我们使用Nanog-GFP报告系统对iPS细胞进行敏感和特异的鉴定三当将缺乏c-Myc的三种因子引入Nanog GFP、p53野生型MEF时，我们从5000个转导的成纤维细胞中获得了11±8（n=4）个GFP阳性集落(). 从Nanog-GFP，p53恒生突变MEF中，我们观察到58±56个GFP阳性菌落。相反，从Nanog-GFP、p53完整成纤维细胞中，我们获得的GFP阳性集落（275±181）明显多于野生型MEF。
通过四个或三个重编程因子从p53全MEF生成iPS细胞a.通过三种重编程因子（Oct3/4、Sox2、Klf4）从Nanog-GFP报告者MEF中生成iPS细胞，这些细胞是p53野生型（+/+）、杂合型（+/-）或纯合型（-/-）。逆转录病毒转导后，用流式细胞仪收集5000个活细胞。转导后28天计数GFP阳性菌落。*，与野生型相比，p<0.05（n=4）。
b.iPS细胞由这三个因子从96 well板孔中的单个分选细胞中产生。转导后28天计数GFP阳性菌落。**，与野生型相比，p<0.01（n=4）。
c.iPS细胞是由包括c-Myc在内的四种因子从96 well板孔中的单个分选细胞中生成的。转导21天后计数GFP阳性菌落。*，与野生型相比，p<0.05（n=4）。
d.表达显性阴性p53突变体（P275S）或野生型的逆转录病毒与这三个因子共同转导到Nanog-GFP，p53杂合MEF中。逆转录病毒转导后，收集5000个细胞，并在转导后28天计数GFP阳性集落。作为对照，转导了一种红色荧光蛋白（DsRed）的逆转录病毒，与DsRed对照组相比，p<0.05（n=3）。
e.表达野生型或突变型p53的逆转录病毒与三种因子共同转导到Nanog-GFP，p53全MEF中。逆转录病毒转导后，收集5000个活细胞，并在转导后28天计数GFP阳性菌落。*，与DsRed对照组相比，p<0.05（n=3）。
通过使用流式细胞仪，我们将一个Nanog-GFP细胞（p53野生型、杂合突变型或纯合突变型），在重新镀膜前五天用三种因子转导到一个96 well板孔中。重新镀膜后23天，我们在每96周的板上观察到GFP阳性集落数孔，其中含有p53野生型或杂合型成纤维细胞(). 相比之下，我们观察到GFP阳性集落位于每96周板中7±4（n=4）个孔，p53为全成纤维细胞。这些数据表明，p53功能的丧失显著提高了效率，即使没有c-Myc，高达10%的转导细胞也可以成为iPS细胞。
我们对包括c-Myc在内的四个因子进行了相同的实验。我们在具有p53野生型成纤维细胞的96孔板中观察到0孔或1孔中的GFP阳性集落(). 相比之下，我们观察到GFP阳性集落分别位于6±7和16±10（n=4）个孔中，每个96 well板上有p53的灭活细胞和p53的完整成纤维细胞。这些数据表明，Myc逆转录病毒的加入进一步提高了iPS产生的效率，高达20%。
我们还测试了显性阴性p53突变P275S的作用13iPS细胞的生成。当P275S被引入Nanog-GFP（p53恒生MEF）中时，我们观察到GFP阳性菌落数量显著增加(). 此外，我们放置了编码野生型p53或反式激活缺陷突变体（D278N）的互补DNA（cDNA）14或S58A15)进入pMX逆转录病毒载体16并将其与编码Oct3/4、Sox2和Klf4的逆转录病毒一起导入Nanog-GFP，p53-null MEF。野生型p53显著减少了GFP阳性集落的数量(). 相反，反式激活缺陷型p53突变体没有显示出显著的效果。这些数据证实，p53缺失是直接重编程效率提高的原因。
我们扩展了由三个或四个因素（分别为六个和三个克隆）产生的p53完整、GFP阳性克隆。所有克隆在第二代时均显示出与小鼠ES细胞相似的形态（S-图1a）。三种因子产生的克隆表达内源性2004年10月3日，内源性Sox2系统，以及纳克与ES细胞水平相当（S-图1b）。的总表达级别10月3/4日和Sox2系统也可与ES细胞中的基因相比较，表明转基因被有效沉默（S图1c）。当移植到裸鼠体内时，所有六个克隆都产生了畸胎瘤，其中包含来自三个胚层的组织（S图1d）。这些数据证实了由p53全MEF的三个因子产生的iPS细胞的多能性。
我们发现内源性2004年10月3日和Sox2系统在包括c-Myc在内的四种因子产生的p53阴性细胞中含量较低。（S-图1b）。相反Sox2系统,Klf4公司和c-Myc公司这些细胞中的表达量明显高于其余的iPS细胞和ES细胞（S图1c），表明逆转录病毒在这些细胞中仍然活跃。与这一观察结果一致，裸鼠体内来源于这些细胞的肿瘤主要由未分化细胞组成，只有小面积的分化组织（S-图1d）。此外，四种因子产生的p53完整细胞在第五代后无法保持ES细胞样形态（S图1e）。因此，c-Myc转基因在p53全背景下抑制逆转录病毒沉默，并抑制iPS细胞特性的获得和维持。
接下来，我们尝试在p53全背景下，通过四个因子从最终分化的体细胞中生成iPS细胞(). 我们从Nanog-GFP报告小鼠中分离出p53野生型或p53阴性的T淋巴细胞。我们通过抗CD3/CD28抗体激活T细胞，并用四种逆转录病毒转导。从p53野生型T淋巴细胞中，我们没有获得任何GFP阳性集落。相反，我们从p53全T细胞（2×10）中获得了11个GFP阳性集落6细胞），从中建立了三个iPS细胞系。
T淋巴细胞衍生iPS细胞a.从小鼠T淋巴细胞生成iPS细胞的方案。中医药；T细胞培养基；ES细胞培养基。
b.T细胞衍生iPS细胞（克隆408E2）的相位对比图、Nanog-GFP表达、碱性磷酸酶染色和SSEA1染色。条形图显示100μm。
c.通过RT-PCR检测标记基因在T细胞衍生的iPS细胞（克隆408E-2、-7和-8）、RF8 ES细胞、T细胞、脾脏、来自p53野生型MEF的Fbx15选择的iPS细胞（克隆7B3）和来自p53野生型MEF的Nanog选择的iPS细胞（克隆38D2）中的表达
d.来自克隆408E2的嵌合体小鼠。将iPS细胞显微注射到ICR小鼠的囊胚中。
e.病毒的V-（D）-J DNA重排Tcrβ通过基因组PCR在iPS细胞和嵌合小鼠中证实了该基因。GL表示生殖系带。
这些GFP-阳性细胞可膨胀，其形态与小鼠ES细胞相似(). 小鼠ES细胞标记物碱性磷酸酶和SSEA1阳性(). 他们还表达了ES细胞标记基因，包括雷克斯1，以及纳克(). 相反，他们不表达T细胞特异性基因，如FasL、GzmA、GzmB和Ifng公司与来自p53-null MEF的iPS细胞一样，这些细胞中转基因的沉默并不完全。然而，我们从这些iPS细胞中获得了四只成年嵌合体小鼠(). 正如我们从p53全背景和c-Myc逆转录病毒的不完全沉默中预测的那样，四只嵌合小鼠中有三只在七周内死亡。我们证实了这些iPS细胞、嵌合体的各种组织以及嵌合体中观察到的肿瘤中T细胞受体的重排(). 肿瘤中重排的带的强度与iPS细胞中的一样强，这表明肿瘤来源于iPS细胞。这些数据表明，当p53失活时，这四种因子甚至可以从最终分化的T细胞中生成iPS细胞。
然后我们检查了p53缺陷是否增加了人类iPS细胞生成的效率。为此，我们引入了显性阴性突变体P275S或p53羧基末端显性阴性片段（p53DD）17与三个或四个重编程因子一起转化成成人皮肤成纤维细胞（HDF）。我们发现，两个独立的p53显性阴性突变体显著增加了iPS细胞集落的数量（S图2a和b）。在另一个实验中，我们检测了shRNA对人类p53（shRNA-2）的影响18我们证实shRNA有效地抑制了HDF中的p53蛋白水平（S图2c）。当与四个重新编程因素共同引入时第53页shRNA显著增加了人iPS细胞集落的数量（S-图2d）。在三个重编程因子的实验中获得了类似的结果（S图2e）。相反，抑制Rb并没有增强iPS细胞的生成。在反义序列中含有一个核苷酸缺失的对照shRNA（shRNA-1）没有显示出这样的效果（S-图2d&e）。小鼠p53的共同诱导抑制了shRNA的作用。当移植到SCID小鼠的睾丸中时，这些细胞发育成包含三个胚层的各种组织的畸胎瘤（S图2f）。这些数据表明，p53不仅在小鼠中抑制iPS细胞的生成，而且在人类中也抑制iPS的生成。
为了阐明与观察到的iPS细胞生成增强有关的p53靶基因，我们通过DNA微阵列比较了p53野生型MEF和p53全MEF之间的基因表达，以及对照HDF和p53-敲除HDF之间的表达。在p53-null MEF中，1590个基因增加，1485个基因减少>5倍。HDF中，290个基因增加，430个基因减少5倍以上第53页shRNA。在小鼠和人类之间，共有8个增加的基因，包括v-myb成髓细胞病病毒癌基因同源物（myb）和RAS癌基因家族RAB39B（S-表1）。27个减少的基因在这两个物种中很常见，包括p53、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21，Cip1）、BTG家族、成员2（BTG2）、锌指、基质蛋白3型（ZMAT3）和MDM2。
我们通过逆转录病毒将四个增加的基因和七个减少的基因转导到HDF中，再加上这四个重编程因子，或者与这四个因子和第53页shRNA。在四个增加的基因中，没有一个模仿p53抑制的效果(). 在7个减少的基因中，结合并降解p53蛋白的MDM2模拟了p53抑制。两个基因，来自小鼠的p53和p21有效地抵消了第53页shRNA(). p21的强制表达显著降低了由p53缺失的MEF产生的iPS细胞（未显示）。在野生型MEF中，四种因子的结合显著增加了p21蛋白水平(). 当c-Myc被忽略时，p21蛋白仍然增加，但比四个因素增加的程度要小。在p53-null MEF中，未观察到三个或四个因素导致的p21蛋白增加。这些数据强调了p21在iPS细胞生成过程中作为p53靶点的重要性。
c-Myc和p53抑制对p21的影响a.将p53调节的基因与四个重编程因子一起导入HDF。在转导后的第24天，计算iPS细胞集落的数量。**；与DsRed对照组相比，p<0.01（n=3）。
b.将p53调节的基因与四个重编程因子和第53页shRNA。在转导后第28天，计算iPS细胞集落的数量。**；与DsRed对照组相比，p<0.01（n=3）。
c.在iPS细胞生成过程中p21蛋白的诱导。MEF，无论是野生型还是p53-null型，都是用四个或三个重编程因子转染的。转导后3天，通过western blot分析测定p21和p53蛋白水平。
最后，我们通过重复转染两种表达质粒，从野生型或p53-null MEF中生成iPS细胞，这两种表达载体均含有Nanog-GFP报告子，一种表达质粒含有与2A多肽连接的Oct3/4、Klf4和Sox2 cDNA，另一种表达载体含有c-Myc cDNA(). 我们镀1.3×105MEF并将这两种质粒每天一起转染7天。28日第个在首次转染后几天，我们没有观察到任何来自野生型细胞的Nanog GFP阳性集落(). 相反，约100个GFP阳性集落出现在p53阴性细胞中。我们随机选取了12个菌落，发现其中7个菌落不含质粒整合(). 通过显微注射这些无整合的iPS细胞，我们获得了成年嵌合小鼠(). 能否获得种系传播尚待确定。
p53抑制对质粒介导小鼠iPS细胞生成的影响a.通过质粒转染产生小鼠iPS细胞的方案。
b.GFP阳性菌落数。显示了不同转染试剂的实验结果。
c.通过基因组PCR检测质粒整合。
d.来源于无整合iPS细胞的嵌合体小鼠。将iPS细胞显微注射到ICR小鼠的囊胚中。
我们的数据显示，p53和p21抑制iPS细胞的生成。这些抑癌基因产物对细胞增殖、存活或电镀效率的抑制作用应该有助于观察到的效果（S图3）。此外，它们可能对重新编程产生直接影响。永久抑制p53会降低iPS细胞的质量，并导致基因组不稳定。然而，siRNA或其他方法对p53的瞬时抑制可能有助于生成无整合的iPS细胞，用于未来的医疗应用。
方法
p53逆转录病毒载体的产生
小鼠cDNA第53页用p53-1S（CAC CAG GAT TGC CAT GGA GGA GTC）和p53-1223AS（GTG TCT CAG CCC TGA AGT CAT AA）进行RT-PCR扩增，亚克隆到pENTR-D-TOPO（Invitrogen）中。测序验证后，通过网关克隆技术（Invitrogen）将cDNA转移到pMXs-gw。通过两步PCR产生p53突变的逆转录病毒载体。对于P275S突变体，使用两组引物p53-P275S-S（TGT TTG TGC CTC TGG GAG AGA CCG C）和p53-1223AS，以及p53-P25S-AS（GCG GTC TCT CCC AGA GCA GGC ACA AAC A）和p53-1S进行第一次PCR。对于DD突变体，用两组引物p53-DD-S（CGG ATA TCA GCC TCA AGA GAG CGC TGC C）和p53-1223AS以及p53-DD AS（GGC AGC CTC TTG AGG CTG ATA TC G）和p53-1S进行第一次PCR。对于D278N突变体，使用两组引物p53-D278N-S（TGC CCT GGG AGA AAC CGT ACA GAA）和p53-1223AS，以及p53-D288N-AS（TTC TGT ACG GCG GTT TCT CCC AGG GCA）和p 53-1S进行第一次PCR。对于S58A突变体，用两组引物p53-S58A-S（TTT GAA GGC CCA GCT GAA GCC CTC CGA）和p53-1223AS以及p53-S58 A-AS（TCG GAG GGC TTC AGC TGG GCC TTC AAA）和p 53-1S进行第一次PCR。将每个第一次PCR的两个PCR产物混合，作为带有引物集p53-1S和p53-1223AS的第二次PCR的模板。这些突变体被克隆到pENTR-D-TOPO中，然后通过网关克隆技术转移到pMXs-gw中。
p53抑制在MEF诱导iPS细胞生成中的作用
野生型，第53页+/-，或第53页-/-MEF也包含Nanog-GFP报告者，在1x10时播种5每孔6孔板的细胞数。第二天（第0天）使用由Plat-E制成的逆转录病毒进行逆转录病毒转导。第5天，通过细胞分选仪（FACS Aria、Beckton Dekinson）在每孔96个平板中的一个细胞或每100 mm-dish中的5000个细胞中重新筛选细胞。在四因素方案中，嘌呤霉素选择（1.5μg/ml）于第13天开始，在三因素方案中于第19天开始。在四因素方案的第21天和三因素方案的28天测定GFP阳性菌落的数量。除了靶向破坏外，MEF中的p53还被显性阴性突变P275S抑制。
p53抑制在HDF诱导iPS细胞生成中的作用
p53的功能在HDF中被显性阴性突变体（P275S或DD）或shRNAs（pMKO.1-puro；#8452，pMKO-1-puro p53 shRNA-1；#10671，或pMKO.1.puro p5 shRNA-2；来自Addgene的#10672）抑制。在PLAT-E细胞中产生显性阴性突变体的逆转录病毒shRNAs和四种重编程因子。对于iPS细胞的产生，我们在2×105转导前一天6孔板每孔细胞数。第二天，用等量的含有每种逆转录病毒的PLAT-E上清液转导HDF过夜，并补充4μg/ml聚布伦。
在带有显性阴性突变体的检测中，感染后6天，收获转导的HDF并以5×10的浓度重新种植三（具有四个重编程因子）或4×104（有三个因素）在丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞上每100毫米培养皿。第二天，用补充了4 ng/ml bFGF的灵长类ES细胞培养基（ReproCELL）替换培养基。培养基每隔一天更换一次。我们计算了转导后第30天（使用四个因子）或第40天（使用三个因子）的iPS细胞集落数。
在shRNA介导的敲除实验中，感染6天后，转导的细胞在5×104每100毫米培养皿中的细胞接种到丝裂霉素C处理的SNL喂料器上。第二天，我们开始用人类ES细胞培养条件培养细胞。转导后20天，我们计算iPS菌落的数量，分离它们，并用于功能分析。
从T细胞产生iPS细胞
脾脏来自第53页-将空白的Nanog-GFP雄性小鼠解剖、切碎并悬浮在含有10%热灭活胎牛血清（FBS，Thermo）的DMEM组成的T细胞培养基中。用小鼠CD90微球（Miltenyi biotec）分离T淋巴细胞并在1×106每孔RetroNectin的细胞数（50μg ml-1，Takara）涂层24孔板，置于补充Dynabeads CD3/CD28 T细胞扩张器的T细胞培养基中（10μl用于1×106细胞，Invitrogen）和10单位毫升-1白细胞介素-2（IL-2）。如前所述制备逆转录病毒。我们添加了8μg ml-1聚brene（Nacalai tesque）和10单位ml-1IL-2与含病毒上清液的结合。通过逆转录病毒转导和离心（3000 rpm，30分钟）引入四个重编程因子或DsRed，然后在37°C，5%CO中培养2孵化器。转导后24小时，更换培养基，然后每隔一天更换一半培养基。转导后两周，将细胞在5×104在ES培养基中，每100 mm培养皿中的细胞接种到丝裂霉素C处理的耐嘌呤霉素SNL喂料器上，该喂料器由DMEM（Nacalai tesque）加15%FBS、2 mm L-谷氨酰胺（Invitrogen）、1×10-4M非必需氨基酸（Invitrogen），1×10-4M 2-巯基乙醇（Invitrogen）和0.5%青霉素和链霉素（Invit罗gen）。第二天，用1.5μg ml开始选择-1嘌呤霉素5天。
的V-（D）-J DNA重排Tcrβ用引物Dβ2（GTAGGCACCTGTGGGGAAGAAACT）和Jβ2（TGAGAGCTCTACTATCATCGATT）进行PCR验证。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上分离。
p53靶基因的功能分析
PCR扩增p53靶基因的开放阅读框，亚克隆到pENTR-D-TOPO中。一些靶基因是从日本国立技术与评价研究所（NITE）获得的。使用网关克隆系统将这些cDNA转移到pMXs-gw中。我们转导了每个p53靶基因的逆转录病毒以及重编程因子，无论是否带有p53敲除结构。感染6天后，收集细胞并在5×104在丝裂霉素C处理的SNL饲养细胞上，每100毫米培养皿的细胞数。第二天，我们开始用人类ES细胞培养条件培养细胞。我们计算了转导后第24天（有四个因子）或第28天（有因子）iPS细胞集落的数量。
