结果
Siah2-null中前列腺NE癌的形成减弱流浪汉老鼠
我们雇佣了流浪汉小鼠模型，其中前列腺特异性表达SV40 T抗原导致前列腺肿瘤转移至淋巴结、肺和肝脏(Gingrich等人，1996年)，以评估Siah在肿瘤生长和转移中的可能作用。8个月大婴儿的分析流浪汉不同的老鼠西亚2背景（陷阱/Siah2−/−,陷阱/Siah2+/−、和陷阱/Siah2+/+)显示大多数患者出现前列腺肿块(). 大多数原发性肿块由良性基质增生和上皮增生组成，伴有不典型上皮增生（AH）陷阱/Siah2−/−与NE癌在陷阱/Siah2+/−和陷阱/Siah2+/+老鼠(). 尽管流浪汉AH在一些文献中被称为腺癌（例如。，Gingrich等人，1996年)，我们称之为流浪汉AH代替明确的歧视，详见Chiaverotti等人（2008）NE癌通过形态学鉴定()以及已建立的NE标志物突触素、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和FoxA2的表达()，这与流浪汉肿瘤主要起源于东北(Chiaverotti等人，2008年; Mirosevich等人，2006年）。相反，正常前列腺中未检测到FoxA2、突触素和NSE(，箭头）或AH（未显示数据）。
肿瘤发生流浪汉Tg（千克）/西亚2老鼠A.原发肿瘤发病率流浪汉显示Siah2基因型小鼠的百分比。
B.神经内分泌癌（NE）的典型H&E染色陷阱/Siah2+/−和AH源自陷阱/Siah2−/−老鼠。
C.NE和AH的发病率流浪汉有指示的小鼠西亚基因型。显示了每个基因型的小鼠数量。深色条表示NE+AH。对照组和对照组之间NE肿瘤发病率p<0.005西亚-不足流浪汉老鼠。
D.使用指定抗体对具有指定基因型的原发性NE癌进行IHC分析。箭头表示正常前列腺上皮组织。
5个月大NE肿瘤病灶的E.NSE和FoxA2染色流浪汉老鼠。
F.指示基因型小鼠NE癌CD31的IHC染色。
G.HIF-1α在PHYL表达的TRAMP-C细胞中的再表达。用指定的表达载体稳定转染细胞。进一步用HIF-1α稳定转染PHYL表达细胞，并在常氧（N）或缺氧（H）条件下维持6 H，然后进行HIF-1 a的western blot分析。
H.和I.TRAMP-C细胞（3×106)将表达对照pKH3载体的PHYL或PHYL+HIF-1α皮下注射到裸鼠两侧。显示注射后8周肿瘤形成的频率（H）和异种移植瘤的大小（I）。在面板I中，每列代表5只小鼠的平均值±SD（标准偏差），pKH3的p<0.05与。PHYL+HIF-1α。另请参见图S1和表S1.
因为Siah1也有助于调节PHD，从而调节HIF的可用性(Nakayama等人，2004年;Qi等人，2008)，我们还评估了Siah1a在前列腺肿瘤形成中的作用。Siah2和Siah1a双纯合突变小鼠无法存活(Frew等人，2003年). 因此，我们建立了一个流浪汉/西亚1a+/−西亚2−/−鼠标线。陷阱/Siah1a+/−西亚2−/−小鼠的前列腺肿瘤发病率与陷阱/Siah2−/−老鼠()但缺少NE肿瘤().
在流浪汉小鼠，早期NE肿瘤病变在3个月后在前列腺腹侧发展，被认为是表达NE标记物的病灶。为了研究Siah2对早期NE肿瘤发展的影响，我们分析了5个月大的小鼠。在3/6只对照小鼠中发现NE病灶，但在10只小鼠中没有发现陷阱/Siah2−/−老鼠()，差异具有统计学意义。这些数据表明流浪汉NE癌的发生需要模型Siah。
AH主要发生在前列腺背侧叶，在1个月大时可识别流浪汉老鼠(Chiaverotti等人，2008年). 为了评估Siah是否也参与AH的进展，我们分析了1月龄和3月龄小鼠的背侧前列腺叶，发现缺乏Siah2会延迟1月龄小鼠从正常前列腺到早期和中期AH以及3月龄鼠从晚期AH的发展(图S1A、S1B).
HIF-1α表达改变与原发性NE肿瘤中细胞增殖减少和细胞死亡增加相关陷阱/Siah2−/−老鼠
与Siah2调节HIF-1α的有效性一致，HIF-1在极少数观察到的NE癌中水平降低()和AH(图S1C)来自TRAMP/Sia2−/−小鼠与陷阱/Siah2+/−老鼠。AH中HIF-2α染色也从陷阱/Siah2−/−老鼠(图S1C)而在任何基因型的NE癌中均未检测到HIF-2α（数据未显示）。这些发现也与观察结果一致，即在前列腺癌中，HIF-1α而不是HIF-2α与NE标记物共表达(Monsef等人，2007年).
分别使用PCNA、TUNEL/活性caspase-3和CD31评估增殖、凋亡和血管生成的潜在变化。NE肿瘤，但不是AH，来自陷阱/Siah2−/−与陷阱/Siah2+/−老鼠(,表S1). 两株NE肿瘤的血管密度相似(,表S1)和AH(,表S1). 因此，Siah的缺失和随之而来的HIF水平的下调似乎特异性地控制着NE肿瘤的增殖和细胞存活。
直接评估Siah2和HIF-1α在肿瘤发生中的可能作用流浪汉细胞，我们分析了来自流浪汉肿瘤(Foster等人，1997年). 这些细胞可能代表NE肿瘤衍生细胞，因为它们表达多种NE特异性转录因子(和数据未显示）。PHYL肽与Siah的底物识别位点结合(House等人，2003年)并减弱Siah2对PHD1/3的影响，从而降低缺氧条件下HIF-1α的水平(Moller等人，2009年;Qi等人，2008). PHYL肽在TRAMP-C细胞中的表达有效地削弱了其形成肿瘤的能力()与NE肿瘤不形成于陷阱/Siah1a+/−西亚2−/−老鼠(). 转染法在表达PHYL肽的TRAMP-C细胞中强制表达HIF-1α()部分恢复了形成肿瘤的能力(). 这些数据支持Siah2在NE前列腺肿瘤形成中的作用，部分通过其对HIF-1α水平的调节。
HIF靶基因的一个子集通过与FoxA2的合作进行调节A.用FoxA2 siRNAs转染TRAMP-C细胞。转染后48小时，细胞在1%氧气中保存10小时，然后分离RNA，对指示的转录物进行qRT-PCR分析。控制（H）与。FoxA2（H）：VEGFA和谷氨酸-1的p>0.1，所有其他的p<0.005。
B.用指示的siRNA转染TRAMP-C细胞。转染后48小时，细胞在1%氧气中维持10小时。分离RNA用于Hes6转录物的qRT-PCR分析。对照组（H）与HIF-1α（H）或FoxA2（H）之间p<0.05。
用含有野生型或突变的−66 bp HRE的1.25 kb Hes6启动子-Luc构建物转染C.TRAMP-C细胞。转染后24小时，在分析荧光素酶活性之前，用DMOG处理细胞（1 mM，16小时）。WT Hes6−DMOG的p<0.005与。+DMOG，突变型Hes6−DMOG的p>0.1与。+DMOG。
D.用指定的质粒转染TRAMP-C细胞。转染后24小时，在分析荧光素酶活性之前，用DMOG处理细胞（1 mM，16小时）。WT Hes6:p<0.01 pcDNA−DMGO与。pcDNA+DMOG，p<0.05 pcDNA+DMGO与。Foxa2+DMOG。
用对照或FoxA2 siRNA转染E.TRAMP-C细胞。转染后48小时，细胞在1%氧气中生长5小时，然后使用指示的抗体对Hes6启动子的HRE区进行ChIP分析。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳上进行分析。显示了具有代表性的三次重复实验的反向凝胶图像。
F.用1%氧气处理FoxA2 shRNA-表达细胞6小时，并用p300抗体进行ChIP分析。免疫沉淀材料用于VEGFA、Jmjd1a和Hes6 HRE相关区域的QPCR分析。ChIP QPCR的结果被归一化为输入的结果。两种细胞系中，对照组和shFoxA2之间的所有基因均为p<0.01。
用对照或p300 siRNA转染G细胞48小时，然后通过qRT-PCR分析所示转录物。TRAMP-C和Rv1:p>0.1控制与。VEGFA p300，所有其他p<0.05。
用Hes6或VEGFA启动子-Luc载体HIF-1α联合转染H.TRAMP-C细胞，并增加p300的数量。转染后24小时，收集细胞裂解物进行荧光素酶分析。Hes6:p<0.0010微克与。三者都有；VEGFA:p<0.005 0微克与。0.5微克，p>0.1微克与。其他两个。
将Hes6启动子-Luc（H）或VEGFA启动子-Loc（I）与所示质粒一起转染I和J.TRAMP-C细胞。转染后24小时，收集细胞裂解物用于分析荧光素酶活性。在面板A-D、F-J中，每列代表3个实验的平均值±SD。Hes6:p<0.01 HIF与。HIF+FoxA2、HIF与。HIF+p300和HIF+FoxA2与。HIF+FoxA2+p300；VEGFA:p>0.1用于这些比较。
K.Flag-p300在体外被翻译并偶联到M2珠上。在体外翻译HIF-1α或FoxA2并用35S.等量35S-HIF-1α和35S-FoxA2与M2珠结Flag-p300孵育。结合蛋白的监测如.
L.Flag-p300（wt或ΔCH1）在体外翻译并与M2珠结合。在体外翻译HIF-1α和FoxA2，并用35S.等量35S-HIF-1α和35S-FoxA2与M2珠结合Flag-p300或Flag-p300-ΔCH1混合并孵育。监测结合蛋白，如。另请参阅图S3、表S2、S3.
减少转移陷阱/Siah2−/−老鼠
肝、肺和淋巴结转移性病变流浪汉根据形态学，小鼠被鉴定为NE癌()和FoxA2/突触素表达(). 然而，肺转移病灶的频率和大小均显著降低（6倍），而在肝脏和淋巴结中未发现陷阱/Siah2−/−小鼠，与陷阱/Siah2+/−或陷阱/Siah2+/+动物(). 此外，我们在陷阱/Siah1a+/−西亚2−/−老鼠(). 很少观察到肺转移陷阱/Siah2−/−小鼠体型较小，细胞增殖减少，细胞死亡增加(). 这些发现表明Siah2在流浪汉肿瘤转移。
转移流浪汉Tg（千克）/Siah2小鼠A.来自流浪汉Siah2基因型小鼠。转移性病变用箭头表示。
B.NE标记物在肿瘤转移灶中的表达陷阱/Siah2+/−通过IHC染色显示抗体的小鼠。
C.转移率流浪汉有指示的小鼠西亚基因型。检查的小鼠和组织数量：N=32（S2+/+和S2+/−)，16（S2−/−)，或9（S1a+/−：S2−/−)对于肝脏和肺部，N=26（S2+/+和S2+/−)，11（S2−/−)，或6（S1a+/−：S2+/−)用于淋巴结。对每个病例，用H&E染色检查5个肺或肝连续切片。
D.肺切片的TUNEL染色（箭头所示的深棕色信号）陷阱/Siah2+/−和陷阱/Siah2−/−老鼠。
大肠杆菌IHC染色法检测来自陷阱/Siah2+/−和陷阱/Siah2−/−老鼠。
FoxA2刺激HIF转录活性
由于NE特异性转录因子FoxA2与HIF-1α蛋白在NE癌细胞核中共同表达()，我们测试了这些转录因子相互合作的可能性。虽然外源性FoxA2在TRAMP-C细胞中的表达并没有改变HRE-linked荧光素酶结构体的表达（HRE-Luc，数据未显示），但外源性HIF-1α的表达单独引起HRE-Lug活性的适度增加，正如预期的那样(). 值得注意的是，HIF-1α和FoxA2的共同表达导致荧光素酶活性比HIF-1(). IPAS的共表达，IPAS是HIF-1α的一种剪接形式，对所有HIFs具有强大的显性负活性(Makino等人，2002年)或通过表达S2RM（Siah2的主要负性形式）或PHYL抑制HIF-1α表达，从而消除FoxA2-潜在的HRE-Luc活性(). 重要的是，在缺氧条件下，FoxA2的敲除导致HRE-Luc活性降低约40%，尽管抑制程度低于HIF-1α或HIF-1βsiRNA(,图S2A). 这些数据确立了FoxA2在增强HIF介导的转录活性中的作用。相反，HIF-1α没有刺激FoxA2转录活性（数据未显示），表明HIF/FoxA2转录协同作用可能仅限于HRE的背景。值得注意的是，在HIF-1α存在的情况下，FoxA1不会增加HRE-Luc活性（数据未显示）。
FoxA2增强HIF转录活性A.用HRE-Luc构建物和所示质粒转染TRAMP-C细胞。转染后24h，细胞在1%氧气中保存10h，收集细胞裂解物测定荧光素酶活性。β-Gal质粒用于正常化转染效率。N和H分别表示常氧和缺氧。p<0.01 pcDNA（N）与。HIF（牛），p<0.0005 HIF（牛）与。HIF+FoxA2（N）。
首先用指示的siRNAs转染B.TRAMP-C细胞，然后用HRE-luc构建物转染48小时。第二次转染后24小时，在分析荧光素酶活性之前，将细胞在1%的氧气中维持10小时。对照组（H）p<0.005与。HIF-1α（H）、HIF-1β（H）或FoxA2（H）。
用FOXA-Luc构建物转染C.TRAMP-C细胞，显示FoxA2缺失突变体。转染后24h，细胞用1%氧气处理10h，然后分析荧光素酶活性。p<0.01重量与。M-1，p>0.1重量与。M-2或M-3。
D.用HRE-Luc构建物和所示质粒转染TRAMP-C细胞。转染后24h，细胞在1%氧气中保存10h，然后分析荧光素酶活性。p<0.001 HIF+WT（牛顿）与。HIF+m3（牛）。面板A-D中的每一列代表3个重复的平均值±SD。
用所示质粒转染E.293T细胞。转染48小时后用Flag抗体结合珠（M2）沉淀HIF-1α，并用免疫印迹分析沉淀蛋白。
F.TRAMP-C细胞维持在1%O25h后沉淀内源性HIF-1α，并通过免疫印迹分析共沉淀蛋白。
将HIF-1αsiRNA转染G。TRAMP-C细胞48 h，然后在缺氧中维持5 h。沉淀内源性HIF-1β，并通过免疫印迹分析共沉淀蛋白。
HIF-1α及其截短突变体在体外翻译，标记为35S、 并用涂有His-FoxA2的镍珠培养。洗涤3次后，通过SDS-PAGE分离珠上的蛋白质，并将其转移到硝酸纤维素膜上。35S标记的HIF-1α用荧光成像仪检测，然后用His抗体免疫印迹检测His-FoxA2。4%的体外翻译35S-HIF-1α作为输入。
I.在体外翻译Flag-HIF-1α并结合到M2珠上，然后用35S标记的体外翻译FoxA2或其截断突变体。如面板H所示，对结合蛋白进行监测。
J.TRAMP-C细胞用指示的载体稳定转染，然后在1%O中生长2HIF-1α免疫沉淀前6小时。用western blot分析共沉淀蛋白。
K.Flag-HIF-1α在体外翻译并结合到M2珠上，然后与35S标记的体外翻译FoxA2和HIF-1β。如面板H所示，对结合蛋白进行监测。另请参见图S2.
然后，我们绘制了与HIF-1α合作所需的FoxA2域。生成由N末端反式激活域（N-TAD）、中央叉头域或C末端反式活化域（C-TAD）组成的FoxA2片段，并评估其对FOXA-和HIF-1α依赖性转录活性的影响(图S2B). 缺乏N-TAD或C-TAD的FoxA2突变体表现出与野生型FoxA2相似的FOXA依赖性转录活性()，表明一个反式激活结构域对于FoxA2转录活性是足够的。缺乏C-TAD的FoxA2突变体将HIF-依赖性转录活性提升到与野生型FoxA2相似的水平，而缺乏N-TAD的福克A2突变体的效果要差得多(). FoxA2 C末端，包含固有染色质重塑活性(Cirillo等人，2002年)，对于HRE激活是不必要的（在,图S2B)从而排除了染色质重塑活性在FoxA2与HIF合作中的作用。这些数据表明，FoxA2的N-TAD和叉头结构域是刺激HIF介导的转录活性所必需的。
HIF与FoxA2互动
在293T细胞中与Flag-HIF-1α共表达HA-FoxA2或HA-FoxA1，然后免疫沉淀Flag-HIF-1α，确定HA-FoxA2-而不是HA-FoxA1-为HIF相关蛋白()，与FoxA2而非FoxA1对HIF-依赖性转录活性的影响一致（数据未显示）。重要的是，内源性FoxA2与内源性HIF-1α共同沉淀()或HIF-1β()在缺氧条件下维持的TRAMP-C细胞中。HIF-1α敲除后，HIF-1β与FoxA2的关联被消除()表明HIF-1α在缺氧条件下将FoxA2招募到HIF复合体。此外，纯化的His-FoxA2和体外翻译的Flag-HIF-1α之间的体外结合证实了它们的直接相互作用().
利用HIF-1α截短突变体进行体外结合(图S2C)和福克斯A2(图S2B)确定HIF-1α的bHLH-PAS结构域()和福克斯A2的N-TAD()作为介导HIF-1α-FoxA2相互作用的最小区域。虽然HIF-1α的bHLH-PAS结构域被发现与FoxA2相互作用，并且已知HIF-1的PAS结构区与HIF-1β相互作用(Erbel等人，2003年)在体外或TRAMP-C细胞中改变FoxA2水平，对HIF-1β与HIF-1α的相互作用没有明显影响().
FoxA2/HIF-1α协同调节HIF靶基因子集
在TRAMP-C、PC3和HeLa细胞中FoxA2表达或HIF-1α和FoxA2的共同表达后，HIF靶点VEGFA和Glut-1的转录水平没有改变（数据未显示），这表明FoxA2/HIF-1的合作选择性地影响HIF调节基因。因此，我们比较了用pcDNA控制载体转染的TRAMP-C细胞的基因表达谱，或编码FoxA2、HIF-1α或HIF-1 a加FoxA2的表达载体。缺氧使TRAMP-C细胞中约140个基因上调(表S2). 对每种情况下表达的基因进行比较，发现缺氧条件下HIF-1α+FoxA2组中有47个基因上调，与其他三组相比(表S3). 在这些和其他低氧诱导基因中，我们进一步评估了30个基因的FoxA2依赖性表达，这些基因是根据前列腺和NE肿瘤特异性表达选择的。为了证实该基因集的FoxA2依赖性转录，我们监测了它们在表达FoxA2 siRNA的TRAMP-C细胞中表达的变化。对所选基因的qRT-PCR分析发现，Hes6、Sox9、Jmjd1a和Plod2在缺氧条件下表现出FoxA2依赖性转录(). Sox9、Jmjd1a和Plod2是已知的HIF靶基因(Amarilio等人，2007年;Beyer等人，2008年; Hofbauer等人，2003年）。相反，FoxA2基因敲除后，谷氨酸-1和VEGFA的转录没有改变(). 总之，这些结果表明，在TRAMP-C细胞中，FoxA2与HIF-1α协同调节缺氧条件下的HIF靶亚群。
HIF-1α和FoxA2协同激活Hes6转录
据报道，转录因子Hes6在NE表型的人转移性前列腺癌中高度上调(Vias等人，2008年). 低氧条件下Hes6转录物的上调表明Hes6是HIF靶基因。事实上，HIF-1α或HIF-1β的敲低降低了低氧诱导的Hes6转录(). 我们鉴定了3个潜在的HRE，并克隆了荧光素酶报告子上游相应的1.25kb小鼠Hes6启动子区域。这种结构被缺氧模拟物DMOG激活2.5倍(图S3A)低氧时为1.8倍（数据未显示）。Hes6启动子的缺失分析表明，低氧诱导的报告活性需要−66bp的HRE(图S3A). 全长1.25kb片段中该HRE的突变导致对DMOG的反应丧失(). FoxA2敲除抑制Hes6转录()，而FoxA2过表达增加了添加DMOG后Hes6启动子的活性，使用HRE突变启动子构建体未观察到这种作用(). 这些观察强烈表明，FoxA2诱导的Hes6启动子活性需要HRE，因此需要HIF活性。染色质免疫沉淀（ChIP）证实HIF-1α和HIF-1β结合了缺氧条件下HES6启动子中的−66 bp HRE，但没有结合其他两个假定的HRE(图S3B). ChIP分析证实FoxA2与相同的−66 bp HRE结合，在HIF-1α敲除后受损(图S3C)表明FoxA2通过HIF-1α被招募到启动子。同样，FoxA2与Sox9的HRE启动子区结合(图S3C)和Jmdj1a（数据未显示）。这些结果表明，FoxA2可能通过与HIF直接结合来调节HIF靶基因的子集。
FoxA2依赖性向HIF靶基因启动子招募p300
为了分析FoxA2与HIF-1α合作的选择性机制，我们研究了FoxA2的表达是否改变了HIF-1β水平、其天冬酰胺羟基化或其与Hes6启动子的结合，但没有发现任何改变（数据未显示）。为了直接评估FoxA结合位点对FoxA2/HIF-1α合作的贡献，我们使用Hes6启动子突变体确定了FoxA2/HIF-1β介导的转录激活的可能变化(图S3D). 虽然单个FoxA位点足以保持对FoxA2/HIF-1α合作的完全反应，但该元件中的突变减弱了这种合作(图S3D). 值得注意的是，分析FoxA2对p300募集的影响，p300是HIF转录活性的共同激活物(Arany等人，1996年)发现FoxA2敲除后p300与Hes6启动子的结合减弱(). FoxA2基因敲除还减少了p300与TRAMP-C细胞和Rv1细胞中Jmjd1a和VEGFA的HRE启动子的结合(). 然而，p300敲除只降低Hes6和Jmjd1a的转录水平，而不降低VEGFA的转录水平()，类似于FoxA2被击倒后的变化()这些基因的低氧诱导转录。这些结果表明p300为一个独特的FoxA2依赖的HIF转录程序服务。与这种可能性一致，HIF发现Hes6的启动子活性对p300水平的增加比VEGFA更敏感(). 值得注意的是，p300而非p300ΔCH1（一种不能与HIF-1α相互作用的p300突变）可以进一步增加HIF/FoxA2对Hes6启动子活性的影响程度(). 相反，FoxA2和p300对VEGFA启动子的HIF依赖性激活没有明显影响(). 这些结果表明，p300的募集在一定程度上负责HIF/FoxA2合作诱导的转录程序的程度和选择性。
体外蛋白结合表明，FoxA2增强了HIF-1α/p300相互作用，但对p300与HIF-1β531-822突变体的结合没有影响，该突变体与FoxA2无关(图S2C,,). 缺乏CH1结构域的p300既不与HIF/FoxA2复合物相互作用()HIF/FoxA2也没有增强Hes6转录(). 这些结果表明，FoxA2促进HIF和p300相互作用不太可能需要HIF-1αN-TAD和p300 CH3结构域(Ruas等人，2010年).
HIF/FoxA2调控的基因对TRAMP-C细胞的肿瘤发生具有重要意义
为了确定HIF/FoxA2合作调节的基因是否对肿瘤发生重要，我们使用逆转录病毒载体在稳定表达PHYL或FoxA2 shRNA的TRAMP-C细胞中单独或联合重新表达Hes6、Sox9和Jmjd1a。当PHYL肽或FoxA2 shRNA表达时，这些基因的内源性表达减弱，但在异位表达后，其转录水平恢复(图S4A、S4B). 表达对照（pBabe载体）或NxN（一种不能与Siah相互作用的突变PHYL，但不表达PHYL或shFoxA2的细胞）的TRAMP-C细胞可以在软琼脂上形成菌落(). 值得注意的是，Hes6、Sox9和Jmjd1a的联合表达有效地挽救了表达PHYL或shFoxA2的TRAMP-C细胞在软琼脂中形成菌落的能力，但每个细胞的再表达都不足(). 与PHYL依赖Siah的效应一致，Siah1a和Siah2的减少(图S4C)HIF-1α蛋白水平降低(图S4D)以及Hes6、Sox9和Jmjd1a转录本(图S4E)并减弱这些细胞在缺氧条件下在软琼脂中形成菌落的能力(图S4F). Hes6、Sox9和Jmjd1a重新表达后，软琼脂中形成菌落的能力下降，可以部分缓解(图S5F).
Hes6、Sox9和Jmjd1a是TRAMP细胞发生肿瘤所必需的A.用指示的载体稳定转染TRAMP-C细胞。插图显示PHYL和NxN的western blot。然后用单独或全部编码Hes6、Sox9或Jmjd1a的逆转录病毒构建体（HSJ）感染表达PHYL的细胞。1×105细胞在软琼脂上在1%氧气下生长3周。所示为6孔板每孔的菌落数。p=0.4（pBabe vs N×N），p=0.053（N×N与。PHYL+HSJ），p<0.0005（N×N与。PHYL、PHYL+Hes6、PHYL+Sox9或PHYL+Jmjd1a），p<0.05（PHYL+HSJ与。PHYL、PHYL+Hes6、PHYL+Sox9或PHYL+Jmjd1a）。
用指示的shRNA转染B。TRAMP-C细胞。插图显示FoxA2的western blot。然后用Hes6、Sox9或Jmjd1a逆转录病毒构建物分别或全部感染shFoxA2-表达细胞（HSJ）。1×105细胞在软琼脂上在1%O的温度下生长2持续3周。所示为6孔板每孔的菌落数。在面板A和B中，每列代表3个重复的平均值±SD。p=0.06（pKLO.1 vs.shFoxA2+HSJ），p<0.005（pKLOC.1与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6、shFoxA2+Sox9或shFoxA2+Jmjd1a），p<0.005（shFoxA1+HSJ与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6、shFoxA2+Sox9或shFoxA2+Jmjd1a）。
C、 D、E、F.G.1×106TRAMP-C转染剂将其注射到裸鼠的前列腺中。注射两个月后，解剖小鼠的泌尿生殖道，并量化前列腺肿瘤的形成。C组显示前列腺肿瘤的代表性图像，用箭头表示。面板D和F描述了肿瘤形成的频率。面板E和G显示了所形成肿瘤的平均大小。在面板E和F中，每列代表5只小鼠的平均值±SD。p<0.05 p宝贝与。PHYL+HSJ和NxN与。PHYL+HSJ，p<0.001（pKLO.1与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6或shFoxA2+Jmjd1a），p<0.005（shFoxA1+HSJ与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6或shFoxA2+Jmjd1a），p<0.01（pKLO.1与。shFoxA2+Sox9），p=0.2（pKLO.1与。shFoxA2+HSJ）。另请参见图S4.
与培养中的发现类似，对照组而非PHYL表达的TRAMP-C细胞在注射到小鼠前列腺后能够形成肿瘤(). 虽然在PHYL表达的TRAMP-C细胞中重新表达Hes6、Sox9或Jmjd1a并不能挽救肿瘤的发生，但这三种基因的表达都能恢复（4/5只小鼠）成瘤性并部分挽救肿瘤的生长（肿瘤大小的30%）(). 前列腺原位注射表达shFoxA2的TRAMP-C细胞也显示出肿瘤形成的显著减少，Hes6、Sox9和Jmjd1a的共同表达几乎完全挽救了肿瘤的形成(). 这些结果进一步证实了HIF/FoxA2靶基因Hes6、Sox9和Jmjd1a在NE前列腺肿瘤发生中的重要性。
HIF和FoxA2共同调控的基因对人前列腺癌细胞低氧相关NE表型和转移很重要
接下来，我们使用流浪汉人类PCa模型。为此，我们选择了CWR22Rv1细胞（Rv1），该细胞来源于显示NE表型的人前列腺癌异种移植物(Huss等人，2004年;Sramkoski等人，1999年). 低氧下生长的Rv1细胞显示NE标记物NSE和嗜铬粒蛋白B（ChgB）上调()并显示了位于菌落边缘的细胞突起的神经样结构(). 伴随NE表型诱导的是Hes6、Sox9和Jmjd1a转录物的上调(). 值得注意的是，抑制Siah或击倒FoxA2可以减弱低氧诱导的Hes6、Sox9和Jmjd1a的上调(图S5A、S5B). 为了确定Hes6、Sox9和Jmjd1a对低氧诱导的NE表型是否重要，我们在表达PHYL或shFoxA的Rv1细胞中单独或联合重新表达这些基因(图S5A、S5B)并且发现只有这三种蛋白的共同表达才能部分恢复低氧诱导的NSE上调和神经鞘瘤样结构的形成(). 这些结果表明，人前列腺癌细胞低氧诱导NE表型中需要Siah-HIF/FoxA2调节基因。
人前列腺癌细胞低氧诱导的NE表型在对NSE和ChgB进行qRT-PCR分析之前，将CWR22Rv1细胞在常氧或缺氧（1%O2）条件下培养指定时间。低氧条件下的转录水平与常压条件下的一致。NSE缺氧p<0.05，p<0.005，p<00001与。分别在第1天、第3天和第5天的正常氧。ChgB缺氧p=0.19，p<0.005，p<00001与。分别在第1天、第3天和第5天正常氧。
B.Rv1细胞在1%氧气下生长指定时间。总裂解产物用于NSE和ChgB的western blot分析。免疫沉淀Hes6和Sox9，然后进行western blot分析。
将C.Rv1细胞以低密度接种到组织培养板上，并在1%氧气中培养6天。固定细胞并进行NSE或ChgB免疫染色。注意低氧培养的细胞中有神经突样突起。
在qRT-PCR分析之前，将D.Rv1细胞在缺氧条件下培养指定时间。低氧条件下的转录水平被归一化为相应常压样本的转录水平。在所有三个时间点，所有三个转录物的P均<0.005。
用对照pBabe载体或PHYL稳定转染E.Rv1细胞。插图：western blot显示PHYL的表达。表达PHYL的Rv1细胞进一步被Hes6、Sox9或Jmjd1a病毒构建物单独或联合感染（HSJ）。在对NSE进行qRT-PCR分析之前，细胞在1%氧气下培养5天。p<0.01 pBabe与。PHYL+HSJ，P<0.0001 pBabe与。所有其他，p<0.005 PHYL+HSJ与。其他PHYL表达细胞。
用对照pKLO.1载体或FoxA2 shRNA转染F.Rv1细胞。插图：western blot显示FoxA2被击倒。shFoxA2-表达细胞被Hes6、Sox9或Jmjd1a病毒构建物单独或联合（HSJ）进一步感染。在对NSE进行qRT-PCR分析之前，细胞在1%氧气下培养5天。p<0.05 pKLO.1与。shFoxA2+HSJ，p<0.0001 pKLO.1与。所有其他，p<0.001 shFoxA2+HSJ与。其他shFoxA2-表达细胞。
将G.Rv1转染体接种在低密度的组织培养板上，并在1%氧气下维持6天。用相控显微镜观察细胞形态。在三份6孔板上对具有神经样结构的菌落数量进行了评分（标准：菌落外围>1/3的细胞具有长度超过20µm的神经样结构）。p<0.01 pBabe与。PHYL或PHYL+HSJ，p<0.001 PHYL+HSJ与。PHYL，p<0.05 pKLO.1与。shFoxA2或shFoxA2+HSJ，p<0.005 shFoxA1与。shFoxA2+HSJ。在面板A、D、E、F、G中，每列代表3个重复的平均值±SD。
高1×106将E和F中描述的Rv1转染体注射到裸鼠前列腺中。注射后4周，收集原位肿瘤并测量其大小。p<0.05 pBabe与。PHYL或PHYL+HSJ，p>0.1 PHYL与。PHYL+HSJ和pKLO.1与。shFoxA2或shFoxA2+HSJ。
I.献血前从H中描述的小鼠心脏采集血液，在选择培养基中培养2周。对平板上的菌落数进行评分，并将其归一化为血容量。p<0.01 pBabe与。PHYL或PHYL+HSJ，p<0.001 PHYL与。PHYL+HSJ，p<0.05 pKLO.1与。shFoxA2或shFoxA2+HSJ，p<0.005 shFoxA1与。shFoxA2+HSJ。在面板H和I中，每列代表5只小鼠的平均值±SD。
J.从H中描述的小鼠收集淋巴结（LN），并用H&E染色以确定转移。p<0.05（pBabe与。PHYL），p=0.17（PHYL与。PHYL+HSJ），p<0.01（pKLO.l vs.shFoxA2），p<0.05（shFoxA2vs.shFoxA2+HSJ）。
K、对H组所述的原位肿瘤切片进行NSE、HIF-1α和FoxA2的IHC染色。
L.对Rv1原位模型的LN或肝转移进行NSE的IHC染色。另请参见图S5，表S4.
为了评估体内NE表型对人前列腺癌的生物学意义，我们将上述Rv1转染物注入裸鼠前列腺。令人惊讶的是，与TRAMP-C细胞不同，表达PHYL的Rv1细胞仅显示肿瘤大小减少约30%，而Hes6、Sox9和Jmjd1a的联合表达无法挽救肿瘤大小(). 同样，表达shFoxA2的Rv1细胞在肿瘤形成中没有表现出任何显著的减少(). 这些结果表明Hes6、Sox9和Jmjd1a与Rv1细胞的肿瘤发生无关。PHYL使肿瘤缩小30%与肿瘤血管密度减少35%相关(图S5C，表S4)体外表达PHYL的Rv1细胞中VEGFA转录物减少40%(图S5D). 同样，软琼脂试验中的菌落形成与表达PHYL的Rv1细胞和对照细胞相似(图S5E). 值得注意的是，血液中循环的表达PHYL-或shFoxA2的Rv1细胞减少，这表明这些细胞的浸润受损，Hes6、Sox9和Jmjd1a的共同表达部分挽救了这些细胞(). 尽管Rv1细胞表现出有限的形成肝转移的能力（每10只注射Rv1的小鼠中就有2只），但它们对主动脉周围淋巴结转移非常有效。PHYL或shFoxA2的表达可消除Rv1细胞的淋巴结转移，Hes6、Sox9和Jmjd1a的联合表达可大幅度恢复这种转移(). 这些发现表明HIF和FoxA2共同调控的基因在前列腺癌细胞转移中起着关键作用。
Rv1原位肿瘤的IHC分析显示HIF-1α和NSE染色集中在坏死区域周围，已知坏死区域高度缺氧，而FoxA2染色分布均匀(). 正如预期的那样，PHYL的表达导致缺氧区域HIF-1α染色减少和NSE染色丢失(). FoxA2 shRNA减少缺氧区域的NSE染色而不影响HIF-1α水平()与我们的体外数据一致(). 重要的是，与我们的体外结果一致，在PHYL或shFoxA2表达的Rv1细胞中Hes6、Sox9和Jmjd1a的共同表达恢复了缺氧区域的NSE染色(). 强烈的NSE染色主要见于原发肿瘤坏死附近缺氧较多的区域()以及肝脏和淋巴结的转移性病变()这意味着NE分化的Rv1细胞可能与转移有关。这些结果表明，HIF和FoxA2共同调控的基因在体内外PCa低氧诱导NE表型中起着关键作用，NE表型与PCa转移密切相关。
FoxA2-HIF-1α靶基因在前列腺肿瘤中的表达
接下来我们询问FoxA2/HIF-1α转录靶点是否在NE肿瘤中表达。在陷阱/Siah2−/−与对照组相比，小鼠Hes6、Sox9、Jmjd1a和Plod2的转录水平较低陷阱/Siah2+/−-衍生NE肿瘤()与HIF-1α依赖性表达一致。
前列腺肿瘤中HIF/FoxA2靶点的变化A.进行激光捕获显微切割，从肿瘤中收集NE癌细胞陷阱/Siah2+/−或陷阱/Siah2−/−老鼠。分离RNA，对指示转录物进行qRT-PCR分析。每列代表2个重复的平均值±SD。西亚2+/− 与Siah2−/−Hes6、Sox9和Jmjd1a的p＜0.05，VEGFA和Glut-1的p分别为0.78和0.46。
B.对具有NED病灶的人前列腺癌进行FoxA2、Hes6和HIF-1α的IHC。所示为具有相应NE控制标记NSE的代表性图像。
使用所示抗体对15例人PCa标本的连续切片进行了C.IHC染色，其中10例具有NE表型（NSE阳性），5例没有NE表型。Hes6、Sox9和Jmjd1a在有NE表型的人PCa中的共表达与无NE表型人PCa相比具有统计学意义（p<0.05）。
D.对由PINs和不同Gleason评分的前列腺癌组成的人类前列腺TMA进行IHC染色，每个肿瘤组的数量如图所示。染色强度由2名病理学家根据4个等级进行评分：0（无染色）、1（弱染色）、2（中染色）3例（强染色）。刻度0和1被定义为阴性染色，而刻度2和3被定义为阳性染色。图中所示为阳性染色核心中所示抗体的百分比。
E.所示为来自{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE3325”，“term_id”：“3325”}}GSE3325标准。列表示肿瘤样本（良性，B1–B6；初级，P1–P7；转移，M1–M6），行表示基因。heatmap用红色表示较高的表达水平，用蓝色表示较低的表达水平。每个基因的表达数据进行行标准化。转移性PCa中Siah2、FoxA2、Hes6、Jmjd1a、Plod2、DDC、ChgB和ENO2的转录水平在统计学上显著高于原发性PCa。另请参见图S6.
根据NE标记物的IHC染色，人PCa中的NE表型可分为三种类型(辛多洛等人，2007年;Hirano等人，2005年;清水等，2007年). 病灶-NE标记区分细胞簇-见于低分化和中度分化的PCa；在高分化和低分化的前列腺癌中发现的一般染色——较大的肿瘤区域NE标记物阳性；NE标记阳性的单个细胞(Hirano等人，2005年). 我们检查了15例人类PCa，发现10例表现为NE表型。10个样本中有2个显示NE标记NSE的局灶染色，其中FoxA2、Hes6和Sox9集中在NE病灶中(,图S6A). 10个标本中有8个呈NSE一般染色，其中5/8例为FoxA2、Hes6和Sox9联合染色。70%NE表型PCa标本中FoxA2、Hes6和Sox9的共表达具有统计学意义（p<0.05；).
接下来，我们对人类前列腺TMA进行了IHC染色，该TMA由79例前列腺上皮内瘤变（PIN）和不同Gleason分期的前列腺癌组成。高级别PCa（G4和G5）中NSE染色较高，与低级别肿瘤（PIN和G3）相比，Siah2、FoxA2、Hes6和Sox9染色也增加(). 高、低度恶性肿瘤中NSE、Siah2、FoxA2、Hes6和Sox9的表达差异具有统计学意义，并与病理临床分期相关。此外，3例人前列腺NE肿瘤的IHC染色显示突触素、FoxA2、HIF-1α、Hes6和Sox9在所有病例中共同表达(图S6B). 这些发现表明，NE阳性肿瘤与更恶性的人类前列腺癌相关，其中HIF/FoxA2靶基因有望在NE表型的发展中发挥作用。与原发性前列腺癌和正常前列腺组织相比，来自人类前列腺癌的基因表达数据证实转移性前列腺癌中Hes6、Plod2、Jmjd1a和FoxA2的表达显著增加(). 这些基因的表达与NE标记的表达相关，进一步说明了它们的表达、NED和转移性前列腺肿瘤之间的联系().
Siah2染色在高级别前列腺癌中较高，而HIF-1α染色在低级别和高级别肿瘤中都有发现(). 尽管HIF-1α在所有级别的肿瘤中都有高水平表达，但作为HIF转录活性的常见读数，谷氨酸-1的水平仅在高级别PCa中高，这表明Siah2表达与HIF-1(). 一致的是，基因表达分析显示，与原发性PCa相比，转移性PCa中的Siah2转录物增加，HIF靶基因如CA9、VEGFA和Glut-1的转录物增加反映出HIF活性增强(). 这些结果证实了人类PCa中Siah2表达与HIF活性之间的相关性，与Siah在调节PHD3和抑制HIF-1（FIH）稳定性（控制HIF-1α的可用性和活性）中的作用一致(Nakayama等人，2004年;Fukuba等人，2008年). HIF和FoxA2在确定NE表型方面的合作可归因于较高水平的Siah2，这增加了HIF的稳定性和活性，以及高级别PCa中FoxA2的可用性。
讨论
我们的结果揭示了FoxA2/HIF-1α复合物在确定NE前列腺肿瘤形成和NE表型（转移性前列腺腺癌的重要组成部分）中的调节和功能。这些结果也表明了Siah2在决定肿瘤分化中的作用。Siah2缺失对前列腺管腔上皮的发育和生长几乎没有影响，但减少了NE癌的发生，从而减少了肿瘤的转移负担流浪汉模型。我们发现，Siah2-null背景上Siah1a的部分缺失完全消融了NE肿瘤的形成，表明Siah2和Siah1都是前列腺NE肿瘤发生的必要条件。
由于HIF-1α在缺氧条件下稳定，FoxA2在NE组织中表达，我们的研究结果表明，在特定组织和氧气需求下，这两个因素之间存在条件和空间合作。HIF的Siah2依赖性调节与FoxA2的NE特异性表达为与高转移表型相关的特定肿瘤分化程序提供了框架。在本研究确定的四个FoxA2/HIF靶点中，据报道Hes6在显示NE标记物的转移性前列腺癌中高度上调(Vias等人，2008年)Plod2在转移性前列腺NE肿瘤中过度表达(Shah等人，2004年). 复发雄激素抵抗型前列腺癌中Sox9表达增加，并与生长增强、侵袭和血管生成相关(Wang等人，2008). 值得注意的是，Hes6、Sox9和Jmjd1a已被证明调节干/祖细胞的分化(Eun等人，2008年;Loh等人，2007年;Nowak等人，2008年)，增加了FoxA2/HIF合作启动转录程序的可能性，该转录程序调节正常和/或前列腺癌干细胞的神经内分泌分化。一致认为，PCa的NE表型也与干/祖细胞标记物的表达有关，支持NE样细胞可能含有前列腺癌干细胞的观点(Bonkhoff，1998年; Helpap等人，1999年；Sotomayor等人，2008年).
HIF-1α/FoxA2转录协同作用的几个可能机制，我们排除了FoxA2固有染色质重塑活性的重要性(Cirillo等人，2002年)FoxA2取代HIF-1β。我们的数据表明，FoxA2增强了p300的募集，以选择性激活HIF靶基因子集。与我们的研究结果一致，在荧光素酶报告基因检测中，来自表达p300/CBP突变体但不能与HIF相互作用的小鼠的MEF表现出减弱的HIF活性，但仅表现出HIF靶基因的一小部分表达减弱，不包括VEGFA和Glut-1(Kasper等人，2005年).
Hes6、Sox9和Jmjd1a在缺氧条件下表现NE表型的人类PCa细胞中对NE表型具有重要意义。抑制这些基因可减弱NE表型和PCa转移，而它们的共同表达可挽救NE表型及转移，即使在其上游调节因子FoxA2或Siah2被击倒时也是如此。值得注意的是，缺氧对NE表型的要求通过体内PCa的IHC分析得到了证实，其中NSE水平与HIF、FoxA2及其调控基因的水平一致。同样重要的是，Hes6、Sox9和Jmjd1a的共同表达可以克服Siah2活性减弱对小鼠前列腺癌生长的抑制作用，进一步说明它们之间的合作对前列腺癌发展的重要性。
总的来说，我们的研究提供了NE表型形成和NE前列腺肿瘤发展的范例。该途径需要泛素连接酶Siah2，它决定HIF-1α的水平和活性，然后与NE特异性转录因子FoxA2合作。正是这些因子的条件和空间调控激活了对NE表型、PCa转移以及NE前列腺肿瘤发展至关重要的基因子集。NE前列腺肿瘤和携带NE表型的PCa常见的是其强烈的转移倾向，以及与这些侵袭性更强的前列腺癌相关的不良结果。我们的发现分别揭示了其发展和进展的机制，同时确定了可能的治疗靶点和标记物，以改进对这些肿瘤的检测和监测。
实验程序
前列腺肿瘤样本
作为加州大学戴维斯分校（IRB#200312072）、加州大学欧文分校（SPECS项目，IRB#20005-4806）和西北大学（SPORE组织库协议，IRB#NCI01×2:STU00009126）批准的临床研究的一部分，获得了代表NE肿瘤和/或前列腺腺癌的前列腺肿瘤样本。在所有情况下，均获得了所有受试者的知情同意。
动物研究
所有动物都被安置在桑福德-伯纳姆研究所的动物设施中，活体动物实验得到了研究所动物委员会（IACUC#04-135,04-141,07-132）的批准，并根据NIH指南，按照研究所动物政策进行。
单元格行
TRAMP-C细胞保存在补充有5%Nu-serum IV、5%胎牛血清（FBS）、5µg/ml胰岛素和抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。CWR22 Rv1细胞保存在含有5%FBS和抗生素的RPMI1640培养基中。
的生成流浪汉Siah2基因敲除背景中的老鼠
西亚2+/−小鼠（129株SVJ）与流浪汉转基因小鼠（C57/Bl6株）获得Siah2杂合子，携带流浪汉转基因（C57/Bl6和129 SVJ混合株）。女性西亚2+/−/流浪汉小鼠与雄性杂交西亚2+/−小鼠产生雄性流浪汉三种基因型小鼠（西亚2 +/+, +/−, −/−)主要是129株。女性西亚2+/−/流浪汉小鼠也与雄性杂交西亚1a+/−西亚2+/−小鼠产生雄性流浪汉带有西亚1a+/−西亚2−/−基因型。Siah/陷阱8个月龄时对小鼠进行分析。
抗体和试剂
根据制造商的建议，使用了HIF-1α、HIF-2α和Sox9（NOVUS）、Hes6、Jmjd1a、p300和NSE（Abcam）、突触素（BD Bioscience）、FoxA2、HIF-1β和CD31、嗜铬粒蛋白B（Santa Cruz）、活性caspase-3（Chemicon）、PCNA（Cell Signaling）、FLAG、HA、α-微管蛋白和β-肌动蛋白（Sigma）的抗体。ApopTag过氧化物酶原位凋亡试剂盒来自Chemicon
统计分析
统计分析采用Student t检验或Fisher精确检验。
集锦
泛素连接酶Siah2是NE前列腺肿瘤发生所必需的
HIF1α和FoxA2合作确定组织特异性HIF转录协同作用
前列腺肿瘤NE表型需要HIF1α/FoxA2靶基因
HIF1α/FoxA2靶基因在前列腺转移瘤中高表达
参与者信息
齐剑飞，信号转导项目，Sanford-Burnham医学研究所，加利福尼亚州拉霍拉，92037，美国。
中山浩，日本东京113-8510，东京医学和牙科大学医学研究所MTT项目。
罗伯特·卡迪夫，加利福尼亚大学戴维斯分校医学院比较医学中心和病理学系，加利福尼亚州95616。
亚历山大·博罗夫斯基（Alexander D.Borowsky），加利福尼亚大学戴维斯分校医学院比较医学中心和病理学系，加利福尼亚州95616。
Karen Kaul，NorthShore University Health System，Evanston Hospital，Evanson，IL 60201和Pritzker School of Medicine，University of Chicago，IL 60637。
罗伊·威廉姆斯，信号转导项目，Sanford-Burnham医学研究所，加利福尼亚州拉霍拉，92037，美国。
斯坦·克拉耶夫斯基，信号转导项目，Sanford-Burnham医学研究所，加利福尼亚州拉霍拉，92037，美国。
丹·默科拉，转化癌症生物学，加州大学欧文分校，加利福尼亚州92697。
菲利普·卡彭特，转化癌症生物学，加州大学欧文分校，加利福尼亚州92697。
大卫·鲍特尔，澳大利亚维多利亚州墨尔本8006 Peter McCallum癌症中心研究部。
泽耶夫·A·罗奈，信号转导项目，Sanford-Burnham医学研究所，加利福尼亚州拉霍拉，92037，美国。
