肝病学。作者手稿;PMC 2011年6月1日发布。
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进展性非酒精性脂肪性肝病中NKT细胞的积聚
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Wing-Kin同步
1美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科
叶吞乌
2英国伯明翰埃德巴斯顿伯明翰大学肝脏研究中心
蒂亚戈·佩雷拉
1美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科
三Nücleo de Doenças Infecciosas、Centro de Ciéncias da Saüde、Universidade Federal do Espírito Santo、Vitória、Espí》Santo、巴西
游戏F卡拉卡
1美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心消化内科
容美美(Youngmi Jung)
1美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科
阿莱西亚·奥梅内蒂
1美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科
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史蒂夫·S·崔
1美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心内科消化科
4美国北卡罗来纳州达勒姆市达勒姆退伍军人事务医疗中心医学部胃肠病学科
辛西娅·D·盖伊
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瓦妮莎·塔贝里
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大卫·H·亚当斯
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安娜·梅·迪尔
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6美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心外科
联系方式:Anna Mae Diehl,医学博士Florence McAlister教授兼胃肠科主任Duke University Snyderman Bldg.,Suite 1073 595 LaSalle Street Durham,NC 27710电话:919-684-4173或919-684-2616传真:919-64-4183400lheid处的ude.ekud.cm - 补充资料
补充图S1。
指南:499A7083-EC49-4DCE-8D1E-922C95DF416A
补充图S2。
GUID:734758D7-5589-438E-BC5F-63C65B71BE5E
补充图S3。
GUID:8BEAE47C-92DB-4DB9-8E3C-F0A099848A58
补充表S1。
GUID:91F0C1D7-7C8E-40C0-9B06-44344E7D97A5
补充数据。
GUID:5E298D96-D471-4A4B-A45E-95756F57F140
6
补充人物图例
补充图1。MCD饮食对肝纤维化基因表达的影响。QRT PCR用于比较Legend to数据表示为平均值+/-SEM。*与喂食对照小鼠相比,P<0.05。
补充图2。人类NASH中Shh配体和Hh靶基因Gli2表达与纤维化分期相关的差异。(A) 具有轻度纤维化(F0-1)(左)或晚期纤维化(F3-4)(右)的代表性NASH患者的H&E染色切片。最终放大100X。(B) 伴有早期纤维化(左)或晚期纤维化(右)的NASH中Shh和(C)Gli2免疫反应。最终放大400倍。
补充图3。CD56/CD3双阳性细胞NASH。双阳性细胞位于F3-4 NASH典型患者肝纤维化区域附近。)。最终放大600倍。
制导:34F7FD76-FBD3-4423-BB3F-4AD2205693CD
摘要
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的肝脏炎症程度高于脂肪变性,这表明免疫反应有助于NAFLD的进展。肝脏通常含有许多自然杀伤T(NKT)细胞,这些细胞产生调节炎症和纤维化反应的因子。脂肪变性时,这些细胞相对耗竭,但其在更晚期NAFLD中的状态尚不确定。我们假设NKT细胞在NASH中积聚并促进纤维化进展。我们的目的是确定在NASH相关纤维化期间肝脏是否富含NKT细胞;确定责任机制;并评估NKT细胞是否刺激纤维生成。在喂食甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食以诱导NASH相关纤维化之前和之后,分析野生型小鼠和具有过度活跃Hedgehog(Hh)通路的Ptc+/-小鼠的NKT细胞;检测NKT细胞衍生因子对肝星状细胞(HSC)的影响,并在缺乏NKT淋巴细胞的CD1d缺陷小鼠中评估肝纤维化;对人类肝硬化和非疾病肝脏中的NKT细胞进行定量。在野生型小鼠NASH相关纤维化形成过程中,Hh途径激活,导致诱导促进NKT细胞募集、保留和存活的因子,以及肝脏中NKT淋巴细胞的富集。Ptc+/-小鼠积聚更多NKT细胞,肝纤维化加重;缺乏NKT细胞的CD1d缺乏小鼠可免受纤维化的影响。NKT细胞条件培养液刺激HSC成为肌纤维母细胞。非NASH肝硬化患者的肝外植体中NKT细胞富集2倍,NASH肝硬化的肝外移植体中NK细胞富集4倍。总之,Hh途径激活导致肝脏中NKT细胞的富集,这有助于NASH的纤维化进展。
关键词:肝硬化、自然杀伤T细胞、非酒精性脂肪肝
介绍
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是慢性肝病的主要病因。它包括一系列组织病理学,包括肝脂肪变性(脂肪肝)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(1,2). 虽然NASH患者肝细胞损伤和死亡情况均比脂肪变性患者严重,但NASH的结局是可变的。
NASH患者肝脏中炎症细胞的积聚通常大于脂肪变性患者,这表明免疫系统的激活可能有助于脂肪肝损伤的进展。肝脏含有调节先天免疫反应的常驻细胞群(三). 自然杀伤T(NKT)细胞是一种淋巴细胞亚群,表达NK细胞上正常表达的细胞表面受体(如小鼠中的NK1.1或CD57,人类中的CD56或CD57)和T细胞受体,在健康肝脏中尤其丰富(4,5). 例如,具有不变T细胞受体的NKT细胞占小鼠肝脏中T细胞的20%。这种细胞在人类肝脏中也得到了富集,其中含有更多种类的NKT细胞(5,6). 在这两个物种中,NKT细胞主要位于肝窦,在那里它们提供血管内免疫监视(7,8). NKT细胞特异性识别糖脂抗原,激活后可产生Th1和Th2细胞因子(4,9). 这种使肝脏微环境细胞因子环境偏向促炎/抗纤维化(Th1)或抗炎/促纤维化(Th2)反应的能力已被充分证明(10)这可能解释了不同肝病中伴随NKT细胞肝脏富集的明显矛盾结果。例如,NKT细胞积聚似乎促进慢性病毒性肝炎的纤维化(11,12)、威尔逊氏病(13)和原发性胆汁性肝硬化(14,15),但可减轻小鼠慢性四氯化碳诱导的肝纤维化(16).
NKT细胞调节NAFLD疾病结局的可能性是一个很有吸引力的假设,因为这些细胞被脂质抗原激活,NAFLD是一种脂肪稳态障碍。然而,NKT细胞在激活或不成熟时下调经典NK细胞表面标记的表达的趋势,以及它们在人类中的异质性,使研究这一假设的努力陷入混乱。ob/ob小鼠的肝脏NKT细胞似乎相对缺乏,这是一种肥胖相关的促炎细胞因子过度、胰岛素抵抗和轻度NASH的模型(17-19). 将NKT细胞过继性转移到ob/ob小鼠可减少肝脏脂肪变性并改善葡萄糖稳态(20). 据报道,当野生型小鼠接受高脂肪、高糖饮食以诱导肥胖、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性时,肝脏NKT细胞数量也会减少(21),(22),进一步支持肝NKT细胞的相对耗竭有助于代谢和细胞因子的改变,这些改变与肝脂肪变性的发病机制有关。
ob/ob小鼠和喂食高脂肪、高蔗糖饮食的小鼠,即使在长期暴露于脂肪源性条件下,也不会发生严重的肝纤维化(23)NKT细胞在NAFLD晚期的作用尚不明确。最近对54例不同程度NASH相关肝损伤患者的肝活检样本进行的研究表明,在更严重的NASH期间,肝脏中NKT细胞相对丰富(24). 从这些患者中分离出的肝单个核细胞中,约有13%在NAS>5的患者中CD56和CD3呈双阳性,而NAS<4或慢性丙型肝炎患者中约有9%呈双阳性。此外,更多的细胞表达Vα24,表示NKT(iNKT)细胞是不变的,在这两组NASH患者中,与慢性丙型肝炎患者相比,从NAS>5的受试者中分离出的NKT细胞产生的IL4比NAS<4或慢性丙型肝病患者的IL4更多,这促使作者推测NKT可能在NASH期间促进纤维化。然而,少数患有晚期肝纤维化的受试者和该研究的横断面设计排除了因果关系的明确归因。
给啮齿类动物喂食蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)饮食可重复引发NASH和纤维化,类似于一些人类中发生的严重NASH(23). 目前的研究使用该模型来研究NKT细胞可能参与NASH肝纤维化形成的可能性。我们的目的是确定在NASH相关纤维化/肝硬化中,肝淋巴细胞群是否相对富含NKT细胞;确定可能导致这种情况的机制;并评估NKT细胞是否刺激纤维生成。
方法
A) 动物实验
老鼠
C57BL/6野生型(WT)(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME),补丁缺陷型(Ptc+/-)小鼠(来自北卡罗来纳州杜克大学的R.J.Wechsler-Reya)和CD1d缺陷小鼠(来自马里兰州巴尔的摩的约翰·霍普金斯大学的ZP Li)被喂食蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食或对照食物8周。私人投资公司+/-小鼠只有一个补丁,一个刺猬(Hh)通路阻遏物。因此,它们无法沉默Hh信号并表现出过度的Hh途径活性(25). CD1d缺乏小鼠中NKT细胞基因缺失(26).
肝脏结构、形态计量学和免疫组织化学分析
分析福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肝脏(27). 有关详细方案和抗体,请参阅补充材料和方法.
羟脯氨酸测定
用比色法定量全肝标本中的羟脯氨酸含量(27).
小鼠原代肝单个核细胞(LMNC)的分离/鉴定
LMNC是从WT小鼠中分离出来的(28,29)并通过荧光抗体细胞分选(FACS)进行表征,详见补充材料和方法.
原代肝NKT细胞对原代HSC活化的影响
LMNC在完整的NKT培养基(RPMI 1640,补充IL2(10ng/ml;Biolegend)和10%热灭活胎牛血清)中培养(28)使用或不使用NKT细胞配体αGalCer(100 ng/ml;(Axxora,分类号306027,CA)24小时。该αGalCer剂量引发最大iNKT激活(30). 然后将条件培养基添加到原代小鼠肝星状细胞中1天,并采集RNA用于QRT-PCR。实验在重复的井中进行,并重复两次。
细胞系和静态粘附试验
小鼠胆管细胞603B系(来自日本仙台东北大学上野幸之和明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所G Gores)(31),大鼠肝星状细胞(HSC)8B系(来自华盛顿特区乔治华盛顿大学M Rojkind)(32),和鼠不变杂交瘤细胞系DN32(来自伊利诺伊州芝加哥大学Albert Bendelac)(33)根据既定方案进行培养(31-33). 如前所述进行静态粘合(34)详细信息请参见补充材料和方法.
B) 人体受试者
人肝脏NKT细胞亚群分析
从接受肝移植的患者和结直肠癌肝转移切除术中切除的非病变肝组织或劈离肝移植物中切除的病变肝组织中分离出所述的肝源性淋巴细胞(35). 用PE-Cy7结合抗CD3(eBioscience;克隆UCHT1,Cat:25-0038;英国哈特菲尔德)和FITC-结合抗CD56(BD;Cat no 34058;英国牛津)对原代肝淋巴细胞进行染色,并使用Summit 4.3软件(Dako Cytomation)进行分析。
免疫组织化学
根据美国国立卫生研究院(NIH)和机构人类受试者研究指南(参见补充材料和方法免疫组化方案/抗体)。
统计分析
结果表示为平均值±SEM。使用Student t检验确定统计显著性。在5%水平上接受显著性,*p<0.05。
结果
MCD饮食诱导野生型小鼠NASH和肝纤维化
与喂食正常食物的对照组小鼠(n=25)相比,MCD饮食治疗的小鼠(n/25)出现了明显的大泡性脂肪变性、肝细胞气球样变性和肝脏坏死性炎症(),以及8周后的纤维化。后者通过天狼星红染色增强来证明()和肝脏羟脯氨酸定量(). 胶原沉积伴随着α-SMA免疫活性细胞的积聚()以及诱导促成纤维基因,包括α-sma、tgfβ胶原1α1、mmp9和timp1(补充图1 A-E).
当喂食蛋氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食时,小鼠发生NASH纤维化野生型小鼠被喂食对照周(n=25)或MCD饮食(n=2 5)8周,然后处死。(A) 代表性苏木精和伊红(最终放大400X,插入MCD小鼠肝脏H&E染色切片,显示肝细胞膨胀)(B)MCD饮食后天狼星红染色(最终放大200X)。(C) 通过形态计量分析对天狼星红进行量化,以及治疗期结束时(D)肝脏羟脯氨酸含量。结果表示为相对于对照组喂食小鼠的折叠变化。(E) αSMA免疫反应(最终放大400X)和(F)αSMA形态计量学。在每个时间点使用来自5只动物的切片,并随机选择10个400X的字段,通过Metaview软件进行分析。结果表示为相对于喂食对照组小鼠的折叠变化,并以平均值±SEM表示。*与对照组小鼠相比,P<0.05。
野生型小鼠MCD饮食诱导的NASH期间,肝NKT细胞的Hedgehog(Hh)途径激活和Hh相关蓄积发生
这些纤维化肝脏还显示Hh通路活性增加,这是一种调控伤口愈合反应的形态发生信号系统(36). MCD饮食治疗后,声波刺猬配体(Shh)mRNA表达增加了三倍,Hh调节转录因子(胶质母细胞瘤(gli)2)mRNA水平增加了四倍。伴随着Gli2表达细胞的大量聚集,这些细胞往往位于门静脉束附近,并沿着含有未成熟导管细胞和成纤维细胞的纤维间隔生长(). MCD饮食治疗显著增加了CXCL16、Hh诱导的NKT细胞趋化因子和VCAM1(促进NKT淋巴细胞粘附的因子)的mRNA水平().
Hedgehog通路的激活促进小鼠NASH中NKT的募集和静态粘附中描述的小鼠肝组织采集标本进行QRT-PCR和免疫组化。(A) MCD饮食治疗小鼠的典型Gli2染色(最终放大400X)和Gli2、(B)cxcl16和(C)vcam-1的mRNA表达。结果表示为相对于喂食对照小鼠的折叠变化,并以平均值±SEM表示。(D)DN32对未成熟导管细胞(603B)的静态粘附,用Sonic hedgehog和/或5E1(hedgehog-中和抗体)处理。(E) DN32对603B细胞和肌纤维母细胞系(8B)共培养24小时的静态粘附。结果表示为相对于车辆处理的导管细胞或导管细胞单培养物的粘附DN32细胞数量的折叠变化*与对照组小鼠相比,P<0.05。实验重复进行两次。
未成熟导管细胞依赖Hh产生CXCL16促进NKT细胞趋化性(37). 为了确定Hh途径的激活是否也促进NKT细胞的粘附,在载体或Shh的存在下,将NKT淋巴细胞与未成熟的导管细胞孵育。Shh显著增加NKT细胞与导管细胞的粘附;通过添加5E1抗体来中和Shh活性,这就消除了(). 在纤维化肝脏中,肌纤维母细胞星状细胞是Shh的主要来源(36). 因此,将未成熟导管细胞与肌纤维母细胞系(8B)在跨壁系统中共同培养后,重复进行静态粘附试验(38). 与星状细胞共培养增加NKT细胞与导管细胞的静态粘附;当Hh中和抗体被添加到培养基中时,这种作用也显著减弱(). 因此,NASH期间Hh途径的激活促进了NKT细胞在肝脏的募集和滞留。
患有NASH的纤维化肝脏也表达较高水平的CD1d()和IL15()两者均能促进NKT细胞存活。与MCD饮食诱导的NASH为NKT细胞提供了一个滋养微环境的证据一致,MCD饮食处理小鼠的肝脏显著富集于CD1d四聚体反应的NKT淋巴细胞(). 另一种NKT细胞标记物CD57的免疫染色证实,NASH肝实质中CD57(+)细胞的数量约为对照肝的2倍().
NASH纤维化与肝NKT细胞的富集有关8周结束时,处死喂食对照组和喂食MCD的小鼠(n=15/组),并对肝脏总RNA进行QRT-PCR分析,以评估NKT生存因子的表达。(A) cd1d和(B)il15 mRNA。结果表示为相对于喂食对照组小鼠的折叠变化,并以平均值±SEM表示。*与对照喂食组小鼠相比,P<0.05。(C-D)额外的小鼠(n=10/组)用对照周或MCD饮食治疗8周;整个肝脏用于FACS分析。在喂食食物的对照(C)或MCD处理的小鼠(D)中CD4/CD1d四聚体双重染色。所有小鼠的肝脏用于FACS分析。NASH肝脏(E)肝实质(E-F)CD57免疫反应性T细胞与正常肝脏(F)的比较(最终放大400X)。对每组4只小鼠的切片进行分析。
Hedgehog通路的遗传过度激活加剧MCD饮食喂养小鼠肝脏NKT细胞的蓄积
私人投资公司+/-小鼠(在通路激活后表现出持续的Hh信号(25))喂食MCD饮食时,比野生型小鼠产生更多的肝纤维化(39). 因此,我们喂养了Ptc+/-小鼠MCD或对照饮食8周,分离肝单个核细胞(LMNC),并进行FACS,以确定过度激活Hh途径是否影响NKT细胞积累。NKT细胞约占喂食Ptc中LMNC的10%+/-老鼠()、和8周的MCD饮食喂养导致NKT细胞富集约4倍(). 因此,尽管来自Ptc的LMNC+/-野生型C57Bl6小鼠在损伤相关的肝Hh信号激活之前含有相似比例的NKT细胞,Ptc中Hh通路激活和NKT细胞富集的程度更高+/-NASH期间的小鼠。这些发现可能具有相关性,因为Ptc+/-众所周知,在MCD饮食诱导的NASH期间,小鼠比WT小鼠发生更严重的肝纤维化。
Ptc饮食诱导NASH期间肝内NKT细胞积聚增加+/-具有过度活跃Hedgehog通路的小鼠以及对缺乏NKT细胞的CD1d缺陷小鼠MCD饮食诱导的纤维化的保护私人投资公司+/-给小鼠喂食常规食物(n=2)或MCD饮食(n=2.)8周。治疗期结束时,处死所有小鼠,分离肝内单核细胞进行FACS分析。(A) 猪瘟Ptc中CD4/CD1d-四聚体双阳性细胞+/-小鼠和(B-C)MCD膳食Ptc+/-老鼠。CD1d-缺乏小鼠和窝鼠野生型(WT)对照组被喂食对照周或MCD饮食8周(n=3只小鼠/组/饮食治疗)。通过评估(E)肝羟脯氨酸含量和对(F)肝胶原基因表达进行QRT PCR分析来评估纤维化。结果表示为平均值+/-SEM。*P<0.05,**P<0.005
为了更直接地评估肝脏NKT积累对NASH相关纤维化发生的意义,在缺乏NKT细胞的CD1d缺陷小鼠中重复MCD饮食喂养(26)和窝友对照组(n=3/组)。8周后采集肝脏,评估胶原蛋白基因表达和肝脏羟脯氨酸含量。两种检测均显示NKT细胞缺陷小鼠的纤维生成显著减弱().
活化的小鼠原代肝NKT细胞促进小鼠原代肝脏星状细胞肌纤维母细胞活化
原代肝NKT细胞产生Shh配体,Hh配体刺激其产生成纤维因子,包括IL4和IL13(29)表明NKT细胞的可溶性因子促进肝纤维化。为了更直接地研究这一点,从健康小鼠中分离出原代LMNC,并与α-Galcer孵育(40)特异性激活NKT细胞;然后将细胞条件培养基添加到小鼠星状细胞的原代培养物中。一天后,采集培养物以获取RNA进行PCR分析。利用LMNC的条件培养基进行平行研究,并用载体处理。含有活化NKT细胞的LMNC条件培养基诱导Hh-靶基因gli1的表达,增加星状细胞活化标记物foxhead box(Foxf)1的表达和几个纤维素酶相关基因的上调表达()支持NKT细胞衍生因子促进肝纤维化的概念。
α-半乳糖基神经酰胺处理的小鼠原代肝NKT细胞诱导原代肝星状细胞活化分离的小鼠原代肝单个核细胞(MNC)(5×104)在完整的NKT培养基中培养,并用载体或α半乳糖神经酰胺处理24小时。然后将细胞条件化介质添加到小鼠肝星状细胞原代培养物中再培养24小时;然后收获星状细胞,并通过QRT-PCR分析评估基因表达的变化。(A) gli1、(B)foxf1、(C)胶原蛋白1α1、(D)αsma、(E)tgfβ和(F)ctgf。结果表示为相对于用“vehicle-MNC”条件介质处理的星状细胞的折叠变化。绘制了重复实验的平均值±SEM*与载体-MNC处理的星状细胞相比,P<0.05。
人类NASH相关肝纤维化期间,NKT细胞的肝蓄积伴随Hh途径激活
NKT细胞在小鼠中占LMNC的很大比例,但在人类中含量要少得多(5,6). 此外,MCD饮食诱导的NASH小鼠模型在几个方面与人类的典型NASH不同(23),(41). 因此,重要的是确定在MCD饮食诱导的NASH小鼠模型中看到的肝NKT细胞的改变是否也发生在NASH相关肝纤维化患者中。正如我们在MCD饮食诱导的NASH和肝纤维化小鼠中观察到的,NASH和3-4期肝纤维化患者的肝活检(补充图2)显示α-SMA表达细胞的积聚()和表达Shh配体的细胞(补充图2B),Hh调节转录因子,Gli2(补充图2C)和Hh诱导的NKT细胞趋化因子CXCL16()尤其是在纤维隔内。表达NKT细胞标记物(即CD56/CD3或CD57/CD3)的细胞也倾向于在这些区域积聚(,补充图2). 对另外2名因NASH相关肝硬化接受肝移植的患者的移植肝脏进行的LMNC的FACS分析证实,LMNC人群中NKT细胞仍然显著富集。NASH相关性肝硬化中NKT细胞占LMNC的20-24%(),10%为丙型肝炎相关肝硬化()自身免疫性肝炎肝硬化患者占6%(). 与公布的数据一致(42),我们发现在2个非病变肝脏中,NKT细胞占LMNC的3-5%(). 因此,肝硬化患者肝内单核细胞富含NKT细胞。
人类NASH中肝脏NKT细胞的积累伴随着Hedgehog通路的激活(A-C)对NASH患者的肝切片和轻度纤维化(F0-1)或晚期纤维化(F3-4)进行染色,以确定激活的肌成纤维细胞、αSMA(A)、Hh-调节的NKT趋化因子、CXCL16(B)和NKT细胞的标记物,即CD3(蓝色)/CD57(棕色)双免疫反应细胞。显示了具有代表性的显微照片。最终放大400倍(A、B)和600倍(C)。
肝硬化患者肝单个核细胞与NKT细胞的富集从接受肝移植的患者(n=4)的移植肝脏、结直肠癌肝转移切除过程中切除的非病变肝组织(n=2)以及劈离移植过程中获得的多余肝组织(n=2)中分离出肝浸润性白细胞,并通过FACS进行分析。(A-B)NASH肝硬化、(C)丙型肝炎肝硬化、(D)自身免疫性肝炎和(E-F)非病对照肝。NKT细胞为CD3/CD56双阳性细胞。
讨论
本研究表明,在患有NASH相关纤维化的啮齿动物和人类肝脏中,LMNC人群富含NKT细胞。因此,纤维性NASH和NASH诱导的肝硬化不同于以肝NKT细胞群相对耗竭为特征的肝脂肪变性(17-20,43). 我们的发现与另一组最近发表的一篇文章一致,该研究也表明肝脏NKT细胞与NAS评分平行增加(24). 此外,我们确定了一种可能有助于肝脏NKT细胞积聚的新机制,即肝脏损伤相关的Hh通路激活。
在小鼠体内(39,44)和人类(39)肝Hh途径激活与肝损伤的纤维修复密切相关。这导致产生和/或响应Hh配体的细胞聚集。Hh介导的这些细胞之间的串话诱导产生各种趋化因子,包括CXCL16,一种NKT细胞趋化因子(37). 在这里,我们表明,NKT细胞与肝细胞的粘附也受到Hh调节,在Hh通路活性增加和NASH纤维化的小鼠中,IL-15和Cd1d这两个增强NKT活性的因子的肝表达显著上调。严重NASH患者的肝脏CD1d也增加。(24)因此,在患有NASH相关纤维化的人类和啮齿动物肝脏中诱导了促进NKT细胞募集、保留和生存能力的因素。Hh途径激活在这一过程中起着重要作用,因为增加小鼠肝脏中Hh途径活性的基因操作会加剧NASH相关的肝脏NKT细胞的富集。鉴于NAFLD相关肝硬化患者肝Hh通路活性与肝单个核细胞与NKT细胞富集水平之间存在显著相关性,Hh信号也可能介导人类NASH中肝NKT淋巴细胞的积聚。
我们的工作还表明,NKT细胞积极促进NASH中的纤维化形成,因为缺乏NKT的CD1d缺陷小鼠可以保护其免受NASH相关纤维化的影响,并使用含有αGalCer活化NKT淋巴细胞的LMNC条件培养基治疗小鼠原代肝星状细胞,刺激星状细胞成为肌纤维母细胞。以前,我们发现小鼠的原代肝NKT细胞产生Shh,Shh刺激NKT淋巴细胞产生促成纤维细胞因子IL-4和IL-13(29). Shh还直接刺激肝星状细胞的肌纤维母细胞活化,促进肝肌成纤维细胞的增殖和存活(36). 私人投资公司+/-小鼠在结扎胆管后出现更严重的纤维化(27)或MCD饮食(39). 其他人报告称,患有NASH纤维化的小鼠产生的IL-13增加,并且表明中和IL-13的治疗可以减少纤维化的发生(45). 同样,抑制IL-4活性可以减轻小鼠的肝纤维化(46).
我们的人体研究表明,肝硬化的一个特征是肝脏中NKT细胞的富集。在NASH相关性肝硬化患者中观察到明确的NKT细胞富集,我们检测到他们的肝脏NKT淋巴细胞相对增加了4-5倍。本研究证实了先前的报告,即晚期NAFLD患者肝脏CD1d表达增加,增加了NKT细胞抗原提呈增强的可能性。这很有趣,因为CD1d向NKT细胞呈现脂质抗原,NAFLD中脂质稳态异常。然而,需要进一步的研究来确定NKT细胞在肝脏积聚中是否存在疾病相关差异以及为什么存在这种差异。针对NKT细胞可能与其他类型的先天性免疫细胞相互作用以调节纤维化进展的可能性进行的其他研究也是合理的,因为我们检测的人类肝硬化中CD56(+)/CD3(-)细胞(即NK细胞)相对缺乏,肝NK细胞被认为具有抗纤维化功能(6). 此外,有人认为,作为免疫调节细胞因子丰富来源的肝巨噬细胞可能在NASH中发生改变(18)这可能会进一步影响纤维化活动。
总之,对患有NASH相关肝纤维化的小鼠和人类的分析表明,肝单核细胞群与NKT细胞显著富集,确定了Hh途径激活在这一过程中的作用,并证明肝脏NKT细胞的激活产生可溶性因子,该可溶性因子通过涉及肝星状细胞的肌成纤维细胞激活的机制促进纤维形成。由于这些结果确定了有助于NAFLD纤维化进展的新型免疫介导机制,因此该发现对最常见的慢性肝损伤类型之一具有潜在的临床意义。
补充材料
6
补充人物图例
补充图1。MCD饮食对肝纤维化基因表达的影响。QRT PCR用于比较Legend to数据表示为平均值+/-SEM。*与喂食对照小鼠相比,P<0.05。
补充图2。人类NASH中Shh配体和Hh靶基因Gli2表达与纤维化分期相关的差异。(A) 具有轻度纤维化(F0-1)(左)或晚期纤维化(F3-4)(右)的代表性NASH患者的H&E染色切片。最终放大100X。(B) 患有早期纤维化(左)或晚期纤维化(右)的NASH中的Shh和(C)Gli2免疫反应性。最终放大400倍。
补充图3。CD56/CD3双阳性细胞NASH。双阳性细胞位于F3-4 NASH典型患者肝纤维化区域附近。)。最终放大600倍。
致谢
作者谨感谢Alisan Kahraman博士(德国埃森)的技术建议,Patrice McDermott博士(杜克大学人类疫苗研究所流式细胞术核心设施)对初级单核细胞分类的帮助,R.J.Wechsler-Reya博士(北卡罗来纳州杜克大学医学中心)提供Patched-deficient(Ptc)+/-)小鼠,G.J.Gores博士(Mayo Clinic,Rochester,MN)和Yoshiyuki Ueno博士(东北大学,仙台,日本)提供小鼠未成熟导管细胞系(603B),M Rojkind博士(George Washington University Washington,DC)提供大鼠肝星状细胞(HSC)系8B,和A Bendelac博士(芝加哥大学,芝加哥,IL)用于提供小鼠不变杂交瘤细胞系(DN32)。
此外,作者感谢黄佳文博士在动物护理方面的协助,感谢卡尔·斯通先生的行政支持。
财务支持:
这项工作得到了国家卫生研究所(RO1 DK053792)和RO1 DK077794对AMD的资助。
缩写词表
αGalCer | α-半乳糖神经酰胺 |
α-形状记忆合金 | α-平滑肌肌动蛋白 |
细胞生长因子 | 结缔组织生长因子 |
面部表情 | 荧光激活细胞分选 |
福克斯f1 | 叉头箱F1 |
FFPE公司 | 福尔马林固定石蜡包埋 |
格利 | 胶质母细胞瘤 |
小时 | 刺猬 |
iNKT公司 | 不变自然杀手T |
基质金属蛋白酶9 | 基质金属蛋白酶9 |
NAFLD公司 | 非酒精性脂肪肝 |
美国国立卫生研究院 | 非酒精性脂肪性肝炎 |
NK公司 | 自然杀手 |
NKT公司 | 自然杀手T |
MCD公司 | 蛋氨酸胆碱缺乏 |
私人投资公司+/- | 打补丁的 |
嘘 | 声波刺猬 |
Tgfβ | 转化生长因子β |
倾倒1 | 金属蛋白酶组织抑制剂1 |
V凸轮1 | 血管细胞粘附分子1 |
工具书类
1.NAFLD的自然病史:在没有肝硬化的情况下非常良性。胃肠病学。2005;129:375–378.[公共医学][谷歌学者] 2Adams LA、Lymp JF、St Sauver J、Sanderson SO、Lindor KD、Feldstein A、Angulo P。非酒精性脂肪肝的自然病史:一项基于人群的队列研究。胃肠病学。2005;129:113–121.[公共医学][谷歌学者] 三。高斌,郑伟,田忠。肝脏:一种具有卓越先天免疫功能的器官。肝病学。2008;47:729–736.[公共医学][谷歌学者] 4Kronenberg M.理解NKT细胞生物学:进展和悖论。免疫学年度回顾。2005;23:877–900.[公共医学][谷歌学者] 5Exley MA、Koziel MJ。是否成为NKT:肝脏中的自然杀伤T细胞。肝病学。2004;40:1033–1040.[公共医学][谷歌学者] 6Gao B,Radaeva S,Park O。肝脏自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞:免疫生物学和在肝脏疾病中的新作用。白细胞生物学杂志。2009 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Geissmann F、Cameron TO、Sidobre S、Manlongat N、Kronenberg M、Briskin MJ、Dustin ML等。通过巡视肝窦的CXCR6+NKT细胞进行血管内免疫监测。《公共科学图书馆·生物》。2005;三:e113。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8肝NKT细胞:朋友还是敌人?临床科学(伦敦)2008;114:457–466.[公共医学][谷歌学者] 9Bendelac A,Savage PB,Teyton L.NKT细胞生物学。免疫学年度回顾。2007;25:297–336.[公共医学][谷歌学者] 10Mallevaey T、Fontaine J、Breuilh L、Paget C、Castro-Keller A、Vendeville C、Capron M等。小鼠血吸虫病期间,不变和非变异自然杀伤T细胞对免疫反应的调节作用相反。感染免疫。2007;75:2171–2180. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Nuti S、Rosa D、Valiante NM、Saletti G、Caratozzolo M、Dellabona P、Barnaba V等。慢性丙型肝炎肝内淋巴细胞动力学:Valpha24+T细胞富集和通过凋亡快速消除效应细胞。欧洲免疫学杂志。1998;28:3448–3455.[公共医学][谷歌学者] 12Durante-Mangoni E,Wang R,Shaulov A,He Q,Nasser I,Afdhal N,Koziel MJ,等。丙型肝炎病毒感染中肝脏CD1d的表达和常驻促炎性CD1d反应T细胞的识别。免疫学杂志。2004;173:2159–2166.[公共医学][谷歌学者] 13Kinebuchi M,Matsuura A,Ohya K,Abo W,Kitazawa J.Va24Vb11自然杀伤T细胞在Wilsonian肝炎中的作用。临床实验免疫学。2005;139:144–151. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Kita H、Naidenko OV、Kronenberg M、Ansari AA、Rogers P、He XS、Koning F等。使用人CD1d四聚体对原发性胆汁性肝硬化中自然杀伤T细胞的定量和表型分析。胃肠病学。2002;123:1031–1043.[公共医学][谷歌学者] 15Harada K、Isse K、Tsuneyama K、Ohta H、Nakanuma Y。CD57+CD3+自然杀伤T细胞的积聚与原发性胆汁性肝硬化肝内胆管病变有关。肝脏Int。2003;23:94–100.[公共医学][谷歌学者] 16Park O,Jeong WI,Wang L,Wang H,Lian ZX,Gershwin ME,Gao B.不变自然杀伤T细胞在四氯化碳诱导的肝损伤和纤维化中的不同作用。肝病学。2009;49:1683–1694. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Guebre-Xabier M,Yang S,Lin HZ,Schwenk R,Krzych U,Diehl AM。肥胖相关小鼠脂肪肝中肝淋巴细胞亚群的改变:肝损伤致敏的潜在机制。肝病学。2000;31:633–640.[公共医学][谷歌学者] 18Li Z,Lin H,Yang S,Diehl AM。小鼠瘦素缺乏改变Kupffer细胞分泌调节先天免疫系统的细胞因子。胃肠病学。2002;123:1304–1310.[公共医学][谷歌学者] 19Yang L,Jhaveri R,Huang J,Qi Y,Diehl AM。小鼠脂肪肝内质网应激、肝细胞CD1d和NKT细胞异常。实验室投资。2007;87:927–937.[公共医学][谷歌学者] 20Elinav E、Pappo O、Sklair-Levy M、Margalit M、Shibolet O、Gomori M、Alper R等。过继转移调节性NKT淋巴细胞可改善ob/ob小鼠的非酒精性脂肪性肝炎和葡萄糖耐受性,并与肝内CD8捕获有关。病理学杂志。2006;209:121–128.[公共医学][谷歌学者] 21Li Z,Soloski MJ,Diehl AM。饮食因素改变非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝固有免疫系统。肝病学。2005;42:880–885.[公共医学][谷歌学者] 22.马X,华杰,李忠。益生菌通过增加肝脏NKT细胞改善高脂饮食诱导的肝脂肪变性和胰岛素抵抗。肝素杂志。2008;49:821–830. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23.Larter CZ,Yeh MM。NASH动物模型:正确处理病理学和代谢背景。胃肠病学肝病杂志。2008;23:1635–1648.[公共医学][谷歌学者] 24Tajiri K,Shimizu Y,Tsuneyama K,Sugiyama T。肝脏过滤CD3+CD56+自然杀伤T细胞在非酒精性脂肪性肝病发病机制中的作用。欧洲胃肠病肝病杂志。2009;21:673–680.[公共医学][谷歌学者] 25Goodrich LV,Milenkovic L,Higgins KM,Scott MP。改变小鼠补缀突变体的神经细胞命运和髓母细胞瘤。科学。1997;277:1109–1113.[公共医学][谷歌学者] 26Smiley ST、Kaplan MH、Grusby MJ。在缺乏分泌白细胞介素-4的CD1依赖细胞的情况下产生免疫球蛋白E。科学。1997;275:977–979.[公共医学][谷歌学者] 27Omenetti A,Yang L,Li YX,McCall SJ,Jung Y,Sicklick JK,Huang J,et al.Hedgehog介导的间质-上皮相互作用调节肝对胆管结扎的反应。实验室投资。2007;87:499–514.[公共医学][谷歌学者] 28Watarai H、Nakagawa R、Omori-Miyake M、Dashtsoodol N、Taniguchi M。小鼠和人类NKT细胞的检测、分离和培养方法。国家协议。2008;三:70–78.[公共医学][谷歌学者] 29Syn WK、Witek RP、Curbishley SM、Jung Y、Choi SS、Enrich B、Omenetti A等。刺猬通路在调节不变NKT细胞生长和功能中的作用。欧洲免疫学杂志。2009;39:1879–1892. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Yu KO,Porcelli SA。CD1d-限制性NKT细胞的多种功能及其免疫治疗潜力。免疫Lett。2005;100:42–55.[公共医学][谷歌学者] 31Yahagi K、Ishii M、Kobayashi K、Ueno Y、Mano Y、Niitsuma H、Igarashi T等。正常小鼠肝脏胆管细胞的原代培养。体外细胞开发生物动画。1998;34:512–514.[公共医学][谷歌学者] 32Greenwel P、Schwartz M、Rosas M、Peyrol S、Grimaud JA、Rojkind M。正常和CCl4-肝硬化脂肪储存细胞系的特征。白细胞介素-6产生的差异。实验室投资。1991;65:644–653.[公共医学][谷歌学者] 33Lantz O,Bendelac A.小鼠和人类的主要组织相容性复合体I类特异性CD4+和CD4-8-T细胞的独特亚群使用了一个不变的T细胞受体α链。《实验医学杂志》。1994;180:1097–1106. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Heydtmann M、Lalor PF、Eksteen JA、Hubscher SG、Briskin M、Adams DH。CXC趋化因子配体16促进整合素介导的肝过滤淋巴细胞与炎症人类肝脏内胆管细胞和肝细胞的粘附。免疫学杂志。2005;174:1055–1062.[公共医学][谷歌学者] 35Eksteen B、Grant AJ、Miles A、Curbishley SM、Lalor PF、Hubscher SG、Briskin M等。在原发性硬化性胆管炎中,肝内皮细胞CCL25介导CCR9+肠道淋巴细胞向肝脏的募集。《实验医学杂志》。2004;200:1511–1517. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 36奥梅内蒂A,迪尔AM。声音刺猬在开发和修复中的冒险。二、。声波刺猬与肝脏发育、炎症和癌症。美国生理学杂志胃肠道肝脏生理学。2008;294:G595–598。[公共医学][谷歌学者] 37Omenetti A、Syn WK、Jung Y、Francis H、Porrello A、Witek RP、Choi SS等。刺猬信号的修复相关激活促进胆管细胞趋化因子的产生。肝病学。2009;50:518–527. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Omenetti A、Porrello A、Jung Y、Yang L、Popov Y、Choi SS、Witek RP等。刺猬信号调节啮齿动物和人类胆道纤维化期间的上皮-间质转换。临床投资杂志。2008;118:3331–3342. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Syn WK、Jung Y、Omenetti A、Abdelmalek M、Guy CD、Yang L、Wang J等。Hedgehog介导的非酒精性脂肪性肝病的上皮-间充质转化和纤维化修复。胃肠病学。2009 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Croudace JE、Curbishley SM、Mura M、Willcox CR、Illarionov PA、Besra GS、Adams DH等。α-半乳糖神经酰胺对不同人类不变性自然杀伤T细胞反应表型的鉴定。BMC免疫学。2008;9:71. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 41Angulo P、Keach JC、Batts KP、Lindor KD。非酒精性脂肪性肝炎患者肝纤维化的独立预测因子。肝病学。1999;30:1356–1362.[公共医学][谷歌学者] 42Kenna T、Golden-Mason L、Porcelli SA、Koezuka Y、Hegarty JE、O'Farrelly C、Doherty DG。正常和肿瘤患者肝脏中的NKT细胞在表型和功能上与小鼠NKT淋巴细胞不同。免疫学杂志。2003;171:1775–1779.[公共医学][谷歌学者] 43Kremer M、Thomas E、Milton RJ、Perry AW、van Rooijen N、Wheeler MD、Zacks S等。肝脂肪变性中Kupffer细胞和白细胞介素-12依赖性自然杀伤T细胞丢失。肝病学。51:130–141. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Fleig SV,Choi SS,Yang L,Jung Y,Omenetti A,VanDongen HM,Huang J,等。Hedgehog反应性祖细胞的肝蓄积随着小鼠脂肪肝损伤的严重程度而增加。实验室投资。2007;87:1227–1239.[公共医学][谷歌学者] 45Shimamura T、Fujisawa T、Husain SR、Kioi M、Nakajima A、Puri RK。IL-13在非酒精性脂肪性肝炎诱导的纤维化中的新作用及其通过IL-13R导向的细胞毒素在大鼠模型中的改善作用。免疫学杂志。2008;181:4656–4665.[公共医学][谷歌学者] 46Cheever AW、Williams ME、Wynn TA、Finkelman FD、Seder RA、Cox TM、Hieny S等。曼氏血吸虫感染小鼠的抗-IL-4治疗抑制T细胞和表达Th2细胞因子的非B、非T细胞的发育,同时降低鸡蛋诱导的肝纤维化。免疫学杂志。1994;153:753–759.[公共医学][谷歌学者]