核酸研究。2010年8月；38(14): 4687–4700.
MCAF1和Rta和Zta协同激活爱泼斯坦-巴尔病毒裂解基因的转录
,1 ,1 ,2和三，*
李关昌
1国立台湾大学生命科学学院生物化学科学与技术系，台北，台湾，2日本熊本大学再生医学系三台湾桃园长庚大学微生物与免疫学系
健英创
1国立台湾大学生命科学学院生物化学科学与技术系，台北，台湾，2日本熊本大学再生医学系三台湾桃园长庚大学微生物与免疫学系
中尾光耀
1国立台湾大学生命科学学院生物化学科学与技术系，台北，台湾，2日本熊本大学再生医学系三台湾桃园长庚大学微生物与免疫学系
刘世栋
1国立台湾大学生命科学学院生物化学科学与技术系，台北，台湾，2日本熊本大学再生医学系三台湾桃园长庚大学微生物与免疫学系
1国立台湾大学生命科学学院生物化学科学与技术系，台北，台湾，2日本熊本大学再生医学系三台湾桃园长庚大学微生物与免疫学系
2009年10月30日收到；2010年3月23日修订；2010年3月24日接受。
- 补充资料
【补充资料】
GUID:A42D9609-7BFC-4DBB-AAFD-BC6340617E4E
指南：44AE2A07-6F49-4C30-B6AA-5AC2D63F780D
摘要
爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）在裂解周期的即刻早期表达两种转录因子，Rta和Zta。这两种蛋白通常协同激活EBV裂解基因的转录。本研究表明，Rta和Zta通过中间蛋白MCAF1在Zta反应元件（ZRE）上形成复合物在体外通过共免疫沉淀、CHIP分析和共聚焦显微镜验证了这三种蛋白在P3HR1细胞中的相互作用。Rta和Zta之间的相互作用在体外取决于MCAF1中氨基酸562和816之间的区域。此外，过度表达MCAF1增强了MCAF1 siRNA，并将其引入细胞显著降低了293T细胞的协同激活水平。此外，协同激活依赖于ZRE而不依赖于Rta响应元件（RRE）的事实源于Rta和Zta能够在启动子中的RRE而非ZRE突变后协同激活BMRF1启动子。Rta–MCAF1–Zta复合物与ZRE而非RRE的结合也解释了为什么Rta和Zta不使用RRE协同激活转录。重要的是，本研究阐明了协同激活的机制，这对EBV的裂解发展很重要。
简介
爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）在裂解周期的即刻早期表达两种转录因子Rta和Zta，以激活EBV裂解基因的转录(1–5). 众所周知，由BZLF1编码的Zta通过与启动子中的Zta反应元件（ZRE）结合来激活转录。由于许多EBV裂解基因的转录依赖于Zta，因此在BZLF1突变后，EBV无法完成其裂解周期(6,7). 同时，Rta通常与EBV裂解启动子中的一个确定序列Rta反应元件（RRE）结合以激活转录(2,5,8–11). 然而，Rta可能通过一种独立于RRE结合的机制激活转录。例如，Rta通过中间蛋白MCAF1与Sp1相互作用，在Sp1结合位点上形成复合物，以自动调节其自身基因BRLF1的转录(12,13). 此外，一些EBV晚期基因的转录依赖于Rta而不是Zta(6,14–16)解释了为什么BRLF1的突变对病毒裂解的发展具有破坏性(6,7).
早期的研究已经证实，Rta和Zta经常相互协作，协同激活许多EBV裂解基因的转录，包括BHLF1、BMRF1和BRLF1(三,5,9,17–19). 尽管已经对协同激活的机制进行了各种研究，但Rta和Zta协同激活转录的确切方式仍然未知。由于早期研究未能证明Rta和Zta之间的相互作用(5)假设Rta和Zta结合到启动子中各自的结合位点以促进协同活化。事实上，Quinlivan等。(5)提出协同激活取决于启动子中至少存在一个RRE和一个ZRE。然而，事实上Zta和Rta协同激活BRLF1启动子(18)不含RRE，这证明了协同激活依赖于RRE的假设。事实上，Ragoczy等。(20)表明Rta和Zta协同激活BRLF1启动子依赖于未知蛋白与启动子的结合。吉奥等。(4)还断言，Rta可能通过中间蛋白与Zta形成复合物以协同激活转录，而不是与RRE结合。
众所周知，MCAF1促进SETDB1/ESET介导的组蛋白H3甲基化，从而促进异染色质结构域的形成(21,22). MCAF1也与MBD1和Sp1相互作用(23). 当与MBD1相互作用时，MCAF1促进MBD1依赖性转录抑制(23). 当与Sp1相互作用时，MCAF1成为增强Sp1介导的转录的辅激活子(12,23,24). 早期的研究表明，Rta通过MCAF1与Sp1相互作用，促进BRLF1转录的自动调节(12). 本研究表明MCAF1与Rta和Zta同时相互作用。这种相互作用促进了EBV裂解基因转录的协同激活。
材料和方法
细胞系和EB病毒裂解诱导
在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养P3HR1、EBV阴性Akata和BJAB细胞。293T细胞在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中培养。用3 ng/ml TPA和3 mM丁酸钠处理P3HR1细胞以激活EBV裂解周期(25).
质粒
质粒pCMV-3、pCMV-R、pCMV-Z、pSp1-luc、pcDNA-MCAF1、pRRE、pEGFP-Rta、pEGF-MCAF1-N、pET-Rta和pGEX-Rta已在其他地方描述(12,25). 通过将分别编码氨基酸562至817、818至1153和1154至1270的MCAF1区域的聚合酶链反应（PCR）扩增DNA片段插入pEGFP-C1（Clontech）的ScaI–XhoI位点，构建质粒pEGFP-MCAF1-DM1、pEGFP-MCAF1-M和pEGFP_MCAF1-DM2。通过将分别编码1至86、87至166和167至245氨基酸区域的PCR-扩增片段插入pEGFP-C1的EcoRI–SalI位点，构建表达截短Zta的质粒pEGFP-ZN、pEGFP-ZM和pEGFP-ZC。通过插入全长BZLF1（EBV基因组中n.t.103155–102211）构建质粒pET-Zta和pGEX-Zta（GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“V01555”，“term_id”：“94734074”}}V01555版本)经PCR扩增，分别进入pET-28a（Novagen）和pGEX-4T1（Amersham Pharmacia Biotech）的EcoRI–SalI位点。将编码MCAF1中氨基酸562至884区域的DNA片段插入pGEX-4T1和pET-32a中的HindIII–XhoI位点，分别产生pGEX-MCAF-C1和pET-MCAF1-C1。通过将编码MCAF1中氨基酸885至1270的PCR-扩增片段插入pGEX-4T1中的HindIII–XhoI位点，构建质粒pGEX-MCAF1-C2。使用报告质粒pEAD、pBMRF1、pBMRF1-mRRE、pBMRF1-mZRE、pBHLF1、pRRE和pZRE研究Rta和Zta的协同激活(). 质粒pEAD是通过将含有BMRF1中−332至+20区域（EBV基因组上的编号为79537至79889）的PCR-扩增DNA片段插入pGL2-Basic（Promega）中的HindIII–XhoI位点而构建的。通过将包含BMRF1中−172至+20区域（EBV基因组上的编号为79698至79889）的PCR-扩增DNA片段插入pGL2-Basic中的HindIII–XhoI位点，构建了报告质粒pBMRF1。质粒pBMRF1-mRRE包含与pBMRF1相同的序列，但RRE序列从5′-ACCACCCCCCAAGGAC突变为5′-GATATCCCCCCAGAGAC。质粒pBMRF1-mZRE与pBMRF1中的序列相同，但启动子中的三个ZRE从上游到下游分别从5′-TTGTCA、5′-TGAGCAA和5′-TAGTCA突变为5′-GGATCCA、5′TGGATCC和5′-CAGCTGA。通过将PCR-扩增片段插入pGL2-Basic中的HindIII和XhoI位点，构建了另一个报告质粒pBHLF1，其中包含四个ZRE拷贝（EBV基因组上的编号为52769至52931）。质粒pZRE是通过将一个双链寡核苷酸5′-AAAAGGCCGGCTGACATGGATTACTGTGGTCTTATGGCCATT插入pGL2-Basic的SmaI位点构建的，该寡核苷酸序列位于BRLF1启动子的−39到+4区域。质粒pCMV-Sp1从Guntran Suske获得(26). 质粒pTag2-Zta是通过将一个PCR-扩增的DNA片段插入pCMV-Tag2A（Stratagene）的EcoRI和XhoI位点来构建的，该片段编码BZLF1（EBV基因组上的n.t.103155至102211）。此外，质粒pCMV-R（K213A）编码了一个含有K213A突变的突变Rta(12).
DNA亲和沉淀分析
Mission Biotech，Inc.（台湾台北）合成了一种5′-生物素末端标记的双链DNA探针Rp-SZ，它在BRLF1启动子（5′-ATATTGCGATTGTCCCCACATCCAATGCATAA）中包含从−64到−28的序列。该序列包括一个Sp1-结合位点（5′-CCGCCC）和一个ZRE（5′-TGGCTCA）。探针Rp-mS和Rp-mZ包含与Rp-SZ相同的序列，但Sp1位点和ZRE分别突变为5′-ATTAAT和5′-GACTGCA。在探针Rp-mSZ中，Sp1位点和ZRE均发生突变。探针MRp-RZ包含BMRF1启动子中−174和−36区域之间的序列，然后使用生物素化引物通过PCR进行扩增。在该探针中，RRE从5′-ACCACCCCCACAAGGAC突变为5′-GATATCCCCCCAAGGAC，生成探针MRp-mR；5′-TTGGCTCA、5′-TGAGCAA和5′-TAGTCA三个ZRE分别与5′-GGATCCA、5′TGGATCC和5′-CAGCTGA合成MRp-mZ。在探针中，MRp-mRZ、RRE和ZRE均发生突变。探针HLp-Z（5′-GTCTCGTAATACTTAAGGTGCTCAGGAG）包含来自BHLF1启动子的两个ZRE，5′-TGTGTTAA和5′-TTGTCA。在探针HLp-mZRE中，这两个ZRE位点都突变为5′-TGGTA。探针MLp-R具有来自BMLF1启动子的RRE序列；如其他地方所述，在MLp-mR中，RRE序列发生突变(12). 将用丁酸钠和TPA处理过的P3HR1细胞制备的细胞裂解液与0.2μg生物素化探针混合在含有60 mM KCl、12 mM HEPES、pH 7.9、4 mM Tris–HCl、5%甘油、0.5 mM EDTA、1 mM二硫苏糖醇和10μg/ml leupeptin、抑肽酶和4-（2-氨基乙基）的结合缓冲液中-苯磺酰氟。在冰上孵育45分钟后，将反应混合物与30μl链霉亲和素MagneSphere顺磁性颗粒（Promega）混合，该颗粒在4°C的结合缓冲液中预先平衡1小时。然后在装订缓冲液中清洗珠子五次。然后使用2X电泳样品缓冲液提取珠子上的蛋白质并煮沸5分钟。最后，用十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳将其分离并用免疫印迹法检测(25).
免疫沉淀
P3HR1细胞（1×107)用TPA和丁酸钠处理24小时。用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液从细胞中制备裂解物(25)然后，在10-s脉冲条件下，使用配备有微探针的声波仪（振动室，超音速）在20%功率下冷却10-s，进行三次声波作用。裂解液在13800下离心克持续5分钟，将上清液与抗Rta（1:3000稀释）（Argene）、抗Zta（1:1000）（Argne）或抗MCAF1（1:1000，Bethyl）抗体在4℃混合1小时。将蛋白A/G琼脂糖珠（30μl）（癌基因）添加到裂解液中，并在4℃下摇晃培养1小时。通过离心收集珠粒，并在RIPA缓冲液中洗涤三次。通过添加20μl 2X电泳样品缓冲液洗脱与珠结合的蛋白质，并用抗Rta、抗Zta、抗MCAF1或抗GFP（Santa Cruze）抗体进行免疫印迹分析。
谷胱甘肽S-转移酶下拉试验
将浓度为40 ng/ml的GST、GST-Zta、GST-Rta、GST-MCAF1-C1或GST-MCAF1-C2添加到500μl NETN缓冲液中[20 mM Tris–HCl，pH 8.0，100 mM NaCl，1 mM EDTA，0.5%NP-40和10μg/ml每种leupeptin、抑肽酶和4-（2-氨基乙基）-苯磺酰基氟化物]，添加到30μl谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠中（Amersham Pharmacia Biotech）。将混合物在4°C下摇晃培养1小时。珠子在NETN缓冲液中清洗三次，并添加到大肠杆菌BL21（DE3）（pET-MCAF1-C1），大肠杆菌BL21（DE3）（pET-Zta）或大肠杆菌BL21（DE3）（pET-Rta）裂解物。将反应混合物在冰上培养1小时。然后在NETN缓冲液中清洗珠子。将等体积的2X电泳样品缓冲液添加到混合物中，并通过在95°C下加热5分钟从珠子中提取蛋白质。然后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质(27).
染色体免疫沉淀分析法
染色质免疫沉淀（CHIP）分析采用别处描述的方法进行(28). P3HR1细胞（1×107)用TPA和丁酸钠处理以诱导Rta和Zta的表达。DNA经超声破碎后，用抗Rta、抗Zta或抗MCAF1抗体免疫沉淀甲醛交联的DNA-蛋白质复合物。通过qPCR检测沉淀物中是否存在特定的DNA片段。用于扩增BHLF1启动子的引物为5′-TCGCCTTTTATCCTCTTTG和5′-CCCACAGGCTAAATGACA；BHRF1，5′-CGCGTCCTTACTGTGTC和5′-CAGGAAGTGGCGACAT；BMRF1，5′-GCCGCTCACCTACATAC和5′-GCAGCAGCAGCAAC；BMLF1，5′-CACAGTGTCCTCTATCA和5′-AACCTCTACTACCAC。使用Power SYBR Green PCR Master Mix和StepOne Real-Time PCR系统（Applied Biosystems），通过SYBR Green-PCR方法对CHIP产物进行三份定量PCR。使用输入DNA的系列稀释液（100、10、1和0.1%）生成标准曲线。根据标准曲线量化每个反应的Ct。
免疫荧光分析
用pEGFP-Rta转染P3HR1细胞。在培养24小时后，通过离心收集细胞，将其置于涂有聚赖氨酸（Sigma）的盖玻片上，并用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液（PBS）中固定30分钟。使用抗Zta单克隆抗体和兔抗MCAF1多克隆抗体进行免疫染色，然后用异硫氰酸荧光素（FITC）结合的驴抗鼠IgG多克隆抗体（KPL）或罗丹明结合的驴抗兔IgG多克隆抗体（DAKO）处理细胞，使用别处描述的方法(27). 用5μg/ml 4′-6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色观察细胞核。染色后，在奥林巴斯共焦激光扫描显微镜（Fluoview 500型）下观察细胞。
瞬时转染试验
P3HR1和293T细胞（5×106)通过使用BTX ECM630电穿孔器（BTX仪器）电穿孔，在240 V、975μF条件下转染5μg质粒。为了抑制MCAF1的表达，293T细胞（1×104)用0.3μg pBHLF1、pEAD和50 pmol siRNA MCAF1转染或用Lipofectamin 2000（Invitrogen）转染对照siRNA（Invit罗gen引物编号130189C06）。如其他地方所述，使用光度计（Orion II；Berthod）进行荧光素酶分析(29). 每个转染实验至少进行三次，实验中的每个样品制备两份。
结果
裂解启动子中Zta、MCAF1和Rta与ZRE的结合
这项工作使用了四种不同的生物素化探针，Rp-SZ、Rp-mS、Rp-mZ和Rp-mSZ(A） ，研究MCAF1、Rta、Sp1和Zta与BRLF1启动子中的Sp1位点和ZRE的结合。用12-O（运行）-十四酰基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）和丁酸钠诱导EBV裂解周期以及Rta和Zta的表达。免疫印迹显示细胞裂解物中存在Sp1、MCAF1、Rta和Zta(B、 车道1和4）。我们早期的研究发现，Rta、MCAF1和Sp1在Sp1位点上形成复合物(12). 因此，正如预期的那样，本研究发现Rta和MCAF1与探针Rp-SZ和Rp-mZ结合(B、 通道2和6），因为两个探针都包含Sp1站点(A） ●●●●。同时，Zta与Rp-SZ绑定，但不与Rp-mZ绑定(B、 泳道2和6），因为在Rp-mZ中，ZRE发生突变(A） ●●●●。这项研究还分析了这些蛋白与Rp-mS的结合，其中包含一个突变的Sp1位点(A） ●●●●。虽然Sp1没有与探针结合，但免疫印迹分析显示MCAF1、Rta和Zta结合(B、 车道3）。此外，在Sp1位点和ZRE均发生突变后，这三种蛋白质没有与探针结合（Rp-mSZ）(A和B，车道7），表明Rta和MCAF1不仅与Sp1站点上的Sp1相互作用，还与ZRE上的Zta相互作用。本研究还研究了BMRF1启动子中Rta、MCAF1和Zta的结合。BMRF1启动子MRp-RZ中−174和−36之间的区域包含一个RRE和三个ZRE(C） ●●●●。免疫印迹分析显示Rta、MCAF1和Zta与生物素化MRp-RZ结合(D、 车道2）。这些结果进一步表明，突变探针中的RRE，MRp-mR(C） ，不影响这三种蛋白质的结合(D、 车道3）。然而，MCAF1和Zta没有与突变探针MRp-mZ结合(D、 车道4），其中三个ZRE发生突变(C） ；尽管检测到Rta与突变探针的结合(D、 车道4）。探针中RRE和ZRE突变后（MRp-mRZ）(C） 、Rta、MCAF1和Zta不再绑定到探针(D、 车道5）。这些结果表明，Rta、MCAF1和Zta在ZRE上形成络合物。本研究使用了另一个ZRE探针HLp-Z，该探针在BHLF1启动子中包含从−74到−41的区域，并显示了这三种蛋白质与探针的结合(E、 车道2）。然而，在ZRE突变后，这些蛋白质没有与探针结合（HLp-mZ）(E、 通道3），验证Rta、MCAF1和Zta与ZRE的绑定。当使用含有BMLF1启动子RRE的另一探针MLp-R时，只检测到Rta的结合(E、 车道5）。此外，RRE突变后，Rta没有与探针结合(E、 泳道6），表明MCAF1和Zta不与结合RRE的Rta相互作用。此外，已知BMLF1启动子含有类似ZRE的序列(). 然而，Zta似乎没有激活启动子(30). 我们的结果表明Zta没有与MLp-mR探针结合，这表明缺乏活化可能是由于Zta不能与这种类ZRE序列结合(E、 车道6）。
Zta、MCAF1和Rta与ZRE的结合。(A类)探针Rp-SZ在BRLF1启动子中包含从−64到−28的序列。它还包括一个Sp1站点（椭圆形）和ZRE（矩形）。探针Rp-mS、Rp-mZ和Rp-mSZ的序列与Rp-SZ相同，只是Rp-SZ中的Sp1位点和ZRE突变，如交叉矩形和交叉卵形所示。数字表示相对于转录起始位点的核苷酸位置“+1”（箭头）TATA’表示TATA框。(C类)探针MRP-RZ包含BMRF1启动子中−174和−36之间的区域。探针MRP-mR、MRP-mZ和MRP-mRZ包含突变的RRE、ZRE以及RRE和ZRE，如交叉矩形所示。(E类)探针HLp-Z含有来自BHLF1启动子的ZRE。在HLp-Z中，ZRE发生突变。(B、 D、E)将探针添加到用TPA和丁酸钠处理过的P3HR1细胞的裂解液中。用链霉亲和素磁珠捕获与探针结合的蛋白质，并用抗MCAF1、抗Rta、抗Sp1和抗Zta抗体进行免疫印迹分析。
Zta、MCAF1和Rta的共免疫沉淀
我们早期的研究表明，Rta和MCAF1相互作用，Rta–MCAF1复合物可以从裂解物中共同免疫沉淀(12). 本研究进行了一项类似的研究，以调查Zta和MCAF1之间的相互作用。免疫印迹分析显示P3HR1裂解物中的MCAF1(A、 通道1）被抗MCAF1抗体免疫沉淀(A、 通道4）和抗Zta抗体共同免疫沉淀(A、 车道3）。一项平行实验发现，裂解液中的Zta(A、 泳道5）被抗Zta抗体免疫沉淀(A、 抗MCAF1抗体与MCAF1共免疫沉淀(A、 车道7）。另一方面，Zta和MCAF1没有被抗IgG抗体免疫沉淀(A、 车道2和6）。这些结果表明Zta和MCAF1相互作用体内一项类似的研究表明，裂解液中的Rta(B、 通道1）被抗Rta抗体免疫沉淀(B、 通道3）和抗Zta抗体共同免疫沉淀(B、 车道4）。细胞裂解液中的Zta(B、 通道5）被抗Zta抗体免疫沉淀(B、 通道8）和抗Rta抗体与Rta共免疫沉淀(B、 泳道7）。在阴性对照组中，Rta和Zta均未被抗IgG抗体免疫沉淀(B、 车道2和6）。
Zta、MCAF1和Rta之间的相互作用体内. (A类)用TPA和丁酸钠处理P3HR1细胞。用抗IgG抗体（2和6道）、抗MCAF1抗体（4和7道）和抗Zta抗体（3和8道）免疫沉淀（IP）裂解液中的蛋白质（1道和5道）。用抗MCAF1（1-4道）和抗Zta（5-8道）抗体通过免疫印迹（IB）分析免疫沉淀蛋白。(B类)用抗IgG（第2和第6道）、抗Rta（第3和第7道）和抗Zta（第4和第8道）抗体免疫沉淀裂解液（第1和第5道）中的蛋白质。用抗Rta（1-4道）和抗Zta（5-8道）抗体免疫印迹法检测免疫沉淀蛋白。（A）和（B）中的泳道1装载有1%的细胞裂解物。（A）和（B）中的通道5装载了3%的细胞裂解物。
Zta–MCAF1–Rta络合物与ZRE的结合体内
用TPA和丁酸钠处理P3HR1细胞，诱导Rta和Zta的表达。在用抗Zta、抗MCAF1和抗Rta抗体免疫沉淀交联蛋白-DNA复合物后，用与BHLF1启动子中ZRE区域侧翼序列互补的引物进行PCR，结果表明含有BHLF1基因启动子的DNA片段被这三种抗体免疫沉淀。抗Zta、抗MCAF1和抗Rta抗体捕获的启动子数量超过了未添加抗体时的反应量，阴性对照(A） ●●●●。添加抗IgG抗体免疫沉淀启动子DNA的水平与阴性对照相当(A） ●●●●。BHRF1和BMRF1启动子也有类似的结果(B和C）。然而，qPCR显示，抗Rta抗体免疫沉淀的BMLF1启动子DNA数量显著高于抗Zta和抗MCAF1抗体免疫沉淀(D） ●●●●。Zta和MCAF1似乎没有与启动子中的ZRE结合。
BHLF1启动子中Zta、MCAF1和Rta与ZRE结合的定量(A类)，BHRF1(B类)，BMRF1(C类)和BMLF1(D类). 用TPA和丁酸钠处理P3HR1细胞。通过使用抗Zta、抗MCAF1和抗Rta抗体的CHIP分析以及qPCR研究Zta、MCAF1及Rta与ZRE的结合。在添加或不添加抗IgG抗体作为阴性对照的情况下进行反应。误差栏表示标准误差。
Rta、MCAF1和Zta的亚细胞定位
我们早期的研究通过共焦显微镜证明了Rta和MCAF1之间的共定位(12). 对Zta、MCAF1和Rta的定位进行了相同的分析。将pEGFP-Rta转染TPA-丁酸钠处理的P3HR1细胞后，在细胞核和细胞质中均观察到GFP-Rta(B） ；Zta只存在于细胞核中(C） ●●●●。合并图像显示GFP-Rta和Zta在细胞核内共定位(D） ●●●●。pEGFP表达的GFP分布在细胞核和细胞质中(F） Zta和GFP之间未观察到共定位(H） ●●●●。同时，在TPA和丁酸钠处理后，发现EBV基因组中表达的Zta与细胞核中的MCAF1共定位(J–L）。用TPA和丁酸钠处理细胞时未观察到结肠化(N–P）。
MCAF1、Rta和Zta的亚细胞定位。pEGFP-Rta转染P3HR1细胞(A–D)或空向量pEGFP(E–H（E–H）)用TPA和丁酸钠（SB）处理。细胞也被处理(I–L型)或未经处理(M–P公司)使用TPA和丁酸钠，无需转染。细胞与单克隆抗Zta抗体（C、G、K和O）和兔抗MCAF1多克隆抗体（J和N）孵育。DAPI染色显示细胞核（A、E、I、M）。在共焦激光扫描显微镜下观察细胞。D、 H、L和P是合并图像。
绘制Zta和MCAF1中的相互作用域
进行联合免疫沉淀实验以描绘Zta中与MCAF1相互作用的区域。用表达GFP-ZN、GFP-ZM和GFP-ZC的质粒共转染293T细胞(A） ●●●●。使用抗GFP抗体的免疫印迹显示GFP-ZN的存在(B、 车道1），GFP-ZM(B、 车道2）和GFP-ZC(B、 泳道3），以及GFP-ZN的共免疫沉淀(B、 车道4），GFP-ZC(B、 车道6），但不包括GFP-ZM(B、 通道5）通过抗MCAF1抗体与MCAF1结合(B、 通道4-6），表明MCAF1与Zta中的反式激活域和包含DNA-结合和二聚化域的区域相互作用(A） ●●●●。还研究了MCAF1片段与Zta的确切相互作用。为此，表达截短GFP-MCAF1融合蛋白的质粒(C） 转染到用TPA和丁酸钠处理过的P3HR1细胞中。转染后，这些蛋白被表达并存在于细胞裂解液中(D、 车道1-4）。免疫印迹分析表明，含有MCAF1中562-816和1154-1270氨基酸区域的GFP融合蛋白（GFP-MCAF1-DM1和GFP-MCAF1-DM2）通过抗Zta抗体与Zta共免疫沉淀(D、 车道6和8）。然而，含有氨基酸1至561区域的GFP融合蛋白（GFP-MCAF1-N）(D、 泳道5）和817至1153（GFP-MCAF1-M）(D、 MCAF1中的第7通道）没有共同免疫沉淀，表明Zta与MCAF1的结构域1和2相互作用，这些结构域也与Sp1、MBD1和TFIIE相互作用(23,24). 此外，在GST下拉试验中，GST-MCAF1-C1-和GST-MCAF1-C2-谷胱甘肽-Sepharose珠(C） 被发现从大肠杆菌裂解物(E、 车道4和5）。然而，GST-或GST-Rta-谷胱甘肽-Sepharose珠并没有降低His-Zta(E、 车道2和3）。GST-Zta-glutathione-Sepharose珠也没有从细菌裂解物中去除His-Rta(E、 车道7），表明Rta和Zta不相互作用。我们早期的工作表明，Rta与MCAF1中的结构域1相互作用，后者也与Zta相互作用(D、 因此，将含有His-MCAF1-C1的细菌裂解液添加到含有GST-Zta和His-Rta的裂解液混合物中。免疫印迹显示，添加His-MCAF1-C1可以使GST-Zta-谷氨酸硫蛋白-Sepharose珠降低His-Rta(E、 通道8），表明Rta和Zta之间的相互作用涉及MCAF1中的域1。
绘制MCAF1和Zta中的相互作用域。(A类)Zta的各个区域与GFP融合。数字表示氨基酸在Zta中的位置。TA，交易激活域；DBD，DNA-结合域；DIM，二聚结构域。(B类)表达GFP-ZN（通道1和4）、GFP-ZM（通道2和5）和GFP-ZC（通道3和6）的质粒转染293T细胞。用抗GFP抗体免疫印迹法（IB）分析裂解产物中的蛋白质（1-3道）。用抗MCAF1抗体对裂解液中的蛋白质进行免疫沉淀，并用抗GFP抗体对IB进行检测（通道4-6）。(C类)表达与GFP融合的MCAF1片段的质粒用于鉴定MCAF1中与Zta相互作用的区域。数字表示氨基酸在MCAF1中的位置。区域1和2由Fujita划定等。(23). (D类)将质粒转染到经TPA和丁酸钠处理的P3HR1细胞中。IB用抗GFP抗体检测细胞裂解液中含有GFP-MCAF1-N（通道1）、GFP-MCAF1-DM1（通道2）、GFP-MCAF1-M（通道3）和GFP-MCASF1-DM2（通道4）的蛋白质。用抗Zta抗体免疫沉淀裂解液中的蛋白质，并用抗GFP抗体免疫印迹分析（5-8道）。(E类)裂解物来自大肠杆菌BL21（DE3）（pET-Zta）与GST-Rta-、GST-MCAF1-C1-、GST-MCAF1-C2-或GST-谷胱甘肽-脑-β混合。使用抗Zta抗体（1-5道）通过免疫印迹法检测与珠子结合的蛋白质。大肠杆菌将含有His-Rta、His-MCAF1-C1和His的裂解物与GST-Zta-glutathione-Sepharose珠混合。用IB和抗Rta抗体（6-8道）检测被珠子拉下的蛋白质。通道1和通道6装载了0.5%的裂解物。Lane 9显示了通过Ni-NTA琼脂糖珠纯化的His-MCAF1-C1的免疫印迹。
ZRE与Rta和Zta协同活化
采用含有从BMRF1启动子转录的萤火虫萤光素酶基因的报告质粒pBMRF1来阐明Rta和Zta如何协同激活转录。该报告质粒中的BMRF1启动子包含一个RRE和三个ZRE(A） ●●●●。在阴性对照组中，该研究发现，在293T细胞中，转染空载体pCMV-3并没有激活pBMRF1中的BMRF1启动子；报告质粒显示的荧光素酶活性处于背景水平(B） ●●●●。然而，当细胞与pCMV-R共转染时，报告质粒显示的荧光素酶活性增加了58倍(B） ，表明Rta激活BMRF1启动子。类似的实验表明，转染pCMV-Z可使报告质粒显示的荧光素酶活性增加30倍(B） 表明Zta也激活BMRF1启动子。此外，与pCMV-R和pCMV-Z共转染后，荧光素酶活性比阴性对照高784倍(B） 表明Rta和Zta协同激活BMRF1启动子。用pBMRF1 mRRE进行了类似的研究(A） ●●●●。在该报告质粒中，pBMRF1中BMRF1启动子中的RRE发生突变(A） ●●●●。用该报告质粒和pCMV-R共转染293T细胞后，报告质粒显示的荧光素酶活性是阴性对照的28倍(B） ●●●●。同时，细胞与pCMV-Z共转染后，荧光素酶活性增加21倍(B） ●●●●。Rta对突变启动子的28倍激活并不令人惊讶，因为Rta通常非特异性地激活空载体的转录(18). 尽管RRE发生突变，但用pCMV-R和pCMV-Z共同转染293T细胞可协同提高启动子活性400倍(B） ●●●●。此外，启动子中的三个ZRE发生突变（pBMRF1-mZRE）(A） ●●●●。尽管pCMV-Z没有激活突变启动子，但转染pCMV-R使293T细胞的启动子活性增加了45倍(B） ，类似于使用pBMRF1实现的级别。另一方面，将pCMV-R和pCMV-Z共转染到细胞中，报告质粒的荧光素酶活性仅增加了19倍；低于使用pCMV-R实现的(B） ●●●●。与转染pCMV-Z相关的Rta激活启动子活性从45倍下降到19倍(B） 与Giot和Quinlivan的发现一致等。(4,5)这表明未结合到ZRE的Zta通过Rta抑制BMRF1启动子的转录激活。Rta中的DNA结合域位于氨基酸1到320的蛋白质的N末端区域(31). 我们早期的研究表明，在该区域含有K213A突变的Rta突变体不会与RRE结合(12). 通过对293T细胞中BMRF1启动子与表达Rta（K213A）的质粒pCMV-R（K213A）进行类似的报告分析，本研究进一步证明协同作用独立于Rta与RRE的结合。荧光素酶分析显示，pCMV-R（K213A）单独激活BMRF1启动子3倍(C） ●●●●。然而，pTag2-Zta表达的Flag-Zta激活了启动子194倍(C） ●●●●。此外，共转染pCMV-R（K213A）和pTag2-Zta协同激活启动子685倍(C） ●●●●。此外，还使用了两个报告质粒pRRE和pZRE，它们分别包含来自BMLF1和BRLF1启动子的RRE和ZRE。用pRRE和pCMV-R共同转染293T细胞可使启动子活性增加11倍(D） ；共转染pCMV-Z并没有增加RRE启动子的活性(C） ●●●●。共转染pCMV-R和pCMV-Z后，RRE启动子的活性增加了12倍(D） 发现Rta和Zta不能协同激活RRE启动子。然而，尽管pCMV-R和pCMV-Z分别将pZRE的启动子活性提高了4.6倍和13倍，但在两种质粒共转染后，ZRE启动子活性增加了107倍，表明Rta和Zta协同提高了ZRE启动程序的活性。此外，免疫印迹分析显示，pCMV-R和pCMV-Z共转染后，pCMV-R不影响pCMV-ZZta的表达反之亦然(E） ，表明所观察到的协同激活不归因于共转染后Rta或Zta表达的升高。
ZRE和Rta和Zta协同活化。(A类)报告质粒pBMRF1包含一个荧光素酶基因，该基因是从BMRF1的−172到+20区域转录的。在该区域，BMRF1启动子包含一个RRE和三个ZRE。在pBMRF1-mRRE和pBMRF1-mZRE中，RRE和ZRE分别发生突变。RRE和ZRE表示为空框。突变序列显示为交叉矩形。(B类)293T细胞与报告质粒pCMV-R和pCMV-Z共转染。以转染pCMV-3的细胞为对照。(C类)293T细胞也被pBMRF1和pCMV-R（K213A）、pTag2-Zta或pCMV-3共转染。(D类)质粒pRRE含有来自BMLF1启动子的RRE，pZRE含有来自BRLF1启动子的ZRE。293T细胞与报告质粒pCMV-R、pCMV-Z和pCMV-3共转染。转染后24小时测定细胞的荧光素酶活性。每个转染实验进行三次，实验中的每个样品制备两份。(E类)用pCMV-3、pCMV-R、pCMV-Z转染293T细胞，或与pCMV-R和pCMV-Z共转染。免疫印迹法检测细胞表达的Rta、Zta和α-微管蛋白。
MCAF1参与Rta和Zta协同激活EBV裂解启动子
本文使用两种报告质粒pBHLF1和pEAD来研究MCAF1如何影响协同激活。在pBHLF1的情况下，pCMV-R使启动子的活性增加了4.7倍；pCMV-Z的活性增加了94倍；pCMV-R和pCMV-Z联合转染后，其活性增加了524倍(A） 293T细胞中。同时，pCMV-R将pEAD中BMRF1启动子的活性提高了83倍，pCMV-Z将其提高了113倍，而pCMV-R和pCMV-Z将其增加了558倍(A） 293T细胞中。这些结果表明，Rta和Zta协同激活BHLF1和BMRF1启动子。此外，用pcDNA-MCAF1转染细胞可将Zta激活的BHLF1转录从41.6倍增加到73.7倍(A） ，表明MCAF1虽然不与Zta协同激活转录，但促进了被Zta激活的转录。同时，用pcDNA-MCAF1共同转染细胞，增加了BHLF1和BMRF1启动子的转录活性，这些启动子被Rta和Zta以剂量依赖的方式协同激活。当细胞转染0.5μg pcDNA-MCAF1时，启动子活性分别增加2.8倍和3.8倍(B） ●●●●。在B淋巴细胞系BJAB中也发现了类似的现象。在细胞中过度表达Rta和Zta分别激活pEAD 35倍和15倍的BMRF1启动子；此外，过度表达这两种蛋白可以协同激活启动子667倍(C） ●●●●。通过转染表达MCAF1也以剂量依赖的方式增强协同激活。在共转染实验中，当0.1、0.3和0.5μg pcDNA-MCAF1也被转染时，协同活化进一步增强2.6、3.0和4.1倍(C） ●●●●。此外，将MCAF1 siRNA转染到293T细胞显著降低MCAF1的细胞内水平(A） 并降低了BHLF1和BMRF1启动子的转录活性，这两个启动子分别被Rta和Zta协同激活67%和74%(B） ●●●●。然而，MCAF1 siRNA并不影响BMLF1启动子的活性(B） ●●●●。
MCAF1和Rta和Zta对转录的同步激活。(A类)用报告质粒pBHLF1或pEAD和表达Rta（R）、Zta（Z）和MCAF1（M）的空载体pCMV-3（CMV）共转染293T细胞。(B类)细胞也被pCMV-R、pCMV-Z和0–0.5μg pcDNA-MCAF1共同转染。(C类)在BJAB细胞中进行了类似的研究。转染48小时后测定细胞的荧光素酶活性。每个转染实验进行三次，实验中的每个样品制备两份。
敲除MCAF1并协同活化。(A类)293T细胞转染MCAF1 siRNA（第2通道）或对照siRNA（第一通道）。转染后48小时，用抗MCAF1抗体免疫印迹法检测MCAF1的表达。以细胞中α-微管蛋白的数量作为对照。(B类)用pBHLF1、pEAD或pBMLF1与pCMV-R、pCMV-Z和MCAF1 siRNA或对照siRNA共转染293T细胞。转染后48小时测定细胞的萤光素酶活性。每个转染实验进行三次，实验中的每个样品制备两份。
讨论
众所周知，病毒通常在生产周期中表达大量的裂解蛋白。为此，病毒通常使用病毒编码的转录因子来促进病毒基因的转录。此外，这些转录因子可以相互协作，协同激活转录，以实现病毒裂解发育所需蛋白质的高水平表达。例如，两种人类巨细胞病毒（HCMV）即时早期蛋白IE1和IE2协同激活HCMV裂解基因(32,33). 已知人类免疫缺陷病毒（HIV）Tat蛋白与PCAF相互作用，协同激活转录(34). 在EBV中，Rta和Zta在裂解周期开始时表达。这两种蛋白质通常相互合作，协同激活转录(三,5,9,17,18). 由于Rta和Zta之间的结合尚未得到实验证明，一个模型提出，在启动子中Rta和Zta分别与RRE和ZRE同时结合是协同活化的先决条件(5,19). 然而，该模型可能无法准确解释转录是如何协同激活的，因为Rta和Zta协同激活没有RRE的BRLF1启动子(18). 因此，另一种模型表明，Rta和Zta通过一种未知蛋白质形成复合物，协同激活转录(4).
如果Rta和Zta的协同激活涉及中间蛋白，则该蛋白可能是MCAF1，因为Rta和Zta同时与MCAF1相互作用。这种相互作用的证据是Rta、MCAF1和Zta与ZRE探针结合在体外(B、 车道3和7；). 这种互动也在继续体内因为这三种蛋白质可以共同免疫沉淀(); 与BHLF1、BHRF1和BMRF1启动子中的ZRE结合，如CHIP分析所示(); 并在细胞核内共存(). BHLF1启动子在奥利利特Rta可能通过与MCAF1和Zta相互作用参与EBV裂解复制。本研究还确定，Rta和Zta之间的相互作用取决于MCAF1中的域1区域，其中MBD1、Sp1和TFIIE也结合(23,24)，因为添加包含该区域序列的肽会导致相互作用(E） ●●●●。
本研究表明，Rta和Zta协同激活转录依赖于ZRE而非RRE。在BMRF1启动子中，从-172到+20的区域包含一个RRE和三个ZRE(A） ●●●●。这项研究的结果表明，突变RRE将协同活性的增加从784倍减少到400倍(B） ●●●●。然而，400倍的增长大大超过了使用pCMV-R或pCMV-Z所实现的增长(B） ，表明Rta和Zta协同激活pBMRF1-mRRE中的突变启动子。事实上，早期的研究也观察到类似现象(5). 这一结果表明，Rta在与RRE结合时，不是参与协同激活，而是单独作用，但不与Zta协同激活转录。此外，突变启动子中的三个ZRE，例如pBMRF1-mZRE(A） ，消除了协同活性从784倍增加到19倍(B） 表明ZRE突变后，pCMV-R和pCMV-Z不再协同激活启动子。此外，pZRE中的ZRE启动子协同激活，而pRRE中的RRE启动子没有协同激活(D） 进一步支持协同活化依赖于ZRE而不是RRE的事实。此外，Giot等。(4)表明Zta中的DNA结合域对协同活化至关重要，支持了ZRE参与协同活化的结论。早期的协同激活研究表明，在BMRF1启动子中ZRE突变后，Zta不再与启动子结合，而与突变启动子未结合的Zta实际上会抑制Rta激活的转录(4,5). 在HCMV中，还发现未结合的IE1抑制IE2激活的转录(32,33). 未结合Zta的抑制作用可以解释为什么共转染pCMV-R和pCMV-Z激活pBMRF1-mZRE中的BMRF1启动子的程度低于使用pCMV-C实现的程度(B） ●●●●。由于Rta与MCAF1的相互作用阻止了Rta与RRE的结合(C、 车道5）(12)在ZRE突变后，未结合的Zta可能与MCAF1和Rta形成复合物，降低与RRE结合以激活转录的Rta水平。
本研究表明MCAF1参与Rta和Zta的协同活化。在一项瞬时转染研究中，表达MCAF1以剂量依赖性方式增加了293T和BJAB细胞中BHLF1和BMRF1启动子的协同激活(B和C）。MCAF1在细胞中组成性表达且丰富()，这可能解释了为什么过度表达MCAF1并没有显著增加协同作用(B和C）。此外，将MCAF1 siRNA引入细胞后，协同活性的增加分别减少了67%和74%(B） ●●●●。这一发现表明，当MCAF1不足时，Rta和Zta不能协同激活转录。由于BMLF1的转录不受影响，MCAF1 siRNA的激活减少不能归因于siRNA非特异性抑制全局转录的可能性(B） ●●●●。本研究还试图通过使用相同的siRNA方法证明EBV基因组中BMRF1的转录受到抑制(图S1). 然而，抑制作用不如转染研究的结果深刻。这一观察结果可能是因为，与转染到细胞中的质粒相比，EBV DNA的拷贝数相对较低。siRNA敲除后留在细胞中的MCAF1的数量可能足以维持BMRF1的转录。这项研究进一步证明，MCAF1增强了被Zta激活的BHLF1的转录，从41.6倍增加到73.7倍(A） ●●●●。此外，siRNA敲低MCAF1可减少增强(图S2)，表明MCAF1促进Zta激活的转录，尽管没有协同作用。此外，尽管Rta通过MCAF1与Sp1相互作用并增强Sp1介导的转录(12)，Rta和Sp1不会协同激活Sp1报告质粒的转录（数据未显示）。同样，我们未公布的数据也表明，Rta通过MCAF1与AP-1和ATF2相互作用。然而，这种相互作用似乎并没有协同激活转录（数据未显示）。这些发现表明，MCAF1–Rta复合物与与启动子结合的蛋白质之间的相互作用并不总是导致协同激活。此外，弗朗西斯等。(19)结果表明，尽管Zta中的S186A突变取消了反式激活能力，但突变蛋白仍然能够与ZRE结合，并与Rta协同激活BMRF1和BRLF1的转录。这一发现表明，Zta与ZRE的结合而不是Zta的反式激活能力对协同激活很重要。
根据我们的结果，我们得出结论，Rta通过MCAF1在ZRE上与Zta相互作用。在这个蛋白复合物中，Rta和Zta可能一起作用或招募额外的转录因子来促进协同激活。Rta和Zta协同激活EBV裂解转录对裂解周期中病毒裂解蛋白的高效表达至关重要。本研究表明，ZRE上Zta–MCAF1–Rta复合物的形成是导致协同活化的潜在机制，这对EBV裂解发展至关重要。
基金
中华民国台湾国立卫生研究院（合同编号：NHRI-EX98-9503BC）；中华民国台湾国家科学委员会（合同号：NSC98-3112-B-182-005）；和长庚纪念医院（合同编号：CMRP-D160113）。开放获取费用资助：中华民国国家科学委员会，台湾。
致谢
作者感谢Chang Jou-Wei和Chen Chien-Chang的技术支持。
参考文献
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