CRE重组酶的小鼠交配，以删除肝细胞中的转基因。“eIF2α基因组”表示小鼠S51A基因组等位基因是杂合的还是纯合的，“Δtg”表示转基因是否被CRE表达删除。用标记的免疫印迹法检测注射后30小时（2 mg/kg）肝脏分离的蛋白裂解物。在这里，使用转铁蛋白受体（TfR）蛋白抑制糖基化。星号表示非特定背景带。（D） 与（B）中一样，通过实时RT-PCR对（C）中所示的动物的代谢mRNA的表达进行定量。n=2-4只动物/组。而上调的差异Adrp公司mRNA与SA和AA公司TM激发小鼠后，ADRP蛋白明显上调（数据未显示）。红色字母表示不同表达水平的比较爱尔兰1α−/−或AA公司TM-challenged动物对unchallenged，p<0.1。

这两种遗传模型中的相似表型使我们询问，切除UPR的第三个PERK/eIF2α依赖臂是否会产生类似的结果。为了验证这个假设，一个组成性表达的eIF2α转基因LoxP公司将位点引入携带基因组eIF2α中非磷酸化S51A突变的小鼠。该转基因挽救了新生儿致死性eIF2αS51A纯合突变(AA公司)或杂合子(沙特阿拉伯)携带转基因的动物被培育成在白蛋白启动子控制下表达CRE的小鼠（参见补充实验程序和图S8). 注射TM后，在转基因缺失的纯合S51A动物中未观察到eIF2α磷酸化(图3C，通道13-16）确认有效的eIF2α转基因缺失。与ATF6α或IRE1α缺失一样，我们也观察到这些动物中C/EBPα蛋白表达受到抑制，C-JUN和ADRP蛋白上调，脂肪肝，但在小鼠中基因组S51A位点杂合程度较低(图3C，比较10-12车道和13-16车道；也未显示数据）在mRNA水平上获得了类似的结果(图3D). 因此，虽然eIF2α去磷酸化增加可以防止严重饮食应激诱导的脂肪变性(Oyadomari等人，2008年)eIF2α磷酸化对于防止脂肪堆积以应对内质网应激的直接挑战显然是必要的。

我们的数据表明，持续的内质网应激，无论UPR通路被阻断，都会持续抑制代谢基因表达。这些结果表明，UPR不是通过ATF6α、IRE1α或PERK途径介导的基因表达的选择性调节来保护脂质稳态，而是通过UPR的三种途径来保护脂质稳态，这三种途径有助于ER功能的整体维持。从这个角度来看，代谢基因表达的抑制应直接响应内质网应激负荷的实时性，并应与内质网功能障碍的分子标记物相关。以下观察结果支持了这一假设：首先，在培养的FaO大鼠肝癌细胞中，对TM治疗或内质网钙耗竭剂thapsigargin（TG）诱导内质网应激的反应，C/EBPα表达的抑制和C-JUN的上调可以被重现(图4A). 这一观察结果证实，这种影响不是TM-特异性的，但可能是内质网应激的一般结果。其次，至少有一种分泌蛋白保留在细胞内附件6α-无TM基因小鼠。而TM处理对编码血清淀粉样蛋白（SAP）的基因的转录诱导在野生型和附件6α-阴性动物(图S9)，其分泌在后者中基本上被阻断，而在细胞匀浆中很容易检测到(图4B和4C). 此外，在激发后24小时，两种基因型的血浆胆固醇以含载脂蛋白B的形式（极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白）的浓度均被TM降低，但在附件6挑战48小时后，α-与野生型动物相比为零(图4D和4E). 总之，这些数据表明，在TM-处理的UPR-受损动物的肝脏中，激发期间分泌途径的功能不太理想。

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图4

ER蛋白处理的中断抑制代谢基因的表达。（A） 用500 nM TG或5μg/ml TM重复处理FaO大鼠肝癌细胞8或24小时，然后对GRP94、BiP、C/EBPα和C-JUN进行细胞裂解和免疫印迹。在肝细胞中，还观察到内质网应激诱导的缓慢迁移的磷酸化-C-JUN。（B、C）野生型和附件6向α−/−小鼠注射溶媒或TM（1 mg/kg体重）。用免疫印迹法检测注射后指定时间点分离的肝脏蛋白裂解物的细胞内SAP（B）；采用ELISA（C）检测血浆SAP水平。（D） 通过酶法测定注射载体或TM 24小时的小鼠血浆样品中的总胆固醇和甘油三酯水平，并在献祭前禁食6小时。（E） 胆固醇和甘油三酯以总含量表示，或以通过差异沉淀纯化的LDL和VLDL颗粒的形式表示，如（D）所示。在这种情况下，样品是在注射TM 48小时后而不是24小时后采集的。注意，与面板（D）和（E）相比，绝对值略有不同，可能是由于实验变化。然而，在小组（D）中，注射TM后，不同基因型之间的胆固醇或甘油三酯水平没有显著差异，而野生型动物的胆固醇水平恢复程度高于野生型动物附件6小组（E）中的α-空动物。TM对富含胆固醇的脂蛋白颗粒的影响比富含甘油三酯的颗粒大得多，这一事实表明TM抑制肝脂蛋白的生成，但不抑制肠道的生成p<0.05

如果由于UPR组分的遗传缺陷而加剧的代谢基因表达抑制实际上是由于ER中蛋白质折叠和处理的中断而不是特定的UPR介导的信号级联的丢失引起的，那么独立于UPR的ER蛋白折叠的直接扰动应会产生类似的表型。为了验证这一预测，我们使用TM挑战动物的ER-resident DnaJ蛋白和BiP cochaperone p58的未合子^IPK公司(Ladiges等人，2005年).第58页-与野生型对应物相比，空白细胞和动物对内质网应激更敏感，很可能是由于p58的作用^IPK公司在增强BiP依赖性蛋白质折叠方面(Rutkowski等人，2007年). 引人注目的是，第58页-注射TM后，空白动物出现脂肪肝(图5A)并抑制了C/ebp公司α (图5B和5C). 与相同附件6α-零和爱尔兰1α-阴性动物，第58页-无效动物在激发后也表现出持续的CHOP上调(图5B和5C). 因此，代谢基因的抑制C/ebp公司α是内质网应激的直接结果，不依赖于任何单一的UPR信号通路。

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图5

ER蛋白折叠中断导致脂肪变性，尽管UPR完整。（A、B、C）野生型和第58页^IPK公司给−/−小鼠注射溶媒或TM（1 mg/kg），并在注射后48小时处死。（A） 原位观察TM激发小鼠的肝脏。（B） 如图所示，用免疫印迹法检测肝脏中的蛋白裂解物。（C） 通过实时RT-PCR分析RNA。红色字体表示比较p<0.05第58页−/−处理为未处理。

ER蛋白折叠受损通过CHOP部分抑制代谢基因表达

快速下调C/ebp公司内质网应激期间的αmRNA和其他mRNA可以通过诱导这些mRNA的降解或抑制新合成来解释。为了区分这些可能性，我们在存在或不存在转录抑制剂放线菌素D（ActD）的情况下，用TM或TG治疗FaO肝癌细胞。在没有应激的情况下，单用ActD显著降低了C/EBPα的表达，基本上消除了TM或TG对C/EBPβ的影响(图6A). 因此，C/ebp公司αmRNA在肝细胞中的基础降解非常迅速，其应激介导的下调很可能是由于其转录受到抑制。

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图6

CHOP抑制代谢转录因子的表达。（A） 用5μg/ml ActD和无应激、500 nM TG或5μg/ml TM处理FaO大鼠肝癌细胞，共处理4小时。如图所示，收集蛋白裂解产物并通过免疫印迹进行检测。注意，如预期的那样，ActD治疗完全阻断了BiP和CHOP的上调。（B、C）野生型和印章给−/−小鼠注射溶媒或TM（1 mg/kg），并在注射24小时后处死。（B） 通过实时RT-PCR分析RNA图2Dn=4-10只动物/组。红色字体表示比较p<0.05印章−/−处理为野生型处理。（C） 如图所示，用免疫印迹法检测肝脏中的蛋白裂解物。（D） TM-注射野生型或附件6如图所示，对α阴性动物（48小时）进行免疫印迹检测。

其中一个共同点是Atf6型α,爱尔兰1α、 和第58页这里提出的遗传模型是由于持续的应激导致CHOP持续上调和核定位，而在野生型小鼠中，CHOP快速但仅短暂上调以应对TM挑战（图​（图1A，1安培,第10节、和第11节). CHOP是转录因子C/EBP家族的成员，被认为是其功能的主要负调控因子(Ron和Habener，1992年). 我们认为，CHOP在应激期间上调可能至少部分导致代谢基因表达的抑制。在提出质疑时印章-TM无效动物，转录调控因子的表达C/ebp公司α,Ppar公司α,第1页α、 和Srebp1号机组比野生型动物受到的抑制更少(图6B). 在C/EBPα蛋白的分析中也观察到了这一点(图6C).印章缺失也能部分防止脂质积聚，这表现在ADRP上调减少(图6C). 因此，CHOP至少形成了持续内质网应激与C/EBPα等转录因子抑制之间的机制联系的一个组成部分。

尽管缺乏eIF2α磷酸化的明显刺激（这可能是CHOP下游GADD34持续上调的结果(Marciniak等人，2004年)) [(Wu等人，2007年)和图1A]. 相反，在野生型动物中，尽管持续刺激eIF2α磷酸化，CHOP上调迅速减弱。令人惊讶的是，我们发现ATF4也被内质网应激上调附件6早期和晚期时间点的α−/−动物(图6D和数据未显示）。这些数据表明，CHOP的上调会影响脂质代谢，这是通过ATF4蛋白水平与eIF2α磷酸化状态的分离而发生的，其机制正在进行研究。

肝脏脂肪堆积伴随不同的内质网应激

肝微泡脂肪变性生理原因的多样性使我们不禁要问，其他不太严重的内质网应激是否也会导致脂肪堆积和C/EBPα表达的抑制。值得注意的是，蛋白酶体抑制剂硼替佐米（bortezomib）在临床上用于治疗多发性骨髓瘤，导致脂质积聚，如ADRP上调所示(图7A). 已发表的报告表明硼替佐米可能具有肝毒性(Hernandez-Espinosa等人，2008年;Rosinol等人，2005年). 此外，ADRP和C-JUN上调以及脂肪生成基因的抑制也被视为易折叠因子VIII凝血蛋白过度表达的结果(图S12). 因此，脂质积聚和C/EBPα的抑制通常是内质网应激肝脏反应的保守特征。

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图7

不同的内质网应激导致脂质积聚。（A） 正常小鼠静脉注射蛋白酶体抑制剂Velcade（硼替佐米），剂量为1mg/kg，注射后8小时处死。检测裂解物是否上调CHOP、ADRP和C-JUN。（B）描绘ATF6、PERK和IRE1通路在维持脂质稳态中的联合作用的示意图。UPR未能充分保护ER导致CHOP的持续产生，CHOP通过C/EBPα抑制代谢基因，最终导致脂肪酸氧化、脂蛋白分泌、糖异生和其他代谢过程的破坏。

动物实验

密歇根大学动物使用和护理委员会审查并批准了所有动物使用协议。动物被喂食标准的啮齿动物食物，并被安置在有12小时光照和黑暗周期的受控环境中。在可能的情况下，所有实验都使用利特曼对照，每个实验都匹配年龄和性别，尽管观察到这两个变量都对表型没有任何影响。通过心脏穿刺，使用BD Microtainer和锂-赫拉平采集血样血浆。使用小鼠SAP ELISA试剂盒（免疫顾问实验室有限公司）测定SAP血浆水平。TM注射如所述(Zinszner等人，1998年). 用2 U/kg BW腹腔注射胰岛素。按规定测定血浆和肝脏胆固醇和甘油三酯水平(Iqbal等人，2008年a;Iqbal等人，2008b). 静脉注射Velcade（硼替佐米，来自Millenium），剂量为1 mg/kg，治疗8小时后处死小鼠。

阵列分析

小鼠腹膜内注射2mg/kg体重的TM或载体，并在注射后8小时分离肝脏。总RNA使用RNeasy（Qiagen）进行分离，并由密歇根大学综合癌症中心（UMCCC）Affymetrix和cDNA微阵列核心设施（密歇根州安阿伯）进行分析，如前所述(Wu等人，2007年).

蛋白质和RNA分析

简言之，在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液或Trizol RNA试剂（Invitrogen）中使用电子均质器均质组织，并在4°C的微型离心机中以15000 rpm离心10分钟。根据制造商的协议，使用TRIzol RNA试剂或RNeasy（Qiagen）分离RNA。其他实时引物序列在补充材料(表S2).

组织的组织学分析

通过在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中使用2.5%戊二醛固定肝组织，制备肝脏用于电子显微镜（EM）。按照说明对样品进行处理和成像(Rutkowski等人，2006年). 对于H&E染色，肝组织在OCT®中冷冻在液氮冷却的2-甲基丁烷中。切片切至6微米。使用徕卡MZ16FA立体显微镜原位观察肝脏。

细胞培养和分析

FaO大鼠肝癌细胞取自ATCC，在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。用TM或TG处理细胞如下所述(Rutkowski等人，2006年).

这项工作的一部分得到了NIH向RJK拨款DK042394、HL052173和HL057346的支持。RJK是霍华德·休斯医学研究所的研究员。其他资金来源包括UI解剖学和细胞生物学系向DTR提供的启动资金，美国国立卫生研究院向密歇根糖尿病研究和培训中心细胞和分子生物学核心设施提供的P60 DK020572赠款，佐治亚州血友病基金会向MUC提供的赠款，以及美国国立卫生研究院向MMH提供的DK46700赠款。我们特别感谢D.Ron印章−/−老鼠。我们还感谢J.Goldstein提供的SREBP1和SREBP2抗体，D.Silver和J.Estall提供的富有洞察力的建议，D.Ginsburg和J.Engelhardt提供的设备使用，A.Goodman和B.Spiegelman对手稿进行了批判性评估，以及考夫曼实验室的成员激发了讨论。