癌症研究。作者手稿;PMC 2011年8月15日发布。
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横纹肌肉瘤PAX3-FKHR结合位点的全基因组鉴定揭示了对发育和癌症重要的候选靶基因
,1 ,1,2 ,1 ,1 ,1,2 ,4 ,1 ,1 ,三和1
梁操
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
于云凯
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
2蛋白质组学和分析技术实验室,SAIC-Frederick Inc,美国国家癌症研究所-Fredetrick,MD 21703
斯文·比尔克
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
罗伯特·沃克
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
林妮娅·梅耶努丁
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
2蛋白质组学和分析技术实验室,SAIC-Frederick Inc,美国国家癌症研究所-Fredetrick,MD 21703
大卫·O·阿索萨
4国家人类基因组研究所癌症遗传学分所(现地址:美国亚利桑那州凤凰城85004转化基因组研究所)
范扬
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
马尔宾·皮内达
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
李·赫尔曼
三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心儿科肿瘤科,邮编:20892
保罗·S·梅尔泽
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
1美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分部,邮编:20892
2蛋白质组学和分析技术实验室,SAIC-Frederick Inc,美国国家癌症研究所-Fredetrick,MD 21703
三美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心儿科肿瘤科,邮编:20892
4国家人类基因组研究所癌症遗传学分院(现地址:亚利桑那州凤凰城转化基因组研究所85004)
通讯作者:梁曹,美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所癌症研究中心遗传学分所,邮编:20892,电话:(301)435-9039;传真:(301)402-3241;vog.hin.liam@iloac公司 - 补充资料
1
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2
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三。
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摘要
PAX3-FKHR融合蛋白存在于大多数与侵袭性增加和预后不良相关的肺泡横纹肌肉瘤(ARMS)中。为了更好地了解PAX3-FKHR的分子发病机制,我们对ARMS中的PAX3-FKHR结合位点和相关靶基因进行了首次无偏见的全基因组鉴定。数据表明,PAX3-FK HR在两个位点与PAX3结合到相同的位点第五个多年电价和MYOD公司增强剂。全基因组分析表明,PAX3-FKHR位点为:1)大多数位于转录起始位点的远端;2) 保守;3) 丰富了PAX3图案;和4)与PAX3-FKHR阳性RMS细胞和肿瘤中过度表达的基因密切相关。在我们的数据集中,几乎没有证据表明PAX3-FKHR在启动子处结合。全基因组分析进一步说明了PAX3和这些结合位点中的E-box基序之间的强烈关联,暗示了许多靶基因的共同共同调控。我们进一步提供了第一个直接证据FGFR4公司和IGF1R型是PAX3-FKHR的目标。PAX3-FKHR结合位点图为理解PAX3-FKHR致病作用和分子靶点提供了框架,以便系统评估针对这种侵袭性RMS的药物。
介绍
成对盒转录因子(PAX)家族由9个高度相关的成员组成,在发育过程中的器官发生和组织规范中发挥关键作用,包括骨骼肌、胰腺、中枢神经系统、肾脏和免疫系统(1). 在各种单元模型系统中,圣像牌基因与维持多能状态、启动分化程序、细胞迁移、增殖和存活有关。突变和基因重排圣像牌基因经常与人类疾病和癌症相关(2–4). 特别地,PAX3系列和第7页在胚胎早期发育神经嵴和骨骼肌时需要(2,5)和基因重排FKHR公司经常与横纹肌肉瘤(RMS)有关(6).
RMS是儿童最常见的软组织肉瘤(7)包括肺泡型(ARMS)和胚胎型(ERMS)亚型。大多数ARMS与导致PAX3-FKHR(FOXO1A)或PAX7-FKHR融合蛋白的特定染色体易位相关,该融合蛋白由N端PAX3/PAX7 DNA结合域和C端FKHR-反式激活域组成(8,9). 融合蛋白被认为是比PAX3更有效的反式激活因子在体外(10,11)和体内(12). PAX3-FKHR的条件激活与墨水4a/Arf或第53页促进小鼠ARMS的发育(13). 这个PAX3-FKHR公司易位不仅是ARMS中最常见的易位,而且与治疗失败和死亡率的增加有关(14). 因此,鉴定PAX3-FKHR的直接转录靶点是很重要的。尽管PAX3-FKHR结合位点作为启动子的作用尚未得到验证,但几乎所有已发表的关于PAX3-FKHR靶点及其顺式作用序列的研究都集中于紧邻转录起始位点的启动子元件。事实上,对于PAX3的最佳研究靶点,肌源性决定基因第五个多年电价和MYOD、,负责PAX3调节的顺式作用序列是远端增强子(15–18). 由于PAX3-FKHR直接效应器的鉴定在阐明其分子致病机制和确定新的治疗靶点方面可能具有关键作用,因此下一步必须对PAX3-FKHR直接靶点进行全基因组分析。
为了阐明PAX3-FKHR的靶点,用一种新的特异性抗体对PAX3-FKHR融合蛋白进行染色质免疫沉淀和DNA测序(ChIP-seq)。我们的结果表明,大多数结合位点是保守的远端调控元件,富含PAX3和E-box/MYF基序,并且与PAX3-FKHR上调的基因密切相关。PAX3-FKHR结合位点的数据集具有高度的准确性,如以下示例所示第五个多年电价和MYOD公司增强子,其分辨率足以快速识别和确认特定的识别序列。PAX3-FKHR结合位点和相关基因的鉴定能够快速鉴定和验证其靶点,这将加强我们对肌源性发展、RMS的分子发病机制以及对该癌症靶向药物的评估的了解。
材料和方法
细胞系和试剂
所有人RMS细胞系和Rh1尤因肉瘤细胞系均保存在含有10%胎牛血清的RPMI-1640中。PAX3-FKHR公司-HA和PAX3系列和PAX3-FKHR公司表达质粒是由Michael Anderson博士和Fred Barr博士善意提供的质粒。靶向FKHR的shRNA质粒从Open Biosystems获得,靶序列为:s2,GCTTAGACTGTCATGGAAT;s4,CAGGACAATAAGTCGAGTTAT。生成shRNA载体慢病毒。在RNAi实验中,细胞被慢病毒感染3天,至少50%的细胞被感染。
定量PCR分析
用总DNA和免疫沉淀DNA对GAPDH启动子和MYF5增强子进行qPCR,引物列于表S7和SYBR Green PCR试剂盒(Qiagen)。为了定量表达分析,我们在感染慢病毒3天后使用细胞,慢病毒携带干扰或shRNA载体对抗PAX-FKHR的FKHR-部分。使用Trizol(Invitrogen)分离总RNA,并使用SuperScript III(Invit罗gen)生成cDNA。用SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR分析,共三份,引物列于表S7确定特定转录物的相对水平,与GAPDH的相对水平进行标准化。所有qPCR分析至少重复三次。
抗体和免疫印迹
如前所述进行细胞裂解物制备和免疫印迹(20). 针对融合区肽产生抗PAX3-FKHR(PFM2)的单克隆抗体(补充方法). 获取PFM2的腹水,分离IgG部分。PAX3、FKHR、MYCN、MET、ERK、AKT和肌动蛋白抗体来自细胞信号技术,IGF1R-α(C20)抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。
PAX3-FKHR增强子荧光素酶报告子分析
PAX3-FKHR结合位点使用下列引物从人类基因组DNA中扩增表S7将它们克隆到pGL3启动子载体(Promega)的SalI和BamHI位点,该载体包含萤火虫荧光素酶报告基因上游的SV40启动子。使用定点诱变试剂盒(Strategene)和中列出的引物生成突变增强子表S7所有突变均经DNA测序证实。使用双荧光素酶检测系统(Promega)进行增强剂检测,以调整转染效率的差异。报告者与激活剂质粒的比例为1:1,进行报告者联合转染实验。所有报告分析均至少重复三次。
统计分析
所有定量实验,包括免疫沉淀DNA的qPCR、特异基因表达的RT-qPCR和荧光素酶分析,均进行了三次。使用Prism(GraphPad)进行数据分析,并在图表中显示为平均值±SEM。对基因表达模式的影响是基于无效假设进行测试的,即与差异表达基因集内的结合位点相关的基因数量与所有注释基因集相比,并不大于偶然预期的数量。P(P)使用超几何分布计算值。
结果
RMS中PAX3-FKHR结合位点的全基因组定位
为了确定PAX3-FKHR的靶点,使用与融合区域对应的肽产生了一种新的单克隆抗体PFM2。抗体对PAX3-FKHR具有特异性(). PAX3-FKHR中PFM2的沉淀+Rh4细胞导致细胞增殖20–40倍第五个多年电价输入DNA的增强子,PAX3最著名的靶点(). 相反,与融合阴性RD细胞平行的ChIP没有增强子富集(). 对ChIP和输入DNA进行测序,获得396和406万个具有相似染色体分布的对齐序列标签(补充图1,补充表1). 虽然输入的DNA标签分布均匀,但在11号染色体的例子中,用PFM2 ChIP DNA鉴定出了不同的序列标签簇(). 总之,在人类基因组中共鉴定出1463个具有统计意义的假定PAX3-FKHR结合位点,平均大小为186 bp,约为每200万碱基对(mbp)1个位点(GEO no。{“类型”:“entrez-geo”,“属性”:{“文本”:“GSE19063”,“term_id”:“19063”}}GSE19063标准,请参阅补充方法有关选择标准和数据访问的详细说明)。结合位点的染色体分布与染色体长度密切相关(图S1,第页2=0.83),与雌激素受体和p53相似(补充图1,补充表1) (21,22). ChIP-seq结果具有高度的重复性,在重复实验中鉴定出80%(1166个位点)(数据未显示)。
横纹肌肉瘤细胞中PAX3-FKHR结合位点的ChIP-seq分析。A、 免疫印迹显示PFM2识别易位阳性的RMS细胞系(RMS13和Rh30)中的PAX3-FKHR蛋白。B、 定量PCR分析表明PFM2选择性免疫沉淀第五个多年电价PAX3-FKHR增强剂+Rh4细胞,不是来自阴性RD细胞。C、 PAX3-FKHR结合位点在11号染色体上的分布。峰值高度表示序列标签的数量。D、 PAX3-FKHR站点在第五个多年电价增强剂。在该PAX3依赖性增强子处,最大信号与已知的PAX3识别位点对齐。
结合位点的特异性非常好,因为Rh4中的1463个位点与通过ChIP-seq从融合阴性RD细胞获得的223个位点之间没有重叠,这也提供了400万个对齐序列(数据未显示)。结合位点的特异性通过位于第五个多年电价(). ChIP-seq识别的结合位点定义在108 bp的区域中,位于先前识别的145 bp最小PAX3反应区内第五个多年电价增强剂(17),证明PAX3-FKHR与RMS细胞中的相同位点结合,就像PAX3在发育过程中一样。标记密度的最大值位于先前显示对PAX3依赖性激活至关重要的增强子处的装箱PAX3结合序列AAGCATGACT处(17,23). 这一结果表明,数据集可能具有足够的分辨率来识别特定的识别序列。
PAX3-FKHR在保守的远端调控元件上的结合
结合位点的分析表明,绝大多数位点要么距离基因外的转录起始位点大于4kb(60.2%),要么位于内含子(32.5%)。只有0.4%的结合位点位于起始位点上游1kb内(). 此外,在起始位点上游1kb或4kb的窗口内均无结合位点富集(). 数据表明PAX3-FKHR主要与远端位点结合。富集分析进一步揭示了外显子结合位点减少()与两者的独特功能相一致。最大保守性分析表明,与随机选择的序列相比,脊椎动物中这些PAX3-FKHR结合位点具有显著的保守性。保守性程度与RNA pol-II结合位点的保守性相似(),再次表明这些PAX3-FKHR站点的功能。对1463个结合位点的分析确定1072个基因重叠或位于其附近(补充表2). 基因本体分析显示出对发育过程的偏见,包括神经、骨骼和肌肉系统的发育过程()与PAX3在早期发育中的已知作用及其在这些系统中的表达一致。因此,结合位点是保守的,并在发育过程中识别PAX3的潜在靶点。
PAX3-FKHR结合位点作为假定增强子。A、 与转录起始位点、外显子和内含子相关的PAX3-FKHR位点的分布。显示了PAX3-FKHR富集或抑制位点。单位1表示基因组中位点的平均数。B、 与Pol-II ChIP-seq位点和随机生成的序列标签相比,PAX3-FKHR位点的保守性。C、 利用Ingenuity IPA对PAX3-FKHR位点相关基因进行基因本体分析。D、 RD细胞中PAX3-FKHR位点与PAX3-FKHR上调基因的相关性(表S3)PAX3/7-FKHR阳性RMS肿瘤中基因上调(表S4).
PAX3-FKHR位点的检测提供了PAX3/PAX3-FKHR与骨骼、肌肉发育和RMS相关基因之间的直接联系(). 这些基因参与生长、生存和肿瘤发生、细胞迁移和肿瘤转移,以及肌源性分化的重要基因。在重复实验中,它们的所有结合位点都得到了重新确认。尽管它们在肌肉发育和癌症中起着作用,但许多以前并不知道它们是PAX3或PAX3-FKHR的直接靶点,而且在大多数情况下,PAX3-FKHR依赖的调节元件没有定义。
表1A
身份证件 | Entrez基因名称 | 位置 | 类型 | 药物 |
---|
自我更新、生长、存活、致癌 |
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ALK公司 | 间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶 | 质膜 | 受体激酶 | PF-02341066型 |
FGFR2型 | 成纤维细胞生长因子受体2 | 质膜 | 受体激酶 | TKI-258,AZD2171,布里瓦尼,PHA-739358 |
FGFR4公司 | 成纤维细胞生长因子受体4 | 质膜 | 受体激酶 | |
IGF1R型 | 胰岛素样生长因子1受体 | 质膜 | 受体激酶 | CP-751871、AMG479、R1507、MK-0646、AVE1642 |
韩国存托凭证 | 激酶插入域受体 | 质膜 | 受体激酶 | 贝伐单抗、舒尼替尼、瓦塔兰尼、索拉非尼、万德他尼 |
中小企业1 | 梅斯同源盒1 | 核 | 转录因子 | |
MYCN公司 | v-myc骨髓细胞瘤病毒相关癌基因,神经母细胞瘤衍生 | 核 | 转录因子 | |
喷雾1 | 萌芽同源物1,FGF信号的拮抗剂(果蝇) | 质膜 | FGFR4配体 | |
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迁移、转移 |
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CXCR4系列 | 趋化因子(C-X-C基序)受体4 | 质膜 | 全球采购控制报告 | 吉咪3100 |
遇见 | met原癌基因(肝细胞生长因子受体) | 质膜 | 受体激酶 | PF-02341066型 |
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肌源性分化 |
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眼睛A2 | 眼睛缺失同源物2(果蝇) | 核 | 磷酸酶 | |
眼睛A4 | 眼睛缺失同源物4(果蝇) | 细胞质 | 磷酸酶 | |
MEOX1(墨西哥) | 间充质同源盒1 | 核 | 转录因子 | |
MEOX2公司 | 间充质同源盒2 | 核 | 转录因子 | |
5/6多年电价 | 肌生成因子6(herculin) | 核 | 转录因子 | |
MYOD1年 | 肌源性分化1 | 核 | 转录因子 | |
PRRX1系列 | 配对同源异形盒1 | 核 | 转录因子 | |
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其他潜在目标 |
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ABAT公司 | 4-氨基丁酸转氨酶 | 细胞质 | 酶 | 丙戊酸 |
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ADRA1D公司 | 肾上腺素能α-1D-受体 | 质膜 | 全球采购控制报告 | 哌啶酮、利培酮、安替唑林、对乙酰氨基酚、肾上腺素、对乙酰氨酚 |
美国存托凭证协会 | 肾上腺素能,α-2A-,受体 | 质膜 | | |
ADRA2C公司 | 肾上腺素能,α-2C-,受体 | 质膜 | | |
DHFR公司 | 二氢叶酸还原酶 | 未知 | 酶 | 乙胺嘧啶、甲氧苄啶、环磷酰胺、甲氨蝶呤、, |
与RMS中PAX3-FKHR上调基因相关的PAX3-FKHR位点
为了建立结合位点与PAX3-FKHR调控的基因之间的相关性,对PAX3-FKHR上调和下调的基因进行了相关分析PAX3-FKHR公司当通过逆转录病毒转导引入RD细胞时(24). PAX3-FKHR上调的基因中PAX3-FKHR结合位点的富集倍数为7倍,为37.7%;然而,在5%的PAX3-FKHR下调基因中,没有发现PAX3-FKHR位点的富集(,补充表3). 超几何分布分析表明,具有PAX3-FKHR位点的基因与PAX3-FKHR上调的基因之间的关联具有统计学意义(p<0.0001)。除了与具有外源性PAX3-FKHR的同基因RMS细胞相关外,在160例RMS肿瘤中,结合位点和上调基因之间也有很强的相关性(25). 在PAX3/7-FKHR阳性RMS中表达增加的363个基因中,24.2%具有结合位点(,补充表4). 相反,在122个表达减少的基因中,只有5.7%有结合位点。此外,超几何分布分析表明这种关联是显著的(p<0.0001)。因此,PAX3-FKHR位点与PAX3-FKHR上调的基因密切相关在体外在具有PAX3/7-FKHR易位的RMS细胞和RMS肿瘤中。
PAX3-FKHR结合MYOD公司新定义的PAX3识别序列的核心增强子并调节其他肢体发育基因
MYOD公司是骨骼肌发育的主控者(26). PAX3调节MYOD公司通过MYOD公司堆芯增强剂(15,27). 我们对PAX3-FKHR位点的全基因组分析显示,在161 bp的区域有一个结合位点,位于先前绘制的258 bp内MYOD公司堆芯增强剂(). 有趣的是,结合信号峰的序列检查确定了一个新的PAX3识别序列AACCCGTGAC(box)。为了确认该PAX3识别序列的作用,用该MYOD增强子构建了一个增强子报告子,然后通过定点突变获得一个突变体,以灭活PAX3的识别序列。增强子分析表明,这种特殊的PAX3识别序列负责PAX3和PAX3-FKHR依赖性激活核心增强子(). 因此,我们的数据能够识别PAX3和PAX3-HKFR-介导的激活MYOD公司核心增强剂。除了第五个多年电价和MYOD公司,我们在几个对肌肉和肢体发育重要的额外转录因子中发现了新的PAX3-FKHR结合位点,并可能对包括同源盒基因在内的ARMS产生影响MEOX1(墨西哥),MEOX2公司、和PRRX1系列(). 通过增强子分析、定点突变和PAX3-FKHR shRNA缺失来验证所选位点(补充图2、3).
中的PAX3识别序列MYOD公司核心增强子和PAX3和E-box基序在结合位点的共同富集。A类,在MYOD公司核心增强子和转染A204 RMS细胞中位点的定点突变研究。B类,在PAX3-FKHR位点中富集转录因子基序,并聚集顶部富集的基序。C类,从头基序搜索的结果,其中前10个基序中有9个与E-box或PAX3基序有关(见表S6详细信息)。D类PAX3-FKHR位点中PAX3和E-box基序的共同富集。PAX3B或LBP1被锚定,且锚定100 bp范围内的其他位点相对富集。
PAX3-FKHR位点内PAX3和E-box基序的全基因组共富集
关于PAX3如何调节基因表达的知识有限。它是一种弱的反式激活因子,可能需要其他元素来调节基因表达。骨骼肌分化的遗传层次分析表明MYOD公司表达式需要两者PAX3系列和第五个多年电价(28). 分析MYOD公司核心增强子显示了其在骨骼肌谱系中表达所需的几个E-box基序(27). 我们询问PAX3和E-box基序的存在是否是PAX3-FKHR结合位点的常见属性。PAX3-FKHR位点的转录因子基序分析表明,PAX3_B是最丰富的基序,为21.7倍,还有几个相关的成对盒基序(补充表5和图3B). 有趣的是,其他几个基序也得到了丰富:AP4的12.9倍和LBP1的11.1倍,共享一个共同的CAGCTG E-box基序。因此,PAX3-FKHR位点的基序分析揭示了PAX3和E-box基序的全基因组富集。为了确认结果,使用DME对ChIP-Seq数据进行从头基序分析(29). 在前10个输出基序中,至少有5个是PAX3或高度相关基序,其他4个是使用Transfac数据库的E-box相关基序(,补充表6). 因此,PAX3-FKHR位点的基序和从头分析揭示了PAX3和E-box基序的全基因组选择性富集。
我们问这是否是因为这两个相邻的主题的共同定位。当PAX3_B被用作锚定时,LBP1和AP4基序(E-box)在锚定的100 bp内都富集了7–8倍(). PAX3_B位点和对照(CREBP1或PPAR-α)均未在PAX3_B锚附近富集。同样,当LBP1被用作锚时,只有PAX3_B基序被富集了14倍。因此,PAX3和E-box基序的全基因组分析表明,它们在PAX3-FKHR结合位点上具有很强的共定位。这些观察结果表明,除了MYOD外,PAX3和MYF/E-box蛋白在调节许多靶点的表达方面发挥着广泛的作用。
FGFR4公司是PAX3-FKHR的直接目标
FGF信号通路已被证实体内在肌肉发生过程中促进细胞增殖和分化(30). FGFR4在PAX3通过下游增强子控制的肌源性分化过程中表达(31). 最近,通过鉴定7%RMS中FGFR4的激活突变,强调了该途径的重要性(19)促进异种小鼠的转移。FGFR4的表达水平与ARMS和低生存率有关(19). 我们的结果显示FGFR4公司(). 两者都是假定的FGFR4公司将增强子序列克隆到增强子报告子中并用于增强子分析。结果表明,PAX3-FKHR中检测到增强子活性+Rh4和Rh30细胞,但在阴性Rh18细胞中没有(). 远端FGFR4.E2的活性显著高于FGFR4.E1。在对RD细胞的共转染实验中,每立方英尺能够诱导E1和E2活性()其中E2是一种更强的增强子。
PAX3-FKHR相关增强子的精细映射FGFR4公司基因。A类,ChIP-seq结果确定了两个PAX3-FKHR结合位点FGFR4公司FGFR4.E2结合信号的峰值与保守的PAX3序列相关。B类PAX3-FKHR(P3F)阳性和阴性细胞中结合位点的活性均增强;和联合转染PAX3系列或PAX3-FKHR公司RD细胞中的表达质粒。C类,PAX3识别序列FGFR4.E2增强子的定点突变导致RD细胞中PAX3或PAX3-FKHR的反激活缺失。D类RT-qPCR数据显示慢病毒shRNA(s2)载体下调PAX3-FKHR导致Rh4中ALK和FGFR4 mRNA减少。
FGFR4.E2的检测揭示了PAX3和E-box识别序列,它们在脊椎动物中都是保守的(). 假定PAX3识别位点的突变导致PAX3-FKHR依赖诱导完全失活(). 数据表明,PAX3-FKHR结合位点下游FGFR4公司是PAX3-FKHR依赖增强子。
要确定FGFR4公司在依赖PAX3-FKHR的RMS细胞中,Rh4细胞感染了一种慢病毒,该慢病毒含有靶向PAX3-FKHR的shRNA(s2)。分离RNA并分析PAX3-FKHR和FGFR4 mRNA水平。结果表明,该shRNA降低了PAX3-FKHR和FGFR4 mRNA水平(P3F.s2,). 因此,PAX3-FKHR负责融合阳性RMS细胞系中FGFR4 mRNA水平的升高。
值得注意的是,我们的研究可能为PAX3-FKHR依赖性调节提供更准确的数据遇见与之前的报告相比遇见启动子由PAX3调节(32),我们的数据确定了两个PAX3-FKHR结合位点遇见增强子报告分析显示两者均被PAX3和PAX3-FKHR激活(;补充图4). 由于这些序列在RMS细胞中被PAX3-FKHR选择性结合,结果表明遇见由PAX3或PAX3-FKHR通过内含子增强子调节。
PAX3-FKHR依赖增强子的鉴定ALK公司和MYCN公司
在含有PAX3-FKHR近端或内部结合位点的基因中,Ingenuity Pathway(Ingenuity Systems)分析揭示了与发育、骨骼和肌肉疾病最强的疾病相关性,其中MYCN与之有关(补充图5). 除了在神经母细胞瘤中被放大外,MYCN公司与不良结果相关的两个均方根值中约有20%被放大(33). 然而,其在ARMS中的表达显著高于ERMS。此外,MYCN表达的增加仅与ARMS的预后较差有关,而与ERMS无关。我们的ChIP-seq数据显示,位于转录起始下游96.8 kb处的一个结合位点可以服务于PAX3-FKHR依赖性增强子(). 此外,一组RMS细胞系的蛋白质分析显示,只有PAX3-FKHR融合阳性的RMS细胞中MYCN水平最高()并且通过靶向PAX3-FKHR的shRNA下调()提示PAX3-FKHR在RMS中MYCN表达中的作用。
胰岛素样生长因子1受体作为PAX3-FKHR事务激活的目标。A类,2中PAX3-FKHR结合位点的鉴定第的内含子IGF1R型显示了两个实验中输入和PFM2 IP DNA的ChIP-seq结果。B类PAX3和PAX3-FKHR依赖激活IGF1R型共转染RD细胞中的增强子。C类、一组RMS细胞系中IGF1R、MYCN、MET和PAX3-FKHR的免疫印迹。D类,针对PAX3-FKHR的shRNA慢病毒载体导致Rh4中IGF1R、MYCN和MET的下调。
虽然最初在淋巴瘤易位中发现,但激活了ALK公司最近也与神经母细胞瘤有关(34–37). 我们的ChIP-seq数据再次显示,在3第个的内含子ALK公司是一种非常有效的PAX3-FKHR依赖性增强子(). 用含有PAX3-FKHR shRNA(s2)的慢病毒感染Rh4细胞导致ALK mRNA显著减少(). 因此,ALK公司PAX3-FKHR也可以调节其表达。
PAX3-FKHR直接上调IGF1R,IGF1R可作为抗IGF1R治疗的生物标志物
众所周知,PAX3对肌肉祖细胞的增殖和存活至关重要(38,39). 虽然目前尚不清楚PAX3是如何实现这些功能的,但PAX3-FKHR可能以对生长和生存以及RMS发育重要的基因为靶点。PAX3-FKHR靶点的灵巧路径分析也揭示了发育障碍网络中的IGF1R(补充图5). 这个IGF1R型在第二个内含子中有PAX3-FKHR结合位点(). 当克隆到增强子报告子中时,它表现出依赖于PAX3或PAX3-FKHR的特定增强子活性(). 对RMS细胞株中IGF1R蛋白水平的分析表明,与PAX3-FKHR融合蛋白有明显的相关性,其中含有融合蛋白的所有四个细胞株都具有高水平的IGF1R(). 为了证明PAX3-FKHR对IGF1R表达升高的需求,用两种靶向PAX3-FKHR的shRNA慢病毒载体感染Rh4细胞。结果表明,除了下调PAX3-FKHR外,这些RNAi载体还降低了IGF1R蛋白水平,与MET类似()而ERK和AKT水平是恒定的。结果表明,PAX3-FKHR可以直接上调IGF1R。
讨论
在本研究中,我们展示了ARMS中PAX3-FKHR结合位点的高分辨率全基因组图谱。据我们所知,这是第一个PAX蛋白的全基因组图谱。对PAX3-FKHR如何驱动ARMS肿瘤发生的理解取决于开发一个由这种异常致癌转录因子直接调控的基因的综合目录。先前对PAX3-FKHR调控基因的表达阵列分析提供了差异表达基因的信息(40–42). 然而,这种方法有很大的局限性,因为它无法确定直接靶点,也无法将基因与特定的顺式作用序列联系起来进行后续研究。启动子分析虽然经常用于研究假定的PAX3-FKHR调控基因,但完全局限于紧邻转录起始点的序列。PAX3靶点的开发研究表明,PAX3通过远端增强子调控肌源性启动基因(15–18,31). 虽然我们的PAX3-FKHR结合位点结果显示PAX3依赖增强子与第五个多年电价和MYOD公司,通过转基因动物模型鉴定,我们的数据未能为几乎所有先前关于PAX3 FKHR介导基因调控的表征的报道提供支持,因为它们主要集中在有限的启动子序列上(43–45). 在一个例子中,我们展示了两种内含子增强子遇见,不是在前面描述的遇见发起人。PAX3基序相当退化,我们的数据显示,基因组中预测的PAX3模序中只有约千分之一实际上与PAX3-FKHR结合(补充表5). 我们认为,传统的基于质粒的报告分析是必要的,但不足以确定调控序列的作用以及PAX3-FKHR与这些序列的结合体内本质上是。总的来说,在我们的全基因组分析中,只有0.4%的结合位点位于转录开始的上游1kb内。结合位点是保守的远端元件,富含PAX3基序,存在于与发育过程相关的基因中,并与RMS细胞和肿瘤中PAX3-FKHR诱导的基因相关。我们的PAX3-FKHR结合位点的全基因组图为ARMS转化活性的作用提名了众多候选基因,并强烈建议该融合癌基因的作用是通过影响成肌细胞分化、迁移、增殖和存活的通路网络来实现的(). 因此,PAX3-FKHR结合位点图谱应为其下游靶点和发病机制的未来研究提供框架。
我们的研究还为理解PAX3或PAX3-FKHR介导的基因调控提供了基因组概述。此前已确定第五个多年电价(E-box蛋白)和PAX3系列是正常的遗传要求MYOD公司表达式(28). 我们对PAX3-FKHR位点的全基因组分析表明,PAX3和E-box基序在这些位点上共同定位,表明PAX3与MYF-like E-box蛋白可能共同调节许多靶基因。这种共同调控在发育和癌症中的作用是未来研究的问题。
PAX3-FKHR在ARMS中的作用机制也可以被视为异常肌肉发育的一种形式。PAX3-FKHR导致其他发育转录因子的持续表达可能是ARMS发病机制的一个重要方面。除了肌源性E-box因子外,我们还确定了一些同源异型盒基因作为PAX3-FKHR靶点。我们的数据显示PAX3-FKHR与MEOX1(墨西哥),MEOX2公司和PRRX1系列并对他们的表达负责。间充质同源盒基因1和2(MEOX1(墨西哥),MEOX2公司)表达于产生结缔组织、软骨、肌肉和轴向骨骼的体节。这两个基因都与轴向骨骼和肢体肌肉的发育有关(46). PAX3和MEOX2在大多数迁移的成肌细胞中共同表达,纯合的四肢无MEOX2Pax3型服务提供商老鼠(47). 类似地,PRRX1系列与肢体发育有关。突变纯合子小鼠优先级x1出生后不久即死亡,并表现出骨骼发育缺陷(48). PRRX1在纯合子中的表达水平显著降低Pax3型服务提供商老鼠(49). 因此,我们的工作在ARMS中发现了由PAX3-FKHR驱动的新的发育转录因子(可能在正常发育中由PAX3驱动)。确定这些转录调节因子中的哪些对建立ARMS表型很重要,以及它们如何发挥作用,是未来研究的重要问题。
PAX3-FKHR直接调控的基因和途径的鉴定为更好地了解ARMS的分子发病机制、挖掘新的治疗靶点以及为开发新的药物提供生物标志物提供了机会。在这方面,我们的研究确定ALK、FGFR4、IGF1R和MYCN公司作为PAX3-FKHR的直接靶点,可能在RMS发病机制中发挥重要作用。先前的研究表明,MYCN扩增和过度表达与ARMS的不良预后相关(33)它位于PAX3-FKHR下游(50). 我们的数据确定了PAX3-FKHR依赖的调控序列MYCN公司此外,我们的数据表明ALK公司作为RMS中PAX3-FKHR的目标,开启了对以下角色进行后续调查的可能性ALK公司最后,本研究提供的PAX3-FKHR靶点的综合图将有助于寻找RMS的治疗方法。虽然目前不可能以PAX3-FKHR本身为靶点,选择性靶向PAX3-FKHR调节的一个或多个关键蛋白,如IGF1R或FGFR4,可能会改善这种侵袭性癌症患者的预后。我们的结果提供了关于FGFR4公司PAX3-FKHR在ARMS最近建议为体内肿瘤生长与肺转移(19). 我们的数据进一步证明,PAX3-FKHR调节IGF1R型RMS中的表达。我们先前表明,其表达升高与RMS对IGF1R治疗性抗体的敏感性直接相关,并且抑制IGF1R导致AKT信号的深度降低在体外和体内(20). 因此,PAX3-FKHR靶点的系统识别为评估靶向治疗药物对该肿瘤中主要致病基因畸变驱动的信号通路的作用提供了蓝图。
表1B
折叠归纳依据
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基因 | Enh编号。 | 结合强度 | 无 | PAX3系列 | PAX3-FKHR | 相对位置 | Dist.Tx开始bp | Dist.Tx结束bp |
---|
矢量 | 无 | 不适用 | 1 | 1 | 0.9 | 不适用 | 不适用 | 不适用 |
ALK公司 | 1 | 高的 | 2.6 | 10.8 | 19.5 | 第三内含子 | −262,835 | 464,601 |
FGFR4公司 | 1 | 低的 | 1.5 | 1.9 | 3.7 | 下游3' | −8,913 | −839 |
FGFR4公司 | 2 | 高的 | 1.9 | 5.7 | 8.3 | 下游3' | −16,273 | −8199人 |
胰岛素样生长因子1受体 | 1 | 医学 | 1.8 | 4 | 4.8 | 第二内含子 | −136,375 | 171,486 |
遇见 | 1 | 低 | 3.9 | 10.2 | 7.4 | 第三内含子 | −35,329 | 61,711 |
遇见 | 2 | 高 | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 第18内含子 | −83,277 | 13,763 |
MYCN公司 | 1 | 医学 | 0.9 | 3.8 | 5.4 | 下游3' | −96,819 | −92,786 |
MEOX1(墨西哥) | 1 | 医学 | 1.2 | 2.4 | 5.4 | 上游5' | 994 | 20,274 |
MEOX2公司 | 1 | 高 | 0.8 | 0.8 | 3.8 | 1个内含子 | −798 | 73,218 |
PRRX1系列 | 1 | 医学 | 0.6 | 2.1 | 18.2 | 第一个介绍 | −4,226 | 67,742 |
致谢
我们感谢弗雷德·巴尔博士和迈克尔·安德森博士PAX3系列和PAX3-FKHR公司质粒、安德鲁·史密斯(Andrew Smith)(DME分析协助)、康志刚(Zhigang Kang)和肖恩·戴维斯(Sean Davis)(技术协助)。
赠款支持
这项研究得到了美国国立卫生院国家癌症研究所的校内研究计划的支持。根据N01-CO-12400合同,该项目也得到了美国国立卫生研究院联邦资金的部分资助。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策,提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。
参考文献
1Blake JA、Thomas M、Thompson JA、White R、Ziman M.《困惑的帕克斯:从谜题到范式》。开发动态。2008;23710:2791–803.[公共医学][谷歌学者] 2白金汉M,Relaix F.Pax基因在组织和器官发育中的作用:Pax3和Pax7调节肌肉祖细胞功能。年收入细胞开发生物。2007;23:645–73.[公共医学][谷歌学者] 三。Robson EJ,He SJ,Eccles MR PAX基因在癌症和发育中的PANorama。Nat Rev癌症。2006;61:52–62。[公共医学][谷歌学者] 4Lang D、Powell SK、Plummer RS、Young KP、Ruggeri BA。PAX基因:在发育、病理生理学和癌症中的作用。生物化学药理学。2007;731:1–14.[公共医学][谷歌学者] 5白金汉M.骨骼肌祖细胞和Pax基因的作用。C R生物。2007;3306–7:530–3.[公共医学][谷歌学者] 6肺泡横纹肌肉瘤中涉及PAX和FOX家族成员的基因融合。致癌物。2001;2040:5736–46.[公共医学][谷歌学者] 7Kramer S、Meadows AT、Jarrett P、Evans AE。儿童癌症发病率:基于人群的十年登记经验。美国国家癌症研究所杂志。1983;701:49–55.[公共医学][谷歌学者] 8Galili N、Davis RJ、Fredericks WJ等。肺泡横纹肌肉瘤实体瘤中叉头结构域基因与PAX3的融合。自然遗传学。1993;53:230–5.[公共医学][谷歌学者] 9Barr FG,Galili N,Holick J,Biegel JA,Rovera G,Emanuel BS。儿科实体瘤肺泡横纹肌肉瘤中PAX3配对盒基因的重排。自然遗传学。1993;32:113–7.[公共医学][谷歌学者] 10Fredericks WJ、Galili N、Mukhopadhyay S等。肺泡横纹肌肉瘤中t(2;13)易位产生的PAX3-FKHR融合蛋白是比PAX3更有效的转录激活剂。分子细胞生物学。1995;153:1522–35. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Bennicelli JL、Advani S、Schafer BW、Barr FG。PAX3和PAX7具有保守的顺式转录抑制结构域,在肺泡横纹肌肉瘤中利用了常见的功能获得机制。致癌物。1999;1830:4348–56.[公共医学][谷歌学者] 12Relaix F、Polimeni M、Rocancourt D、Ponzetto C、Schafer BW、Buckingham M。转录激活物PAX3-FKHR可修复PAX3突变小鼠的缺陷,但通过体内Met信号的配体诱导激活诱导肌源性功能获得表型。基因发育。2003;1723:2950–65. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Keller C、Arenkiel BR、Coffin CM、El-Bardesy N、DePinho RA、Capecchi MR。条件Pax3:Fkhr小鼠肺泡横纹肌肉瘤:Ink4a/ARF和Trp53功能丧失的协同性。基因发育。2004;1821:2614–26. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Sorensen PH、Lynch JC、Qualman SJ等。PAX3-FKHR和PAX7-FKHR基因融合是肺泡横纹肌肉瘤的预后指标:一份来自儿童肿瘤学小组的报告。临床肿瘤学杂志。2002;2011:2672–9.[公共医学][谷歌学者] 15Goldhamer DJ、Faerman A、Shani M、Emerson CP.、Jr控制myoD谱系特异性表达的调控因素。科学。1992;2565056:538–42。[公共医学][谷歌学者] 16Goldhamer DJ、Brunk BP、Faerman A、King A、Shani M、Emerson CP.、Jr myoD基因的胚胎激活由高度保守的远端控制元件调节。发展。1995;1213:637–49.[公共医学][谷歌学者] 17Bajard L、Relaix F、Lagha M、Rocancourt D、Daubas P、Buckingham ME。前轴肌发生期间的一种新的遗传层次功能:Pax3直接激活肢体肌祖细胞中的Myf5。基因发育。2006;2017:2450–64. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Hadchouel J、Tajbakhsh S、Primig M等。Myf5的模块化远程调节揭示了小鼠胚胎骨骼肌之间意外的异质性。发展。2000;12720:4455-67。[公共医学][谷歌学者] 19Taylor JGt,Cheuk AT,Tsang PS等。在异种移植模型中识别人类横纹肌肉瘤中促进转移的FGFR4激活突变。临床投资杂志。2009;11911:3395–407. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Cao L,Yu Y,Darko I,等。对胰岛素样生长因子I受体升高的成瘾和AKT通路的初始调节决定了横纹肌肉瘤对靶向抗体的反应性。癌症研究。2008;6819:8039–48. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21Carroll JS、Meyer CA、Song J等。雌激素受体结合位点的全基因组分析。自然遗传学。2006;3811:1289–97.[公共医学][谷歌学者] 22Wei CL,Wu Q,Vega VB,等。人类基因组中p53转录因子结合位点的全球地图。单元格。2006;1241:207–19.[公共医学][谷歌学者] 23Buchberger A、Freitag D、Arnold HH。同源配对的结构域结合基序指导肢体肌肉祖细胞中Myf5的表达。发展。2007;1346:1171–80.[公共医学][谷歌学者] 24Davicioni E、Finckenstein FG、Shahbazian V、Buckley JD、Triche TJ、Anderson MJ。PAX-FKHR基因表达特征的鉴定,定义了分子类别并决定了肺泡横纹肌肉瘤的预后。癌症研究。2006;6614:6936–46.[公共医学][谷歌学者] 25Davicioni E、Anderson MJ、Finckenstein FG等。横纹肌肉瘤的分子分类——诊断的基因型和表型决定因素:儿童肿瘤组的报告。《美国病理学杂志》。2009;1742:550–64. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Tapscott SJ、Weintraub H.MyoD和螺旋-环-螺旋蛋白对肌肉发生的调节。临床投资杂志。1991;874:1133–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Kucharczuk KL、Love CM、Dougherty NM、Goldhamer DJ。MyoD核心增强子的精细转基因图谱:MyoD受肌细胞和非肌细胞肌谱系中不同但重叠的机制调节。发展。1999;1269:1957–65.[公共医学][谷歌学者] 28Tajbakhsh S、Rocancourt D、Cossu G、Buckingham M。重新定义控制骨骼肌发生的遗传层次:Pax-3和Myf-5作用于MyoD上游。单元格。1997;891:127–38.[公共医学][谷歌学者] 29Smith AD,Sumazin P,Zhang MQ.鉴定脊椎动物启动子中的组织选择性转录因子结合位点。美国国家科学院院刊。2005;1025:1560–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30白金汉脊椎动物的肌源性祖细胞和骨骼肌生成。当前操作基因开发。2006;165:525–32.[公共医学][谷歌学者] 31Lagha M、Kormish JD、Rocancourt D等。FGF信号的Pax3调节影响胚胎祖细胞进入肌源性程序的进程。基因发育。2008;2213:1828–37. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Epstein JA、Shapiro DN、Cheng J、Lam PY、Maas RL。Pax3在肢体肌肉发育过程中调节c-Met受体的表达。美国国家科学院院刊。1996;939:4213–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Williamson D,Lu YJ,Gordon T,等。横纹肌肉瘤中MYCN拷贝数和表达之间的关系以及肺泡亚型中不良预后的相关性。临床肿瘤学杂志。2005;234:880–8。[公共医学][谷歌学者] 34Chen Y,Takita J,Choi YL等。神经母细胞瘤中ALK激酶的致癌突变。自然。2008;4557215:971–4.[公共医学][谷歌学者] 35George RE、Sanda T、Hanna M等。激活ALK突变为神经母细胞瘤提供治疗靶点。自然。2008;4557215:975–8. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36Janoueix-Lerosey I,Lequin D,Brugieres L,等。神经母细胞瘤中ALK激酶受体的体细胞和种系激活突变。自然。2008;4557215:967–70.[公共医学][谷歌学者] 37Mosse YP,Laudenslager M,Longo L,等。ALK作为主要家族性神经母细胞瘤易感基因的鉴定。自然。2008;4557215:930–5. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Relaix F、Montarras D、Zaffran S等。Pax3和Pax7在成人肌肉祖细胞中具有不同的重叠功能。细胞生物学杂志。2006;1721:91–102. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Relaix F、Rocancourt D、Mansouri A、Buckingham M.A骨骼肌祖细胞的Pax3/Pax7依赖性群体。自然。2005;4357044:948–53.[公共医学][谷歌学者] 40Khan J、Bittner ML、Saal LH等。cDNA微阵列检测PAX3-FKHR融合癌基因对肌源性转录程序的激活。美国国家科学院院刊。1999;9623:13264–9. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Barber TD、Barber MC、Tomescu O、Barr FG、Ruben S、Friedman TB。PAX3和PAX3-FKHR调控的胚胎发生和肺泡横纹肌肉瘤靶基因的鉴定。基因组学。2002;793:278–84.[公共医学][谷歌学者] 42Begum S、Emami N、Cheung A、Wilkins O、Der S、Hamel PA。Pax3和Pax3/FKHR对不同基因靶点集的细胞型特异性调节。致癌物。2005;2411:1860–72.[公共医学][谷歌学者] 43Epstein JA,Song B,Lakkis M,Wang C.肿瘤特异性PAX3-FKHR转录因子(而非PAX3)激活血小板衍生生长因子α受体。分子细胞生物学。1998;187:4118–30. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Tarnowski M、Grymula K、Reca R等,人类横纹肌肉瘤中基质衍生因子-1受体:CXCR4和CXCR7的表达调控。摩尔癌症研究。81:1–14. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Zhang L,Wang C.一类新的PAX3-FKHR靶启动子的鉴定:PAX3配对盒DNA结合域的作用。致癌物。2007;2611:1595–605. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 46Candia AF、Hu J、Crosby J等。Mox-1和Mox-2定义了一个新的同源异型盒基因亚家族,并在小鼠胚胎早期中胚层模式中差异表达。发展。1992;1164:1123–36.[公共医学][谷歌学者] 47Mankoo BS、Collins NS、Ashby P等。Mox2是控制肢体肌肉发育的遗传层次的组成部分。自然。1999;4006739:69–73.[公共医学][谷歌学者] 48Martin JF、Bradley A、Olson EN。配对同源框基因MHox是多个谱系中骨骼发生的早期事件所必需的。基因发育。1995;910:1237–49.[公共医学][谷歌学者] 49Conway SJ、Henderson DJ、Copp AJ。Pax3是小鼠心脏神经嵴迁移所必需的:来自splotch(Sp2H)突变体的证据。发展。1997;1242:505–14.[公共医学][谷歌学者] 50Mercado GE,Xia SJ,Zhang C,et al.肺泡型和胚胎型横纹肌肉瘤差异表达PAX3-FKHR调节基因的鉴定:将MYCN作为生物学相关靶点。基因染色体癌。2008;476:510–20.[公共医学][谷歌学者]