嘧啶生物合成将线粒体呼吸与p53途径联系起来

摘要

线粒体是细胞的主要发电站，产生大部分细胞的ATP供应。此外，线粒体参与一系列细胞内过程，如细胞生长和分裂、分化、凋亡和细胞内信号传递(1). 线粒体能量转换的分子机制涉及电子传递链（ETC），ETC由嵌入线粒体内膜的电子传递复合物I-IV组成。ETC转换来自NADH和FADH的电子高能势₂转化为穿过内膜的电化学质子梯度能量，通过ATP合成酶（复合物V）驱动ATP合成。此外，线粒体参与许多代谢中间体的合成，包括嘧啶的从头合成。后一个过程由二氢鸟酸脱氢酶（DHODH）催化，二氢鸟氨酸脱氢酶是线粒体内膜中的一种FMN黄素蛋白，它将电子从二氢鸟甲酸转移到ETC的泛醌中以进一步氧化(2).

p53抑癌基因通过限制异常或受损细胞的增殖和存活来调节重要的质量控制功能。线粒体对p53介导的细胞死亡至关重要，因为p53控制着几个影响线粒体细胞色素释放的基因的转录c（c）(三). 此外，p53可以通过与Bcl-2家族蛋白的直接相互作用诱导转录依赖性凋亡(4). 另一方面，p53在线粒体中也起着稳态作用(5)因为它通过p53调节的核糖核苷酸还原酶M2亚单位控制线粒体DNA拷贝数(6)并通过上调SCO2公司和AIF公司基因(7,8).

尽管p53在线粒体生理学中具有既定的重要性，但关于线粒体发出的触发p53反应的信号的信息很少。然而，在缺氧暴露期间观察到线粒体呼吸和ETC活性的实质性变化(9)药物的副作用导致肝毒性(10)和心脏毒性(11)与副神经节瘤和嗜铬细胞瘤发生相关的遗传性琥珀酸脱氢酶缺乏症(12)等。线粒体etc受阻时激活p53可能会导致组织损伤。线粒体ROS与ETC解偶联和缺氧时p53激活有关(13). 然而，线粒体ETC活性在诱导p53反应中的作用仍不明确。研究表明，线粒体活性可能是应激诱导的p53激活所必需的，因为复合物I和V的抑制剂可以减轻依托泊苷治疗的反应(14)和复合物III抑制剂干扰顺铂治疗后p53的激活(15). 另一方面，人们注意到某些ETC抑制剂会产生与p53适度激活相关的细胞衰老表型，这导致线粒体膜电位（MMP）降低可能引发p53反应(16).

在这项研究中，我们用特定抑制剂阻断了每个线粒体ETC复合物，并监测了p53的诱导。我们的结论是，减少MMP或抑制ETC活性的化合物本身都不能触发p53反应。然而，线粒体复合物III抑制剂可以特异性诱导p53激活和p53依赖性凋亡，通过抑制功能偶联的DHODH导致嘧啶耗尽。我们发现嘧啶的缺乏对于ETC复合物III抑制剂诱导p53表达至关重要。这些结果提供了线粒体呼吸和p53途径之间以前未知的功能联系，并表明NQO1和NQO2在嘧啶核苷酸耗尽的上皮细胞中稳定和核保留p53的作用。

结果

ETC复合物III抑制剂特异性上调p53并诱导p53依赖性细胞凋亡。

为了发现线粒体呼吸的缺乏是否会引发p53反应，我们研究了用不同线粒体ETC复合物的抑制剂处理的细胞中p53的积累。在RKO细胞中，用复合I抑制剂piericidin和鱼藤酮、复合II抑制剂TTFA和细胞色素c氧化酶（复合IV）抑制剂KCN处理16–18小时对p53水平几乎没有影响。然而，在使用复合III抑制剂粘噻唑、斯的马特林和抗霉素a治疗后，观察到p53的显著积聚(图1A类). 在A549和HCT116细胞中也观察到类似的作用(图S1A类和B). 在HeLa细胞中，对粘液噻唑和豆甾醇的反应也显著上调了p53水平，但对吡菌素和鱼藤酮没有影响(图1B). p53依赖性报告菌也被显著诱导：用粘噻唑和斯的马特林治疗后为7-8倍，用抗霉素A治疗后为2.5倍(图1C类)而在转染含有抗氧化反应元件（ARE）的对照报告质粒的细胞中，抑制剂没有作用(图S1D类). 用复合物I抑制剂（前蓖麻毒素）、复合物II抑制剂（TTFA）和复合物IV抑制剂（KCN或NaN）治疗后，p53依赖性报告子没有激活_三) (图1C类和图S1C类). RKO报告细胞也获得了类似的结果，尽管由于较高的背景水平，诱导程度不太明确(图S1E类). 我们得出结论，p53反应的诱导是由复合物III中ETC的抑制而非ETC本身的损伤特异性触发的。

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图1。

线粒体复合物III抑制剂特异性上调p53并刺激p53依赖性凋亡。(A类和B)RKO中p53水平的西方分析(A类)和赫拉(B)将细胞分别暴露于指示的抑制剂：2μM粘噻唑（MXT）、1μM斯的马特林（STG）、2μM吡霉素（PRC）、2µM鱼藤酮（RTN）、2¦ΜM抗霉素A（ANT）、100μM TTFA（TTFA）、5 mM KCN（KCN）或不使用药物(C类). (C类)荧光素酶检测暴露于所示抑制剂20小时的HeLa细胞中p53依赖性转录，如A类和B. (D类)暴露于2μM粘噻唑（MXT）或MXT+100μM ZVAD-FMK的HCT116细胞caspase-3处理的Western分析。(E类)Western分析暴露于2μM粘噻唑（MXT）或MXT+100μM ZVAD-FMK的HCT116 wt和p53-/-细胞中的caspase 7处理。

选择效果最显著的粘噻唑进行进一步实验。在RKO细胞中，用粘噻唑处理可诱导细胞核中大量积累p53，而线粒体部分仅观察到微量的p53(图S2). 在对粘噻唑的反应中，p53（IC50～40 nM）的剂量依赖性积累在12–16小时达到最大值(图S3A类–D类和G公司). 在HeLa细胞中，p53依赖性报告子的诱导以及p53和p53响应性p21的积累是剂量依赖性的，并且在添加抑制剂后16–20小时开始(图S3E类–G公司). 在RKO细胞中，我们观察到CDKN1A公司（p21）基因(图S3H（H）)以及p21和Mdm2蛋白的积累(图S3我). 同样，在A549和HCT116细胞中观察到p21的诱导。

粘噻唑治疗诱导了具有凋亡细胞死亡特征的形态学变化，这与Annexin V阳性细胞比例的增加有关(图S4)效应器caspases 3和7的处理(图1 D类和E类). 当在caspase抑制剂ZVAD-FMK存在下进行粘噻唑治疗时，这些变化被阻断(图1 D类和E类和图S4)在p53敲除HCT116细胞中被显著抑制(图1E类和图S4).

复合物III抑制剂诱导的p53上调在很大程度上与ROS-和MMP无关。

此前研究表明，黏液噻唑对复合物III的抑制与细胞内活性氧水平的增加有关(17). 相应地，我们发现用复合III抑制剂处理的细胞中ROS水平略有增加。这些效应对活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）敏感(图S5A类和B). 然而，用NAC预处理RKO和A549细胞并不能阻止p53对复合III抑制剂的反应(图2A类和图S6A类)而它完全阻止了p53对过氧化氢的反应(图2B). 同样，在HeLa细胞中，用NAC预处理并不能阻止用复合III抑制剂处理后p53依赖性报告子的激活(图2D类). 因此，观察到的p53诱导不能用ROS介导的机制来解释。

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图2。

p53的诱导是活性氧和基质金属蛋白酶的依赖性。(A类)Western分析暴露于2μM抗霉素A（ANT）、2μM粘噻唑（MXT）、1μM豆碱（STG）18小时或未经治疗的RKO细胞中的p53水平。如有指示，在治疗前1小时添加10 mM NAC。(B)暴露于300μM H的RKO细胞p53水平的Western分析₂O（运行）₂持续20小时。如有指示，在治疗前1小时添加10 mM NAC。(C类)暴露于2μM粘噻唑（MXT）或解偶联剂0.4 mM二硝基苯酚（DNF）、5μM TTFB、1μM FCCP和1μM SF或未处理的RKO细胞18 h p53水平的Western分析(C类). (D类)荧光素酶检测处理20小时的HeLa细胞p53依赖性转录，如A类. (E类)荧光素酶检测暴露于试剂20小时的HeLa细胞p53依赖性转录，如C类.

我们还发现，用解偶联剂SF、TTFB、FCCP或二硝基酚治疗不能诱导显著的p53积累(图2C类和图S6B)或增加其转录活性(图2E类). 这些结果反驳了ETC抑制剂诱导的线粒体膜去极化在p53上调中的作用(16).

复合物III抑制剂通过阻断嘧啶生物合成的二氢龙胆酸脱氢酶步骤来上调p53。

我们的结果表明，p53反应是由细胞色素bc1复合物上ETC的抑制触发的。然而，细胞色素bc1复合物产生的氧化泛喹诺酮对嘧啶的从头合成至关重要，即DHODH氧化二氢鸟氨酸，DHODH是一种定位于线粒体内膜的酶(2). 用抗霉素A阻断复合物III后，观察到嘧啶生物合成受到抑制(18). 我们测量了用ETC抑制剂治疗RKO细胞后细胞内嘌呤和嘧啶核苷酸浓度的变化(表1). 类似于DHODH来氟米特特异性抑制剂(19)粘噻唑治疗能够降低细胞内嘧啶水平（约四倍），而不会影响嘌呤。同时，细胞色素c氧化酶（复合物IV）抑制剂KCN既不能影响p53，也不能影响嘧啶的水平。

表1。

用粘噻唑、KCN或来氟米特处理的细胞中嘧啶和嘌呤衍生物的水平

细胞的处理	尿苷（pmol/106单元格）	胞苷（pmol/106单元格）	鸟苷（pmol/106单元格）	腺苷（pmol/106单元格）
控制	4890 ± 222	1185 ± 51	2580 ± 56	8385 ± 225
KCN公司	4575 ± 333	960 ± 38	2835 ± 216	7290 ± 312
来氟米特	1215 ± 77	285 ± 17	3540 ± 53	9705 ± 266
粘噻唑	1260 ± 77	270 ± 3	3225 ± 141	7035 ± 62

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对照或用粘噻唑、KCN或来氟米特处理的RKO细胞按照实验程序.实验分三次进行。数据表示为平均值±SEM

考虑到线粒体ETC在p53上调中的特殊作用，我们测试了粘噻唑对线粒体DNA缺失的影响(ρ0）A549电池。这个ρ0细胞被保存在补充尿苷和丙酮酸的培养基中，以补充与缺陷ETC相关的代谢缺陷。5-氟尿嘧啶治疗导致对照A549细胞以及其自身的p53诱导ρ0导数。然而，粘噻唑只能在对照细胞中诱导p53的积累，并且不能激活p53的表达ρ0 A549电池(图3A类).

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图3。

DHODH缺乏导致p53对粘噻唑的反应上调。(A类)粘噻唑不能激活p53ρ0个单元格。A549中p53水平的西方分析ρ0和A549 wt细胞暴露于2μM粘噻唑（MXT）或5-FU（10μg/ml）18小时。(B和C类)尿苷和乳清酸盐（但不是二氢乳清酸）抑制粘液噻唑诱导的p53积聚。RKO细胞中p53蛋白的Western分析，在尿苷（URD）指示浓度下暴露于1μM粘噻唑（MXT）16小时(B)或在50μg/ml尿苷（URD）或1 mM乳清酸盐（ORT）或1 mM二氢乳清酸盐（DHO）存在下(C类). (D类)Western分析暴露于5或100μM DHODH抑制剂来氟米特（LFL）48小时的HeLa细胞中的p53。(E类和F类)尿苷和乳清酸盐（但不是二氢乳清酸）抑制粘液噻唑诱导的p53依赖性报告子的激活。荧光素酶报告法检测在50μg/ml尿苷（URD）存在下暴露于1μM粘噻唑（MXT）22 h的HeLa细胞中p53依赖性转录(E类)或在1 mM乳清酸盐（ORT）或1 mM二氢乳清酸钠（DHO）存在下(F类).

结果表明，A549细胞中p53的激活需要完整的线粒体功能，而线粒体功能在ρ0个单元格。然而，作为ρ0个细胞含有尿苷，一个同样可能的解释是，尿苷补充可能补充触发p53反应的代谢缺陷。事实上，在50–75μg/ml剂量下补充尿苷可以阻止粘噻唑诱导p53表达(图3B)并显著降低了p53依赖性报告子对复合III抑制剂的诱导作用(图3E类和图S7A类). DHODH催化的反应产物Orotate与同一反应中底物二氢Orotate不同，它阻止了p53对复杂III抑制剂的激活(图3C类和F类和图S7A类和B). 此外，DHODH抑制剂来氟米特也能诱导p53的积累(图3D类). 结果表明，粘噻唑诱导的p53激活是由嘧啶缺乏引起的，而不是由ETC的抑制引起的。

复合III抑制剂通过干扰其在20S蛋白酶体中的降解来激活p53。

在正常细胞中，通过26S和20S蛋白酶体的受控降解维持p53蛋白水平(20,21). 靶向26S蛋白酶体是通过Mdm2和其他E3-气体的多泛素化实现的(22)并且该过程被应激、p53 N端磷酸化或p14过度表达所阻断^{农业研究基金}抑制剂蛋白(23). p53的上调也可以通过与NAD（P）H:醌氧化还原酶1（NQO1）和NRH：醌氧化还原酶2（NQO2）结合来实现，这两种酶可以保护20S蛋白酶体中的p53免受泛素非依赖性降解(24,25).

在A549和RKO细胞中，我们发现在用5-氟尿嘧啶或足叶乙甙治疗后，Ser15磷酸化受到强烈刺激，但在用粘噻唑治疗12–16小时后没有受到刺激(图4 A类和B)p53积累达到最大水平的时间点。仅在18-25小时内观察到phosho-Ser15 p53的适度积累。用N-（磷酸乙酰）-L-天冬氨酸（PALA）处理RKO细胞后，观察到类似的Ser15磷酸化动态，PALA是另一种作用于DHODH上游的从头合成嘧啶核苷酸抑制剂(图4B). 然后我们比较了p14的变化^{农业研究基金}粘噻唑治疗后的水平。在HeLa细胞中，治疗导致p14的水平略有下降^{农业研究基金}(图4C类)，而在RKO和A549细胞中，尽管进行了治疗，但检测不到该水平(图4C类). 然而，我们发现，用NQO1抑制剂二香豆素或NQO2抑制剂白藜芦醇治疗RKO细胞，对粘噻唑诱导的p53稳定产生了类似程度的抑制(图5A类)并阻止p53依赖性报告子在HeLa细胞中的刺激(图S8A类). 在经嘧啶生物合成抑制剂PALA处理的RKO和HeLa细胞中，双香豆素对p53稳定和报告活化的抑制作用类似(图S8B和C类). 通过引入表达适当shRNAs的慢病毒构建物，稳定地抑制RKO细胞中NQO1或NQO2的表达，每种慢病毒构建体均导致粘噻唑诱导的p53稳定作用降低两倍(图5 B和D类). 在NQO1受到抑制的细胞中，双香豆素的作用不存在，而白藜芦醇仍能有效降低p53的稳定性(图5C类). 同样，白藜芦醇不影响NQO2敲低的RKO细胞中p53的诱导(图5E类). 考虑到NQO1和NQO2参与p53的诱导，我们通过共焦显微镜检测粘噻唑治疗后蛋白质的细胞内定位。我们发现，在未经处理的RKO细胞中，NQO1仅存在于胞浆中，NQD2以非常低的水平分布在整个细胞中，没有明显的核定位。在用2μM粘噻唑处理12 h的细胞中，NQO1和NQO2均产生明亮的核染色，与积聚的核p53完美共定位(图5F类和图S9和第10节). 结果表明，p53对复合III抑制剂的反应依赖于NQO1和NQO2，它们获得核定位，可能有助于核保留和保护20S蛋白酶体中p53的降解。

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图4。

粘噻唑上调p53与Ser15的p53磷酸化或p14的积累无关^{农业研究基金}. (A类)未经处理的RKO和A549细胞磷酸化p53（Ser15）的Western分析(C类)或暴露于2μM粘噻唑（MXT）或DNA损伤药物5-FU（10μg/ml）和50μM足叶乙甙（ETP）16小时。(B)暴露于2μM粘噻唑（MXT）或250μM PALA 12、18或25小时的RKO细胞或未处理细胞中磷酸化p53（Ser15）的Western分析(C类). 用50μM足叶乙甙（ETP）治疗18小时作为阳性对照。(C类)RKO、HeLa和A549细胞暴露于2μM粘噻唑18 h（MXT）或24 h（MXT+）或未处理细胞中p14 ARF的Western分析(C类).

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图5。

粘噻唑诱导p53表达依赖于NQO1和NQO2。(A类)用2μM粘噻唑（MXT）处理10小时和300μM二香豆素（DCM）处理4小时或50μM白藜芦醇（RSV）处理10小时的RKO细胞中p53的西方分析。(B)2μM粘噻唑治疗10 h后NQO1敲除（siNQOl）和对照RKO细胞p53水平的Western分析。(C类)用2μM粘噻唑处理10 h，300μM双香豆素处理4 h或50μM白藜芦醇处理10 h的NQO1敲低RKO细胞中p53的Western分析。(D类)2μM粘噻唑治疗10 h后NQO2敲除（siNQO2）和对照RKO细胞中p53蛋白的Western分析。(E类)用2μM粘噻唑和50μM白藜芦醇处理NQO2敲低RKO细胞10 h后p53蛋白的Western分析。(F类)粘噻唑治疗后p53与NQO1或NQO2的结肠化。RKO细胞与2μM粘噻唑或不含（对照）培养12 h，并用NQO2或NQO1抗体（红色）和p53抗体（绿色）染色。然后覆盖红色和绿色荧光的图片。黄色表示两种蛋白质的共定位。

讨论

线粒体呼吸变化在许多病理条件下都有报道(9–12)虽然对受损电子传递链的信号知之甚少，但这种信号可能会诱导p53应激反应，从而导致组织损伤。以前的证据表明线粒体ETC可能在应激诱导的p53激活中发挥作用(13–16). 然而，在本研究中，我们发现抑制线粒体ETC并不一定会产生p53激活信号。用复合物I抑制剂piericidin和鱼藤酮阻断ETC，或用复合物IV抑制剂KCN和NaN阻断ETC_三，不足以在表达野生型p53的四种人类癌细胞系中诱导p53反应。类似地，在原核菌解偶联剂消散基质金属蛋白酶时，未观察到p53激活。结果表明，线粒体能量生成功能的简单缺乏不足以引发p53依赖性应激反应。

然而，我们发现，对于复合物III的特异性抑制剂，可以诱导大量p53激活。值得注意的是，在HPV阳性的HeLa细胞中也观察到这种激活，这表明NQO1/2介导的诱导绕过了E6介导的p53降解。我们还发现，抑制剂可诱导p53依赖性凋亡细胞死亡。数据表明，尽管ETC的抑制本身不足以激活p53，但与线粒体复合体III相关的功能可能是触发p53反应的原因。值得注意的是，复合III抑制剂对p53的激活不能被ROS清除剂NAC所消除，这表明它是ROS依赖性的。

DHODH是一种参与嘧啶从头生物合成的酶，其功能取决于复合物III的活性。相应地，我们发现粘噻唑在不影响嘌呤的情况下诱导嘧啶的耗竭。补充尿苷或DHODH催化的反应产物鸟氨酸，可消除p53的活化，而DHODH底物二氢鸟氨酸则无作用。最后，与复合III抑制剂类似，DHODH来氟米特特异性抑制剂诱导p53上调。结果证实，DHODH步骤中的从头嘧啶生物合成受损触发了对复合III抑制剂的p53激活。

DHODH较小的N末端结构域在线粒体内膜形成隧道，为泛醌提供FMN的通路，FMN结合在较大催化结构域的活性部位[2]。DHODH依赖于复合体III提供的泛醌，从而在线粒体ETC和嘧啶生物合成之间形成功能联系。对配合物III的抑制迫使泛醌进入其完全还原状态，即泛喹诺酮，在DHODH催化的反应中，泛喹诺酮类不再能够接受二氢鸟氨酸的电子。

值得注意的是，复合IV抑制剂KCN（已知可阻断分离线粒体中泛喹诺酮的氧化）并未诱导p53或影响嘧啶核苷酸水平。它也不影响粘噻唑诱导的p53上调。可能由泛喹诺酮氧化的抗氰和粘噻唑敏感途径控制的泛喹诺酮类亚库对维持DHODH活性至关重要。

众所周知，核糖核苷酸库的耗竭是p53反应的强烈诱导物，在正常成纤维细胞中，这会导致p53依赖性阻滞在细胞周期的G1/S期(26). 用PALA（一种在从头嘧啶核苷酸生物合成途径中作用于DHODH上游的天冬氨酸转氨酶抑制剂）处理正常人成纤维细胞后，p53被激活。在成纤维细胞中，p53的激活导致可逆的细胞周期阻滞，从而保护细胞免受严重的DNA损伤和凋亡(27–29). 在本研究中使用的人类上皮癌细胞系中，复合III抑制剂或PALA激活p53反应可诱导细胞凋亡。这种差异可能归因于组织特异性变异，尽管这个问题需要进一步研究。

尽管之前有报道称，在人类成纤维细胞模型中，PALA治疗后p53的诱导在没有DNA损伤的情况下进行(29)最近发现，这种反应实际上涉及DNA损伤的有限积累，从而触发ATR-CHK1依赖的p53磷酸化(30). 然而，在人类肿瘤模型中，我们发现粘噻唑或PALA与足叶乙甙或5-FU不同，即使在Ser15没有磷酸化的情况下，也能上调p53的表达。当p53反应达到最大值时，在很晚的时间点检测到磷酸化-Ser15 p53的有限积累。因此，在上皮癌细胞中，与正常成纤维细胞不同，在嘧啶核苷酸缺乏的情况下，DNA损伤反应途径不太可能是p53诱导的主要因素。我们也没有发现粘噻唑诱导的p14的变化^{农业研究基金}水平。相反，我们的数据表明NQO1和NQO2似乎有助于p53的稳定和激活。最近发现的这一途径通过与NQO1或NQO2的结合抑制20S蛋白酶体中p53的泛素非依赖性降解(20,24,25). 我们发现双香豆素（已知干扰NQO1与p53的结合）和白藜芦醇（NQO2的高度特异性抑制剂）(31)，可以缓解p53的稳定和p53依赖性报告子的诱导，以应对粘噻唑或PALA的治疗。与药物抑制剂类似，黏液噻唑对p53的诱导作用在NQO1或NQO2被特定shRNA下调的细胞中得到缓解。最后，我们观察到NQO1和NQO2在细胞内大量重新分布，以响应粘噻唑治疗。酶从细胞质移动到细胞核，与诱导的p53共定位。结果表明，作为对上皮细胞嘧啶核苷酸缺乏的反应，NQO1和NQO2都参与了p53的激活，可能是通过它们与细胞核中的p53结合，并保护其在20S蛋白酶体中不被降解。

与对正常成纤维细胞p53诱导机制的相当清楚的理解不同(30)在上皮细胞模型中，NQO1/2介导的p53积累对嘧啶核苷酸耗尽的反应的确切途径尚待确定。先前的研究表明，RNA聚合酶II在延长前期抑制转录，或RNA聚合物I抑制转录，即使在没有DNA损伤和p53在Ser15没有磷酸化的情况下，也可以诱导p53的积累(32–34). 可能，所述NQO1和NQO2依赖的p53诱导途径在呼吸抑制和核苷酸库不足的细胞中由RNA生物合成中的类似扰动触发。需要进一步研究，以确定核苷酸耗尽池与NQO1和NQO2的p53稳定活性之间的机制联系。

实验程序

补充材料

鸣谢。

脚注

工具书类