胃肠病学。作者手稿；可在PMC 2010年8月18日获得。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院175320
天然杀伤细胞/干扰素抗纤维化作用的消减-γ酒精加速肝纤维化
马里兰州贝塞斯达美国国立卫生研究院国家酗酒和酗酒研究所生理研究实验室肝脏生物学部分
请将重印请求发送至：Bin Gao，医学博士，PhD，肝脏生物学科，NIAA/NIH，5625 Fishers Lane，Room 2S-33，Bethesda，Maryland 20892。vog.hin.liam@oagb; 传真：（301）480-0257。 - 补充资料
支持的。
GUID:A57CA8D9-9452-4C7B-AFD4-835345097E78
摘要
背景和目标
慢性饮酒会加速病毒性肝炎患者的肝纤维化，这不能完全用乙醇增强的肝损伤来解释。在这里，我们确定了酒精加速肝纤维化的新机制：抑制自然杀伤（NK）细胞和干扰素的抗纤维化作用-γ（干扰素-γ).
方法
给小鼠喂食含5%乙醇的液体饮食8周，即可实现酒精摄入。四氯化碳（CCl）诱导肝纤维化4)持续2周。肝星状细胞（HSC）也被分离和培养用于体外研究。
结果
CCl公司4与配对喂养的小鼠相比，乙醇喂养的小鼠HSC的纤维化程度更高，凋亡更少。聚肌苷-多囊酸（Poly I:C）或干扰素-γ治疗抑制了配对喂养小鼠的肝纤维化，但对乙醇喂养小鼠没有抑制作用。与配对喂养的小鼠相比，乙醇喂养的小鼠NK细胞对HSC的细胞毒活性的Poly I:C激活减弱，这是由于减少了自然杀伤组2成员D（NKG2D）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和干扰素-γ乙醇喂养小鼠NK细胞的表达。体外，来自乙醇喂养小鼠的HSC对干扰素具有耐药性-γ–与成对喂养的小鼠相比，诱导的细胞周期停滞和凋亡。这种抵抗是由于干扰素减少所致-γ通过诱导细胞因子信号蛋白抑制剂和氧化应激的产生，激活乙醇喂养小鼠HSC中的信号转导子和转录激活子1（STAT1）。最后，来自乙醇喂养小鼠的HSC对NK细胞杀伤有抵抗力，这可以通过转化生长因子逆转-β1（TGF-β1） 中和抗体。
结论
慢性乙醇摄入减弱NK/IFN的抗纤维化作用-γ/肝脏中的STAT1，代表治疗酒精性肝纤维化的新的和不同的治疗靶点。
肝纤维化是对几乎所有形式的慢性肝损伤的常见瘢痕反应，其特征是肝内细胞外基质蛋白的积聚。1–三越来越多的证据表明，几种细胞类型有助于肝纤维化的形成，包括肝星状细胞（HSC）、肌成纤维细胞、骨髓源性祖细胞和肝细胞。1–三其中，HSC被认为在肝纤维化的发病机制中起着关键作用。1–三正常健康肝脏中的HSC通常处于静止状态，在肝损伤期间被激活并分化为肌纤维母细胞，其特征是维生素a（视黄醇）丢失和胶原表达增强。1–三饮酒、丙型肝炎病毒（HCV）感染和非酒精性脂肪性肝炎是目前导致肝纤维化的慢性肝损伤的三个主要原因。4有趣的是，饮酒可加速慢性丙型肝炎病毒感染患者的肝纤维化5–9以及用肝毒素治疗的动物。10明显的潜在原因是酒精导致的肝脏损伤加重；然而，这并不能完全解释所观察到的肝纤维化加速。例如，几项研究表明，大多数慢性丙型肝炎病毒感染的酗酒者的组织学特征与慢性丙型流感病毒感染的非酒精患者相似，但酒精患者的肝纤维化进展比非酒精患者快得多。11,12除了单纯增强肝损伤外，酒精还可能通过多种机制加速肝纤维化的进展。13–15例如，饮酒可能通过增加肠源性内毒素、缺氧（氧化应激）或形成有毒和促纤维化代谢物（如乙醛或脂质过氧化物）来增强肝HSC的激活。13–15最近，我们和其他人已经证明先天免疫系统、自然杀伤（NK）细胞和干扰素的激活-γ（干扰素-γ)，抑制肝纤维化。16–18此外，乙醇的免疫抑制作用在酗酒者中也有很好的证明。19,20因此，我们假设NK细胞/IFN的抑制-γ乙醇介导的功能可能是乙醇加速肝纤维化的重要机制。
肝脏中富含NK细胞，约占小鼠肝脏淋巴细胞的10%，大鼠或人类肝脏淋巴细胞的30%-50%。21,22尽管双链RNA、聚肌苷-多囊藻酸（poly-I:C）或干扰素可激活NK细胞-γ抑制肝纤维化，NK细胞耗竭增强肝纤维化。16,17NK细胞通过直接杀伤自然杀伤组2成员D（NKG2D）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和颗粒酶依赖性方式中活化的HSC来改善肝纤维化。16,17NK细胞还可以通过产生干扰素抑制肝纤维化-γ.18干扰素的抗纤维化作用-γ在动物研究中有很好的记录，这表明干扰素-γ抑制HSC活化并刺激体内外活化HSC的NK细胞杀伤。18,23,24此外，干扰素治疗-γ在乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染患者中可以改善肝纤维化，25,26但最近的一项临床试验表明，干扰素-γ治疗对晚期肝病患者没有任何益处。27这些研究之间的差异可能是由于选择了不同阶段的肝病患者。IFN可能-γ在治疗早期肝纤维化时可能会产生有益的效果，但在晚期肝硬化时则不会。干扰素的作用-γ通过与干扰素结合介导-γ受体，然后是Janus激酶磷酸化（JAKs）和信号转导子和转录激活子1（STAT1）。磷酸化STAT1蛋白形成二聚体并转位到细胞核，以诱导多种基因的转录，包括细胞因子信号蛋白抑制剂家族（SOCS）。然后SOCS蛋白又与JAK结合并关闭IFN-γ反馈回路中的信号。28
在本报告中，我们探讨了慢性乙醇摄入对NK细胞/IFN的影响-γ体内外肝脏中介导的抗纤维化作用。我们的结果表明，NK细胞/干扰素的抗纤维化作用被消除-γ可能是乙醇加速肝纤维化的重要机制。
方法和材料
老鼠
C57BL/6N小鼠购自美国国家癌症研究所（Frederick，MD）。本研究中使用的所有小鼠都被安置在一个特定的无病设施中，并按照美国国立卫生研究院的指南进行护理。
慢性乙醇摄入与CCl诱导的肝纤维化4
体重≈25 g的雄性C57BL/6N小鼠被喂食含有5%乙醇的营养充足的液体食物，或用糊精麦芽糖等热量取代乙醇的双份食物（新泽西州Frenchtown BioServ）。通过每天增加1%（vol/vol）的含量逐渐引入乙醇，直到小鼠连续8周食用含有5%乙醇的饮食。喂食8周后，小鼠继续使用相同的饮食，并注射（腹腔内，每周3次）1 mL/kg或2.5 mL/kg体重的10%纯四氯化碳（CCl）4; 西格玛，圣路易斯，密苏里州）在橄榄油（西格玛）中溶解2周。然后处死小鼠，收集肝组织。
CCl共处理4加上Poly I:C或CCl4小鼠体内加IFN-γ
用CCl注射8周的乙醇或双喂小鼠4（0.1 mL/kg，每周3次）和聚I:C（5μg/g，每周3次，腹腔注射；Sigma）或小鼠干扰素-γ（2000 IU/g，皮下注射，每周7次；R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）再注射2周。在CCI前12小时给药Poly I:C4注入。
肝星状细胞的分离、培养、治疗及D4 HSC的制备
如前所述，通过胶原酶原位灌注和Optiprep（Sigma）密度梯度差速离心分离小鼠肝星状细胞（HSC）。18将分离的HSC重新悬浮在含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，然后以1×10的密度将其置于24孔板上4细胞/孔或在密度为1×10的6孔板上5如前所述。18第3天，在无血清培养基中培养HSC额外24小时。这些细胞被指定为D4 HSC。然后用干扰素治疗D4造血干细胞-γ免疫组化试验30分钟或细胞增殖试验24小时。
在共培养实验中，D4 HSC与肝细胞共培养24小时，细胞培养插入物为3-μm孔径（康宁、阿克顿、马萨诸塞州），以分离上述两种细胞群。29,30在不同的时间点后，用干扰素培养HSC-γ、TGF-β1或两者兼而有之。为了阻断肝细胞的氧化应激，培养基中添加100-μmol/L Trolox、1-mmol/L抗坏血酸和5-mmol/LN-乙酰半胱氨酸（Sigma），如所述，并进行了一些修改。31
其他方法
RT-PCR、Western Blotting、细胞增殖、TUNEL（转移酶介导的dUTP缺口标记）检测、Caspase-3活性分析、流式细胞仪分析、组织学、免疫组织化学、免疫细胞化学、肝羟脯氨酸含量测定、肝单核细胞（MNCs）和NK细胞的分离、细胞毒性检测，和转化生长因子β1（转化生长因子-β1） 治疗
有关这些方法的详细信息，请参阅补充材料和方法（见在线补充材料，网址：网址：www.gastrojournal.org). 所有Western blotting、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学实验均用每组5-10只不同的小鼠或样品重复至少2次，图中仅显示代表性的印迹。密度量化的详细信息如图或辅助材料.
统计分析
数据表示为平均值±SEM。为了比较从≥2组中获得的值，学生t吨进行方差检验或单因素分析。值为P（P）<0.05被认为是显著的。
结果
CCl期间摄入乙醇减少HSC凋亡并加速肝纤维化4-诱导性肝纤维化
显示注射0.1 mL/kg CCl4乙醇喂养小鼠的血清ALT水平高于配对喂养小鼠。为了在两组小鼠中产生相似程度的肝损伤，我们给配对喂养的小鼠注射了更高剂量的CCl4（0.25毫升/千克）。我们的结果表明，注射0.25 mL/kg CCl4与注射0.1 mL/kg CCl相比，双喂小鼠的血清ALT水平也有类似的升高4在乙醇喂养的小鼠中(). 接下来，我们比较了这些小鼠的肝纤维化(). 如预期，注射相同剂量的CCl4（0.1 mL/kg）诱导α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA）蛋白质、羟脯氨酸、胶原纤维和α-与配对喂养小鼠相比，乙醇喂养小鼠肝脏中的SMA阳性细胞。有趣的是，尽管肝损伤程度相似，但羟脯氨酸和胶原沉积明显增多α-0.1 mL/kg CCl处理的乙醇喂养小鼠的SMA染色4与用0.25 mL/kg CCl处理的配对喂养小鼠相比4这一发现表明，尽管肝损伤程度相似，但与双喂小鼠相比，乙醇喂养小鼠的肝纤维化加速。
在CCl期间，喂食乙醇可减少HSC凋亡并加速肝纤维化4-诱导肝纤维化。给小鼠喂食乙醇饮食或对照饮食8周，然后注射CCl4在继续相同饮食的同时再坚持2周。第10周处死，收集血清以测定ALT(A类)收集肝脏进行免疫印迹(B类)或用于测量肝脏羟脯氨酸(C类)或免疫组织化学分析(D类). (D类)胶原纤维的三色染色，α-活化HSC的SMA染色和凋亡的TUNEL染色。箭头表明α-座椅模块组件+调谐器+细胞，按放大视野（×200）计数，并显示在面板上E类.面板中的值A类,C类、和E类为平均值±SEM（n=7）**P（P）< .01, ***P（P）<0.001 vs双喂+0.25 mL/kg CCl4.
接下来，我们比较了CCl激发的乙醇喂养和配对喂养小鼠的HSC凋亡4。如所示，数量α-座椅模块组件+调谐器+用0.1 mL/kg CCl处理的乙醇喂养小鼠的每场细胞数较低4与用0.25 mL/kg CCl处理的配对喂养小鼠相比4此外，α-SMA的百分比+调谐器+单元格/总数α-座椅模块组件+0.1 mL/kg CCl处理的乙醇喂养小鼠的细胞4低于用0.1或0.25 mL/kg CCl处理的双喂小鼠4.
乙醇摄入可消除Poly I:C在肝脏中的抗纤维化作用
上述结果表明，在纤维化发生过程中，乙醇喂养小鼠的HSC比配对喂养小鼠的细胞更耐凋亡。最近，我们发现poly I:C激活NK细胞在诱导HSC凋亡和抑制肝纤维化方面发挥了重要作用。16,18因此，我们想知道乙醇喂养是否影响由poly I:C激活的NK细胞的抗纤维化特性，如，poly I:C治疗可抑制双喂养小鼠的肝纤维化，如抑制α-SMA和羟脯氨酸；然而，这种抑制作用在乙醇喂养的小鼠中不太明显。
乙醇喂养可消除poly I:C的抗纤维化作用。注射CCl时，八周龄的乙醇喂养和配对喂养的小鼠保持相同的饮食4（0.1 mL/kg）加聚I:C或生理盐水额外2周。肝组织用抗-α-检测活化HSC的SMA抗体(A类)或进行免疫印迹(B类)或测定肝脏羟脯氨酸(C类). 面板中的值C类为平均值±SEM（n=6）*P（P）<0.05 vs相应盐水组。
乙醇喂养通过下调NKG2D和TRAIL表达抑制HSC对肝NK细胞的杀伤
在细胞毒性分析中，poly I:C处理的配对喂养小鼠的肝脏MNCs和NK细胞对活化的HSC（4天培养的HSC）分别产生约43%和49%的细胞毒性，而poly I:C处理的乙醇喂养小鼠的细胞仅分别产生约15%和13%的细胞毒性(). RT-PCR在显示poly-I:C治疗可诱导NKG2D、TRAIL、穿孔素、Fas L和IFN的显著表达-γ双喂小鼠肝脏跨国公司。在食用乙醇的小鼠中，这种诱导作用要低得多。荧光激活细胞分选分析结果表明，poly I:C处理显著提高了NK细胞和NKG2D、TRAIL和IFN的表达-γ肝脏NK1.1+来自配对喂养小鼠的细胞，而在乙醇喂养小鼠中这种诱导作用减弱().
乙醇喂养抑制肝NK细胞对HSC的杀伤，并下调NK细胞上NKG2D和TRAIL的表达。用poly I:C（5μg/g，腹腔注射）。16小时后，分离肝脏MNC或NK细胞，并用于对培养4天的HSC进行细胞毒性试验(A类). 肝脏跨国公司也接受RT-PCR分析(B类). 中的带密度面板B量化并显示在面板C.肝脏MNC也通过荧光激活细胞分选进行分析(D类). 中的值面板A,C类、和D类为平均值±SEM（n=6）*P（P）< .05, **P（P）<0.01 vs相应的配对喂养组。
乙醇喂养通过抑制HSC中IFN-γ激活的STAT1信号通路来消除IFN-γ的抗纤维化作用
聚I:C治疗通过干扰素抑制肝纤维化-γ–依赖机制。16因此，我们研究了乙醇对poly I:C抗纤维化作用的抑制是否通过阻断IFN介导-γ活动。免疫组织化学分析、Western blotting和肝羟脯氨酸含量测定表明，IFN-γ治疗对喂食小鼠的肝纤维化有抑制作用，但对乙醇喂食小鼠无抑制作用(). 这些数据表明干扰素的抗纤维化作用-γ因长期饮用乙醇而无效。干扰素体内治疗-γ抑制配对小鼠中pSmad3的表达，这可能是由于Smad7的诱导(). 相反，在乙醇喂养的小鼠中，干扰素-γ治疗仅轻微诱导Smad7蛋白表达，而不抑制pSmad3表达(). 此外，干扰素-γ在成对喂养的小鼠中治疗诱导的STAT1激活；在乙醇喂养的小鼠中，这种激活作用减弱().
乙醇喂养可消除干扰素的抗纤维化作用-γ八周龄乙醇喂养和配对喂养的小鼠保持相同的饮食，并注射CCl4（0.1 mL/kg）加干扰素-γ或生理盐水治疗2周。肝组织用抗α-SMA抗体染色以检测活化的HSC(A类)或进行免疫印迹(B类和C类)或测量肝脏羟脯氨酸(D类). 中的带密度面板B量化并显示在面板C中的值面板C和D类为平均值±SEM（n=4）*P（P）< .05, **P（P）<.01 vs相应的干扰素-γ未经处理的组。
接下来，我们比较了干扰素-γ成对（成对HSC）和乙醇喂养小鼠（乙醇HSC）HSC的信号和活性。如所示，干扰素-γ在1到100 ng/mL的剂量范围内，该治疗抑制了成对HSC的增殖，但只有高剂量的IFN-γ（50和100 ng/mL）抑制乙醇HSC增殖。干扰素治疗-γ诱导成对HSC中胱天蛋白酶-3活性水平升高，但不诱导乙醇HSC中胱天蛋白酶-3活性水平升高(). 此外，免疫细胞化学分析表明，用5或50 ng/mL IFN处理培养的HSC对细胞核后，pSTAT1阳性染色-γ，而只有50 ng/mL剂量的干扰素-γ在乙醇HSC中诱导pSTAT1活化(). 免疫印迹显示干扰素-γ处理诱导成对HSC中JAK1、JAK2和STAT1的磷酸化。这种激活在乙醇HSC中被抑制(). 此外，与成对HSC相比，SOCS1蛋白在新分离（第0天）或培养4天的乙醇HSC中的表达水平更高().
来自乙醇喂养小鼠的HSC对IFN具有耐药性-γ刺激。(A类)从8周龄配对或乙醇喂养小鼠分离的HSC培养4天（D4 HSC）并用干扰素治疗-γ24小时。然后通过以下方法测量细胞增殖[三H] 胸苷掺入试验。(B类)用干扰素刺激D4 HSC-γ（5 ng/mL）持续6或12小时。测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3活性。(C–E类)用干扰素刺激D4 HSC-γ30分钟后，用抗pSTAT1抗体免疫染色检测STAT1激活(C类)或Western印迹法(D类). 中的带密度面板D量化并显示在面板E.英寸面板F从8周龄配对和乙醇喂养小鼠分离的HSC培养4或7天。然后通过Western blotting检测SOCS1蛋白。中的值面板A,B类、和E类是3到4个独立实验的平均值±SEM*P（P）< .05, **P（P）<0.01 vs相应的配对喂养组。
与乙醇喂养小鼠肝细胞共培养的HSC中IFN-γ/STAT1信号被破坏
研究干扰素的作用机制-γ乙醇HSC中的信号传导受到抑制，我们检测了来自配对（配对肝细胞）或乙醇喂养小鼠（乙醇肝细胞）的肝细胞对IFN的影响-γHSC中的信号。如所示，干扰素-γ治疗在与成对肝细胞共培养的HSC中诱导了强烈的STAT1激活，但在与乙醇肝细胞共培育的HSCs中仅诱导了微弱的STAT1激活，这表明乙醇肝细胞抑制IFN-γHSC中的信号传导。这一结论在表明干扰素-γ在与成对肝细胞共培养的HSC中观察到pSTAT1的激活，但与乙醇肝细胞不共培养。有趣的是，干扰素-γ与乙醇肝细胞共培养的HSC中STAT1的激活通过使用抗氧化剂如抗坏血酸、Trolax和N-乙酰半胱氨酸进行预处理而恢复(). 此外，用过氧化氢（H）等氧化剂处理2O（运行）2)阻止IFN-γHSC中pSTAT1的激活和干扰素调节因子1（IRF-1）表达的诱导().
HSC与乙醇喂养小鼠肝细胞共培养抑制IFN-γ/HSC中的STAT1信号。(A类)D4 HSC与来自成对或乙醇喂养的小鼠的肝细胞共培养24小时，随后用IFN处理-γ（5ng/mL）30分钟，然后用抗pSTAT1抗体进行免疫染色。(B类)D4 HSC和肝细胞与抗氧化剂或不与抗氧化剂共培养24小时，然后用干扰素处理-γ（5 ng/mL）30分钟，然后进行Western blot分析。带的密度被量化并显示在右侧面板值表示4个独立实验的平均值±SEM***P（P）<0.001 vs不含抗氧化剂的乙醇组。(C类和D类)D4 HSC在有或无0.5 mmol/L H的条件下培养2O（运行）2持续5分钟，然后用干扰素刺激-γ（5 ng/mL）30分钟，然后用抗pSTAT1抗体进行免疫染色(C类)IRF-1表达的RT-PCR分析(D类). (E类和F类)D4 HSC与配对或乙醇喂养小鼠的肝细胞共培养24小时，然后用TGF处理-β1（2.5 ng/mL，45分钟）或干扰素-γ+TGF公司-β1（用50 ng/mL干扰素预处理-γ首先45分钟，然后2.5 ng/mL TGF-β然后用抗pSmad3抗体进行免疫染色(E类)或COL1A2表达的RT-PCR分析(F类). 中的带密度面板F量化并显示在上面的面板。数值表示5个独立实验的平均值±SEM***P（P）<0.001与相应的IFN-γ（−）转化生长因子-β（+）组。(A类,C类、和E类,黑色箭头显示阳性反应空白箭头反应很弱）。（对-Hep：对喂肝细胞；EtOH-Hep；乙醇喂肝细胞）。
此前有报道称，干扰素-γ抑制TGF-βHSC中的1个信号。32我们想知道与乙醇肝细胞共培养是否能够消除干扰素-γTGF抑制-βHSC中的1个信号。如所示、TGF-β1处理诱导与乙醇肝细胞或成对肝细胞共培养的HSC中Smad3磷酸化。IFN抑制了这种激活-γ在与配对肝细胞但不与乙醇肝细胞共培养的HSC中。此外，RT-PCR分析显示TGF-β1治疗诱导1型胶原表达α2（COL1A2）在与成对肝细胞共培养的HSC中，与乙醇肝细胞共培育的HSC的诱导作用要低得多(). 干扰素-γ预处理抑制TGF-β1在与成对肝细胞共培养的HSC中诱导COL1A2，但在与乙醇肝细胞共同培养的HSCs中不诱导().
乙醇HSC通过TGF-β1依赖机制抵抗NK细胞杀伤
在细胞毒性试验中，与成对HSC相比，培养4天的乙醇HSC对NK细胞杀伤具有抵抗力(). 因为TGF-β1与抑制NK细胞活性有关33HSC是TGF的重要生产商-βHSC激活时为1，14,15我们调查了TGF是否-β1参与了对乙醇HSC NK细胞杀伤的抵抗。RT-PCR分析显示TGF的表达-β1 mRNA在乙醇HSC中比成对HSC中强得多()表明乙醇HSC产生更多TGF-β1.此外，TGF的添加-β1降低NK细胞对成对HSC和乙醇HSC的细胞毒性。相反，TGF的添加-β1–中和抗体略微增强了NK细胞对HSC的细胞毒性，但显著增强了对乙醇HSCs的细胞毒性(). 阐明TGF的作用-β1在NK细胞上，用TGF孵育来自poly I:C处理小鼠的MNC-β1.NKG2D、TRAIL和IFN的基本表达水平-γ在来自poly-I:C处理小鼠的跨国公司中，比来自poly-I:C未处理小鼠的大，这与我们之前的报告一致。16,18有趣的是，与转化生长因子一起孵育-β1这些基因的表达减少(). 这些发现表明TGF-β活化的HSC分泌的1可能通过下调NKG2D、TRAIL和IFN来降低NK对HSC的细胞毒性-γNK细胞表达。
来自乙醇喂养小鼠的HSC对TGF杀伤NK细胞具有抵抗力-β1–依赖机制。(A类)以配对或乙醇喂养小鼠的D4 HSC为靶细胞，以聚I:C处理的正常小鼠的肝脏MNC为效应细胞。测定肝脏MNCs对D4 HSCs的细胞毒性。数值为3个独立实验的平均值±SEM**P（P）<0.01 vs相应的配对喂养组。(B类)将来自成对或乙醇喂养的小鼠的HSC培养不同的天数，然后进行RT-PCR分析。(C类)来自成对或乙醇喂养小鼠的D4 HSC与小鼠重组转化生长因子一起孵育-β1蛋白或TGF-β1个抗体持续20分钟，然后进行类似于面板A已执行。数值为6个独立实验的平均值±SEM*P（P）< .05; **P（P）<0.01 vs对应的0组。(D类)使用或不使用TGF培养经Poly I:C处理的跨国公司-β1个小时，然后表达NKG2D、TRAIL或IFN-γ通过RT-PCR分析测定。（P，双馈；Et，EtOH-fed）。
讨论
慢性饮酒是病毒性肝炎患者加速肝纤维化的主要原因之一。5–9在啮齿类动物中，乙醇喂养也能加速CCl4-诱导肝纤维化。10一般认为，乙醇喂养可增强CCl4通过诱导细胞色素P450 2E1表达进行代谢，随后增强CCl4-诱导性肝损伤。在这里，我们还确认注射相同剂量的CCl4乙醇喂养的小鼠比配对喂养的小鼠诱导更多的纤维化(). 有趣的是，即使通过注射更高剂量的CCl，两组小鼠的肝损伤水平（血清ALT水平）相似，乙醇喂养小鼠的肝纤维化进展仍比配对喂养小鼠快4在配对喂养的小鼠中(). 这表明，除了增强肝损伤外，其他机制也有助于乙醇加速肝纤维化。我们的进一步研究表明，NK细胞/IFN抗纤维化作用的减弱-γ是乙醇加速肝纤维化的另一个重要机制。慢性乙醇摄入导致纤维化加速的机制包括（1）抑制活化HSC的NK细胞杀伤，（2）诱导TGF中HSC对NK细胞杀死的抵抗-β1依赖性方式，（3）干扰素的中断-γ/通过诱导SOCS蛋白和（4）抑制IFN在HSC中传递STAT1信号-γ/通过氧化应激诱导HSC中的STAT1信号传导。我们将这些发现整合到.
通过抑制HSC NK细胞杀伤和干扰素抑制慢性酒精加速肝纤维化模型-γHSC中的信号。(1)乙醇通过下调NKG2D（NK细胞激活受体）、TRAIL和IFN的表达，直接抑制NK对HSC的细胞毒性-γ. (2)乙醇刺激HSC产生TGF-β其次是抑制HSC的NK细胞杀伤；(三)乙醇诱导SOCS1蛋白表达，然后抑制IFN-γHSC中的信号传导；(4)乙醇刺激肝细胞产生氧化应激，随后抑制干扰素-γHSC中的信号。
在调查中，我们获得了几条证据，表明长期饮用乙醇会抑制NK细胞的抗纤维化特性。首先，我们和其他人已经证明NK细胞杀死激活的HSC，这有助于肝纤维化过程中HSC的凋亡。16,17在这里，我们表明，从乙醇喂养小鼠中分离的肝NK细胞对活化HSC的杀伤作用低于从配对喂养小鼠中提取的肝NK细胞()这可能有助于在服用CCl后的乙醇喂养小鼠中观察到较少的HSC凋亡4(). 第二，聚I:C或干扰素激活NK细胞-γ抑制配对喂养小鼠的肝纤维化，但不抑制乙醇喂养小鼠的肝脏纤维化（图和). 第三，在动物实验中，饮酒会降低NK细胞活性和计数34,35以及人类酗酒者。36本研究还证实了喂食酒精后肝脏NK细胞数量和活性的下调(). 进一步研究表明，乙醇抑制HSC NK细胞杀伤可能是通过下调NKG2D、TRAIL、Fas L和IFN介导的-γNK细胞的表达(). 虽然我们的研究结果清楚地表明，乙醇摄入抑制肝脏NK细胞活性，但其潜在机制尚不清楚。乙醇对外周和脾脏NK细胞影响的研究结果表明，慢性乙醇摄入通过多种机制抑制NK细胞活性，包括皮质酮升高37阿片肽的减少β-内啡肽。38此外，Pruett等人39最近有报道称，乙醇抑制巨噬细胞中Toll样受体3（TLR3）信号的poly-I:C激活。因此，可以推测乙醇也可能抑制NK细胞中的TLR3信号传导，从而有助于乙醇对NK细胞活性的抑制。
除了抑制NK细胞对活化HSC的细胞毒性外，乙醇喂养还增强了HSC对NK杀伤的抵抗力。如所示，肝脏MNCs对从配对喂养小鼠中分离的HSCs的细胞毒性约为40%，但对乙醇喂养小鼠中的HSC的细胞毒性仅约为20%。此前，几项研究报告称，转化生长因子-β肿瘤细胞和树突状细胞分泌的1通过下调NK活化受体NKG2D，导致NK对肿瘤细胞的杀伤作用减弱。33此外，TGF的上调-β1基因及其细胞膜受体是体内外活化HSC的特征。40因此，我们假设来自乙醇喂养小鼠的HSC对NK杀伤的抵抗是通过TGF的过度生成介导的-β事实上，我们的研究结果支持这一观点。如所示，RT-PCR分析证实TGF上调-β1 mRNA在乙醇喂养小鼠HSC中的表达及阻断TGF-β1用中和抗体增加HSC对NK杀伤的敏感性，而用TGF治疗-β1减少了。直到现在，TGF-β通过抑制HSC上CD95L的表达，1被认为是活化HSC最重要的生存因子之一。41我们在本研究中的发现表明，抑制HSC的NK细胞杀伤也可能有助于TGF的重要作用-βHSC存活率为1。
NK细胞不仅通过直接杀死活化的HSC，而且通过产生IFN来改善肝纤维化-γ干扰素的抗纤维化作用-γ通过直接诱导HSC细胞周期阻滞和凋亡、刺激NK细胞对HSC的细胞毒性以及抑制TGF介导-β1以STAT1相关方式发出信号。16,18,23,24在这项研究中，我们提供了体内和体外证据，表明长期摄入乙醇会降低干扰素的抗纤维化作用-γ在肝脏中。如所示，干扰素-γ治疗抑制了配对喂养小鼠的肝纤维化，但对乙醇喂养小鼠没有抑制作用。这可能是由于干扰素的抑制-γ乙醇喂养小鼠中介导的pSTAT1激活和Smad7诱导(). 体外实验也表明干扰素的抗增殖和促凋亡作用-γ与双喂小鼠相比，从乙醇喂养小鼠中分离出的HSC减少，这可能是由于乙醇抑制干扰素-γ/这些细胞中的STAT1信号。以前，我们和其他人已经证明乙醇抑制干扰素-γ/通过蛋白激酶C、氧化应激和SOCS1诱导肝细胞中的STAT1信号通路。42,43后两种机制可能也有助于乙醇抑制干扰素-γ抗氧化治疗逆转干扰素的抑制作用，激活HSC中的STAT1-γ()酒精性HSC中SOCS1蛋白的表达远高于成对HSC(). 有趣的是，Nieto等人29,30据报道，肝细胞产生的活性氧也能刺激HSC活化。总之，饮酒可以诱导肝细胞产生氧化应激，这不仅会诱导HSC活化，还可以保护HSC免受干扰素的影响-γ–诱导细胞周期阻滞和凋亡，导致肝纤维化加速。
总之，长期饮用乙醇会刺激氧化应激和TGF的过度生成-β1、HSC对NK细胞毒性的脱敏，诱导HSC抵抗NK细胞杀伤，以及抑制IFN的抗纤维化作用-γ共同导致肝纤维化加速。抗氧化剂和中和TGF-β1抗体治疗可能在减缓酒精加速肝纤维化方面具有有益效果。
致谢
由国家卫生研究院国家酒精滥用和酒精中毒研究所内部项目提供支持。
本文中使用的缩写
| α-SMA | α-平滑肌肌动蛋白 |
| 中高音 | 丙氨酸氨基转移酶 |
| CCl公司4 | 四氯化碳 |
| COL1A2公司 | 1α2型胶原 |
| 丙型肝炎病毒 | 丙型肝炎病毒 |
| 高速列车 | 肝星状细胞 |
| 干扰素-γ | 干扰素-γ |
| IRF-1型 | 干扰素调节因子1 |
| JAK公司 | 贾纳斯激酶 |
| 跨国公司 | 单核细胞 |
| 自然杀伤细胞 | 自然杀伤细胞 |
| NKG2D公司 | 自然杀伤组2成员D |
| 聚合物I:C | 聚肌胞 |
| 逆转录聚合酶链反应 | 逆转录聚合酶链反应 |
| 社会保险公司 | 细胞因子信号转导抑制因子 |
| 斯达 | 信号转导子和转录激活子 |
| 转化生长因子-β1 | 转化生长因子-β1 |
| TLR3级 | Toll样受体3 |
| TRAIL（跟踪） | 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 |
| 调谐器 | 转移酶介导的dUTP镍标记 |
工具书类
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