抗氧化剂可以抑制聚谷氨酰胺病模型中的基础自噬并增强神经变性

巯基抗氧化剂会削弱雷帕霉素和海藻糖对自噬的上调作用

当自噬诱导由活性氧的增加介导时，活性氧清除剂可以抑制自噬的增加(12,14). 接下来，我们测试了抗氧化剂对自噬的损害是否仅限于自噬诱导剂也显著增加ROS的情况。我们测试了各种硫醇抗氧化剂的能力（包括那些用于治疗HD的抗氧化剂）(18)改善海藻糖（不增加ROS水平）对COS-7细胞自噬的诱导。我们发现了N个-乙酰半胱氨酸（NAC），胱胺[一种拟用于HD的药物，具有多效性作用，包括谷氨酰胺转胺酶抑制，但也代谢为抗氧化剂我-半胱氨酸(19)]谷胱甘肽均能显著改善海藻糖诱导的自噬，且呈剂量依赖性，如自噬标记物微管相关蛋白1轻链3 II（LC3-II）的水平所测（图2A–C）。LC3-II是LC3-I与磷脂酰乙醇胺结合后形成的，这是诱导自噬的一个重要步骤。LC3-II水平的降低可由自噬体形成减少或自噬-溶酶体融合增加引起。由于我们对自噬通量感兴趣，这些实验是在饱和剂量的巴非霉素A1（一种阻止自噬体/溶酶体融合的大环内酯类抗生素）存在下进行的(20). 因此，在这些条件下LC3-II水平的降低代表合成减少，而不是自噬体/溶酶体融合增加(21). 有趣的是，虽然海藻糖和胱胺的联合治疗没有导致LC3-II水平的改变（数据未显示），但用胱胺进行预处理确实损害了自噬的诱导，这与胱胺代谢为谷胱甘肽前体的要求一致我-半胱氨酸以影响自噬（图2B） ●●●●。请注意，虽然谷胱甘肽不能直接穿透细胞，但细胞外谷胱甘苷被γ-谷氨酰转移酶代谢，最终形成半胱氨酸，半胱氨酸很容易被吸收。

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图2。

抗氧化药物抑制基础和诱导的自噬。NAC、胱胺和谷胱甘肽都能抑制海藻糖诱导的自噬。用海藻糖处理COS-7细胞，并与指定浓度的NAC共同处理(一)，用胱胺（Cys）预处理24小时(B类)或与谷胱甘肽（Glu）共同处理(C类). 24小时后，在收获前的最后4小时内添加饱和剂量的巴非霉素A1。每个印迹下面的图表显示了LC3-II/肌动蛋白的密度分析，该分析来自于三个实验，分三次进行，控制条件（仅海藻糖）设置为100%。(D类)NAC损害雷帕霉素诱导的基础自噬。用25 m米NAC、雷帕霉素、雷帕霉素和NAC、海藻糖（Tre）或海藻糖和NAC处理24小时。所有条件在收获前用巴非霉素处理4小时。该图显示了密度分析，未将处理（对照）设置为100%。(E类)NAC对自噬的影响也见于神经元。分化的人类初级皮层神经元按指示进行治疗（NAC 10 m米)并在24小时后无需进一步处理（上面板）或在4小时后用巴非霉素A1处理（下面板）进行印迹。显示了三份实验的代表性数据。(F类)NAC的作用见于HeLa细胞。Hela细胞在对照条件下或用NAC（15 m）处理米)、海藻糖或海藻糖和NAC，24小时后进行蛋白质印迹分析。所有实验均在巴非霉素饱和剂量下进行，持续4小时。注意，HeLa细胞的LC3-1水平很低。(G公司)半胱氨酸能抑制基础自噬。用250µ米半胱胺48h，最后4h在bafilomycin存在下进行westernblot分析。所有面板中的误差条代表至少三个独立实验的SEM，一式三份(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).

硫醇抗氧化剂可削弱基础自噬

由于硫醇抗氧化剂似乎能够严重损害诱导的自噬，我们研究了它们是否能够损害mTOR抑制和基础自噬诱导的自吞噬。我们发现，与基础状态相比，NAC降低了与雷帕霉素治疗相关的LC3-II的增加，也降低了LC3-II（图2D） ●●●●。我们证实了NAC对人类初级皮层神经元的基础和诱导自噬的影响，包括有和没有巴非霉素（图2E） 和HeLa细胞（图2F） ●●●●。用胱胺预处理对基础自噬有类似的影响（图2G） ●●●●。接下来，我们进行了第二次自噬实验来证实我们的发现。我们使用了一个组成性表达LC3的HeLa细胞系，该细胞系标记了绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）。由于这两个荧光团在自噬体上的pKa不同，所以可以看到红色和绿色，但当自噬体与溶酶体融合时，绿色信号在低pH环境中被猝灭，只看到红色。因此，利用这项技术，可以区分和计数红点（自噬体和自噬小体）、绿点（自吞噬小体）和非绿色的红点（自噬小体）。第二个自噬测量结果与NAC通过抑制自噬体合成而非增强融合来损害基础和诱导自噬一致（图三A和B）。

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图3。

NAC在第二次实验中损害自噬体合成。(一)NAC显著降低自噬体和自噬多胞体的数量。如材料和方法中所述，表达RFP和GFP标记LC3-II的HeLa细胞按如下所示进行处理（NAC 10 m米)，然后进行固定并进行红点和绿点的自动计数。显示了典型的共焦显微镜图像。(B类)自动细胞计数结果。左侧面板显示相对于对照的绿点（自噬体）的数量，右侧面板显示红色减去绿色点（自噬多体）的数量。所示图表代表了一式三份的五次实验的平均结果。误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。

NAC抑制疾病相关蛋白的清除

由于高剂量NAC损害自噬，我们测试了它是否也损害了神经细胞模型中疾病相关自噬底物的清除。我们发现NAC能够破坏自噬底物血凝素（HA）标记的突变体A53Tα-突触核蛋白的清除，这是一种导致家族性PD的可溶性蛋白(22). NAC还显著削弱了雷帕霉素增强这种底物清除能力的能力（图4A） ●●●●。同样，我们发现NAC增加了带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记突变体亨廷顿蛋白外显子1聚集物的细胞百分比，并削弱了海藻糖降低聚集物细胞百分比的能力，这是一种自噬依赖性现象(8)（图4B和C）。

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图4。

NAC损害自噬底物的清除。(一)HA标记的A53Tα-突触核蛋白的表达[一种在这些细胞中不形成可见聚集物的蛋白的突变形式(22)]在转基因表达被关闭前，诱导48小时。在关闭期间，细胞按如下所示处理（NAC 10 m米，Rap，雷帕霉素），收获前24小时，并通过western blotting进行分析。该图显示了密度分析，NAC结果设置为100%。(B类)NAC增加突变体亨廷顿蛋白的聚集。诱导8小时表达EGFP标记的亨廷顿蛋白外显子1和扩增的（74Q）聚谷氨酰胺重复序列(47). 然后关闭转基因，并对细胞进行如下处理（NAC 10 m米)固定和计数前72小时。该图显示了代表性实验中每个条件下具有聚集的单元格的百分比，误差条表示标准偏差。对于所有其他面板，误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。

抗氧化药物对自噬的抑制并不局限于硫醇抗氧化剂

为了测试抗氧化剂对自噬的抑制是否具有硫醇特异性，我们测试了非硫醇抗氧化剂维生素E（DL-α-生育酚）。维生素E被提议用于治疗神经退行性疾病，并已用于PD和HD的主要试验(23,24). 我们发现维生素E同样能够损害海藻糖诱导的COS-7细胞、小鼠初级皮层神经元和HeLa细胞中LC3-II的基础水平（图5A–D）。与NAC一样，它能够强烈抑制A53Tα-突触核蛋白的降解，并防止该底物在雷帕霉素存在下的强化降解（图5E） ●●●●。

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图5。

维生素E和SOD的过度表达也可以抑制自噬。(一)维生素E可以抑制海藻糖诱导的自噬。用海藻糖和增加剂量的维生素E（DL-α-生育酚，VitE）处理COS-7细胞24小时，然后用巴非霉素处理4小时，处理方式与图中所示的实验类似2A–C。密度分析显示了三次实验的误差条和统计数据，如图所示2A–C。(B类)维生素E可以抑制基础自噬。用250µ米以与图相似的方式通过蛋白质印迹分析之前的维生素E2G.公司(C类)维生素E对自噬的影响也见于原代神经元培养。按照指示，在最后4小时内添加巴非霉素处理分化的小鼠初级皮层神经元(D类)维生素E对HeLa细胞的基础自噬和诱导自噬有类似的作用。在对照条件下或使用维生素E（250µ米)、海藻糖或海藻糖和维生素E，24 h后进行western blot分析。所有实验都是在巴非霉素饱和剂量下进行的，持续4小时(E类)维生素E可以抑制与神经退行性疾病相关的自噬底物的清除。在对细胞进行如图所示的处理（维生素E，250µ米)收获前24小时，用western印迹法进行分析。该图显示了密度分析，控制结果设置为100%。(F类)用人SOD1转染COS-7细胞，并允许其表达48 h，最后用巴非霉素表达4 h。显示了一个具有代表性的western blot。该图显示了在pcDNA（对照）设置为100%的情况下，对五个独立实验进行的三次密度分析。误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，不显著）。

由于化学抗氧化剂通常具有多效性效应（因此可能通过除减少氧化应激外的其他机制影响自噬活性），我们研究了基因上调抗氧化应激防御机制对自噬的影响。以前，清除超氧化物的超氧化物歧化酶基因（SOD2）的过表达被证明可以抑制与活性氧增加相关的诱导自噬(25). SOD2定位于线粒体基质，而SOD1主要是细胞溶质，线粒体膜间隙中有较小部分。为了测试SOD1过表达是否也能抑制自噬，我们暂时过表达SOD1，并观察了巴非霉素对LC3-II水平的影响。正如预期的那样，SOD1的过度表达降低了LC3-II的基础水平（图5F） ●●●●。

抗氧化剂影响调节自噬的多种典型机制

为了研究抗氧化剂可能影响自噬的潜在机制，我们通过观察mTOR激酶底物4E结合蛋白1（4E-BP1）和依赖于mTOR底物激酶活性的蛋白的磷酸化状态的变化，检测了抗氧化剂对mTOR通路的影响，mTOR是一种经典的自噬负调控因子，核糖体蛋白S6（S6）。维生素E增强了mTOR的活性，但令人惊讶的是，NAC似乎正在抑制mTOR活性，这种作用预计会增加而不是减少自噬（图6A和B）。因此，虽然维生素E以与自噬抑制相一致的方式影响mTOR途径，但NAC并非如此。

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图6。

抗氧化剂影响调节自噬的不同典型机制。(一)维生素E增加mTOR底物的磷酸化。用250µ米采收前24小时服用维生素E、雷帕霉素或雷帕霉素和维生素E。在两种凝胶上同时运行裂解液，并探测mTOR底物和负载控制。4E-BP-1（一种mTOR底物）具有多个磷酸化位点，并作为四条带运行，上部带代表主要的磷酸化形式。与对照组相比，维生素E增加磷酸化，并削弱雷帕霉素抑制4E-BP1磷酸化的能力。使用第二种底物核糖体蛋白S6证实了这些结果。T4E-BP表示总4E-BP、P4E-BP磷酸化4EBP、TS6总S6和PS6磷酸化S6。Dk-exp表示暗曝光，Lt-exp表示光曝光。(B类)NAC降低mTOR底物的磷酸化。该实验以与（a）类似的方式进行，但使用25 m米NAC代替维生素E。显示了典型的蛋白质斑点。(C类)硫醇抗氧化剂降低JNK磷酸化。COS-7细胞用25 m米NAC或谷胱甘肽和使用FACE ELISA试剂盒测量的JNK磷酸化。该图显示了磷酸化（PJNK）/总JNK（TJNK。(D类)硫醇抗氧化剂降低Bcl-2磷酸化。如图所示，将COS-7细胞处理24小时，并在剥离和重制总Bcl-2（TBcl-2）之前进行磷酸化Bcl-2的印迹。该图表示密度分析。(E类)维生素E对Bcl-2磷酸化没有影响。用维生素E或二甲基亚砜对照物处理COS-7细胞24小时，并通过western blot分析磷酸化Bcl-2和Beclin 1的水平。未发现显著差异。(F类)超氧化物生成剂甲萘醌增加LC3-II和JNK和Bcl-2的磷酸化，但对mTOR底物或Beclin-1的表达没有影响。用100µ米采收前1小时服用甲萘醌，并通过western blot分析LC3-II、磷酸化Bcl-2和总Bcl-2。图表显示了控制设置为100%时的密度分析。甲萘醌和维生素E对JNK磷酸化的影响以类似于（C）的方式进行分析。所有面板代表三个独立的三次重复实验的结果，误差条代表SEM(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，无显著性）。

饥饿诱导的自噬与活性氧水平的增加有关，并已证明由c-Jun N末端蛋白激酶1（JNK1）的激活介导，后者反过来磷酸化Bcl-2并使其与Beclin 1分离(26). NAC能够抑制饥饿细胞中ROS的积累和自噬(12). 鉴于此，以及NAC对mTOR的意外影响，我们接下来测试了硫醇抗氧化剂对JNK活化的影响。NAC和谷胱甘肽抑制JNK的激活并降低Bcl-2的磷酸化（图6C和D）。先前的研究表明，过氧化氢形式的氧化应激可以增加Beclin-1的表达，从而诱导自噬(27). 我们没有发现硫醇抗氧化剂或维生素E对Beclin-1水平有任何显著影响（图6D和E）。

超氧化物最近被描述为一种特殊的活性氧调节自噬，但其确切机制尚不清楚(25). 我们发现，超氧物生成剂甲萘醌在短至45分钟的时间点显著增加了LC3-II的水平（尽管，由于超氧物很快转化为过氧化氢，因此该过程中涉及的实际ROS尚不清楚）（图6F） ●●●●。甲萘醌通过增强JNK和Bcl-2磷酸化而具有与硫醇抗氧化剂相反的作用，但对mTOR活性或Beclin-1表达没有影响（图6F） ●●●●。总之，这些结果表明维生素E增强了mTOR的活性，这一作用与自噬抑制作用一致。硫醇ROS清除剂（如NAC）抑制mTOR（预计会诱导自噬），但降低JNK和Bcl-2的磷酸化，这将抑制自噬，而超氧化物生成剂甲萘醌增加LC3-II水平和JNK及Bcl-2磷酸化。

巯基抗氧化剂和超氧化物歧化酶的过度表达加剧了果蝇属聚谷氨酰胺病模型

为了研究我们发现的潜在病理生理学意义，我们使用了果蝇属表达亨廷顿蛋白外显子1的HD模型，眼部多聚谷氨酰胺束（Q120）扩张(28). 每只眼睛由许多小眼组成，而小眼又由八个杆状体组成，其中七个是可见的。通过计算每个小眼的横纹肌炎数量来衡量疾病表型的严重程度。变性越严重，可见的横纹肌炎就越少。我们用增加剂量的NAC治疗这些苍蝇，发现低剂量NAC没有显著效果，而高剂量则加剧了神经退行性表型（图7A） ●●●●。我们使用的NAC剂量本身不会加剧HD果蝇的表型，并单独和联合使用自噬增强剂雷帕霉素进行测试。我们发现NAC和胱胺都显著削弱了雷帕霉素拯救HD表型的能力（图7B） ●●●●。请注意，雷帕霉素已被证明以自噬依赖的方式抑制苍蝇中的聚谷氨酰胺毒性(29). 虽然雷帕霉素可能抑制了胱胺的解救作用，而不是相反，但胱胺抑制自噬诱导的想法与我们的细胞生物学研究结果一致。此外，NAC能够改善雷帕霉素的治疗效果，但其本身没有表现出明显的疗效，这表明硫醇抗氧化剂能够抑制雷帕霉素治疗效果。

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图7。

硫醇抗氧化剂和SOD的过度表达可以增强果蝇属聚谷氨酰胺病模型。(一)高剂量NAC加剧了突变的亨廷顿蛋白表型。在眼睛中表达突变型Q120亨廷顿蛋白外显子-1的苍蝇在接受高剂量NAC（5–10 mg/ml）治疗时，表现出神经退化增加，而在Q23对照苍蝇中未发现这种现象。(B类)当雷帕霉素与NAC或胱胺联合使用时，用雷帕霉素对Q120苍蝇的救援被取消。当用100µ米胱胺或2µ米雷帕霉素。当Q120苍蝇用500 mg/ml NAC或100µ米胱胺与2µ米雷帕霉素(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，NS，无显著性）。(C类)SOD过度表达会加剧神经变性。在眼睛中表达裸聚谷氨酰胺束（Q48）的雄性苍蝇与过表达SOD1或SOD2的苍蝇杂交时，其神经退化程度显著增加，而过表达SOD2或SOD1的对照苍蝇则没有这种影响。

为了更具体地研究氧化应激的作用，我们使用了第二只苍蝇的神经变性模型，该模型表达裸扩张（Q48）聚谷氨酰胺拉伸，导致眼睛表型清晰可见。我们用w¹¹⁸同基因雄性作为对照(30–33). 我们发现SOD1或SOD2的过度表达对对照果蝇的眼睛没有明显影响，但显著增强了Q48果蝇的神经退化表型（图7C） ●●●●。

NAC和维生素E可抑制斑马鱼的自噬通量，并增加斑马鱼多聚谷氨酰胺病模型中突变体亨廷顿蛋白的聚集

此前对斑马鱼幼体的研究表明，LC3-I到LC3-II的转化发生在受精后32小时，LC3-II水平的变化可以在溶酶体蛋白酶抑制剂的存在下进行测量(34). 与此一致，我们观察到用氯化铵处理过的斑马鱼幼体LC3-II水平随浓度增加而增加，在100 m米氯化铵使LC3-II水平可靠且显著增加（图8A） ●●●●。氯化铵阻断自噬体/溶酶体融合(35)因此，这项分析使我们能够调查体内自噬流量的变化（与LC3-II稳态水平的变化相反）与细胞培养中使用巴非霉素治疗的方式大致相同。

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图8。

在亨廷顿病斑马鱼模型中，NAC和维生素E可以抑制自噬流量并增加聚集。(一)氯化铵导致斑马鱼幼虫中LC3-II水平显著升高，这与阻断自噬体/溶酶体融合的能力一致。(B类和C类)在斑马鱼中，与NAC或维生素E联合治疗可显著降低氯化铵存在时的LC3-II水平，这与斑马鱼降低自噬流量的能力一致。面板显示LC3-II与微管蛋白负荷控制的蛋白质斑点。这些图表代表了三个独立实验的密度分析。(D类和E类)NAC和维生素E增加EGFP突变体亨廷顿蛋白在转基因斑马鱼视网膜中的聚集，而自噬诱导药物雷帕霉素和可乐定则减少其聚集。（D） 显示了与对照组相比，每种情况下每个视网膜的平均聚集数量。从视网膜上拍摄的代表性图像如（E）所示，亨廷顿蛋白聚集体用箭头表示。（A，对照条件；B，NAC治疗；C，维生素E；D，雷帕霉素治疗；E，雷帕霉素和NAC；F，可乐定治疗；G，可乐平和NAC）。请注意，雷帕霉素或可乐定的抢救作用因与NAC联合治疗而被取消(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，NS，无显著性）。

我们发现，与单独的氯化铵相比，与NAC或维生素E和氯化铵联合处理导致LC3-II水平显著降低，表明这些化合物能够抑制自噬通量（图8B和C）。我们通过处理转基因EGFP-HDQ71斑马鱼并计算视网膜中的亨廷顿蛋白聚集体来测试这种效应的病理相关性。我们发现，与对照组相比，NAC和维生素E显著增加了突变亨廷顿蛋白聚集体的数量（图8D和E）。正如预测的那样，用自噬诱导剂雷帕霉素和可乐定治疗可显著降低亨廷顿蛋白聚集，但当用这些化合物与NAC联合治疗时，这种作用消失了（图8D和E）。据我们所知，这是首次证明了聚谷氨酰胺病脊椎动物模型中自噬通量和自噬底物聚集的变化。

细胞培养

COS-7（非洲绿猴肾细胞）和HeLa（来源于人宫颈癌）在添加10%胎牛血清、100 U/ml链霉素/青霉素和2 m米 我-谷氨酰胺。它们保持在37°C和5%CO₂细胞接种在六孔板中（带有盖玻片用于计数实验），密度为60-80%，收集裂解物进行western印迹。计数实验在转染前以更高的密度接种以允许80%的融合。将稳定的可诱导A53Tα-突触核蛋白和HD外显子1 Q74 PC12细胞培养在补充有10%马血清、5%胎牛血清、2 mm升-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/链霉素、50µg/ml G418和70µg/ml Hygromycin B。将它们保存在37°C和10%CO下₂用1µg/ml的多西环素处理48小时（α-突触核蛋白）或8小时（HD外显子1）诱导表达，然后清洗去除多西环碱，从而关闭诱导的转基因表达。ReNcell CX细胞是一种永生化的人类神经元祖细胞系，具有容易分化为皮层神经元的能力，根据制造商的说明（Chemicon，Millpore，MA，USA）进行培养。细胞在添加20 ng/ml bFGF和20 ng/ml EGF的ReNcell NSC维持培养基中生长。细胞接种在层粘连蛋白涂层板上，在实验开始前用不含生长因子的培养基诱导分化1周。如前所述制备小鼠原代皮层神经元培养物(43). 简单地说，从15至16天龄的C57BL/6小鼠胚胎中解剖皮层，并在PBS（Ca²⁺-和镁²⁺-免费）补充葡萄糖（33米米). 将神经元置于涂有20µg/ml聚-D-赖氨酸的多孔板中，并保存在DMEM中，补充有B-27（Gibco），2 m米37°C和5%CO条件下的谷氨酰胺、100µg/ml链霉素和60µg/ml青霉素₂。培养物在6-7天后使用在体外（DIV）当大多数细胞为神经元且没有可检测到的胶质细胞时。

试剂

在以下浓度下使用自噬调节剂。雷帕霉素（LC实验室）200 n米，巴非霉素A1 400 n米，海藻糖，100米米，甲萘醌100µ米雷帕霉素溶解在二甲基亚砜中，雷帕霉素对照品用等量的二甲基亚磺酸处理。甲萘醌溶于乙醇中，甲萘酮对照品用等量的乙醇处理。

ROS的测量

HeLa细胞接种在24孔板中，放置过夜。用30µ米DCFDA或羧基-H₂DCFDA持续10分钟，5µ米MitoSOX™红10分钟或15µ米二氢罗丹明123（全分子探针，Invitrogen）30分钟，然后清洗两次并放在富媒体或含有相关处理的媒体中。一毫摩尔过氧化氢（H₂O（运行）₂)（Fisher Scientific）和100µM甲萘醌以及HBSS中的饥饿被用作阳性对照。然后使用CytoFluor系列4000多孔板阅读器（PerSeptive Biosystems）测量荧光。在读数之间，将培养皿放回培养箱。在激发485、发射530和MitoSOX™红530/620时测量DCFDA和二氢罗丹明。

JNK磷酸化测定

使用比色快速激活的基于细胞的酶联免疫吸附测定（FACE ELISA）试剂盒（Active Motif）测量JNK磷酸化。将COS-7细胞接种在96 well板中，放置一夜，然后处理24 h。然后按照制造商的说明，用磷酸化或总JNK抗体对其进行固定、封闭和探测。使用OPTImax微孔板阅读器在450 nm处测量吸光度。

蛋白质印迹分析

在分析之前，用PBS洗涤细胞。然后在放射免疫沉淀分析缓冲液[150m]中裂解细胞米氯化钠、1%NP40、0.5%NaDoC、0.1%十二烷基硫酸钠、50 m米Tris，蛋白酶抑制剂（罗氏诊断）]。然后进行生物负载蛋白分析，以允许等量负载。将裂解产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（12%），并将蛋白质转移到PVDF。用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或抗兔IgG在1:2000下探测印迹。使用ECL™检测试剂（Amersham）观察带状物。使用Image J软件进行密度测定，并使用因子方差分析（ANOVA）进行统计分析，使用STATVIEW v4.53（Abacus Concepts），其中控制值设置为100%。密度测定法表示至少三次重复或三次试验的平均值。

聚合的量化

如前所述，通过荧光显微镜对聚集物进行可视化和计数(17). 细胞用PBS清洗一次，然后在PBS中的4%多聚甲醛中固定20分钟。细胞在PBS内再次清洗，然后安装在含有3µg/ml 4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的防褪色试剂中，以便于核染色。每个盖玻片上有500个EGFP阳性细胞，由一名对玻片的身份视而不见的观察者进行计数。计数实验的结果用SPSS 6.1（SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行无条件logistic回归分析。使用尼康ACT-1采集软件（尼康公司）将尼康Eclipse E600显微镜连接到尼康DXM1200数码相机上，获取图像。

自动细胞计数

将表达RFP/GFP标记LC3的HeLa细胞接种在盖玻片上，并在适当的培养基中处理过夜。然后在PBS中清洗，用4%多聚甲醛固定，并用DAPI（Invitrogen）将其安装在Prolong Gold防褪色试剂中。使用Cellomics ArrayScan V统计每个细胞的红点和绿点数量^技术信息使用斑点探测器V3纤维素生物应用。每个盖玻片计数1000个细胞，每个实验至少重复四次。

果蝇属实验

如前所述进行假瞳孔分析(44)基因型的杂交处女y w；P、 2.4款（Q120）带w个¹¹¹⁸等基因雄性。上述杂交后代用含有500 mg/ml NAC、100µ米胱胺或2µ米雷帕霉素。通过添加500 mg/ml NAC或100µ米胱胺至2µ米雷帕霉素。用含有0.02%二甲基亚砜的即食苍蝇食品喂养在没有药物的情况下生长的对照苍蝇。苍蝇在幼虫和成虫期都用药物治疗。为了评估不同处理对Q120苍蝇的影响，t吨-对四个独立的实验进行了测试分析，每个实验包括羽化后3天从10个个体中的每一个个体中计数15个小眼。Q23控制苍蝇（Q23，P｛GMR-HD.Q23)用于比较增加NAC剂量对眼部表型的影响。研究超氧化物歧化酶（SOD）对表达扩大聚谷氨酰胺拉伸的苍蝇的影响（P｛UAS-Q48.myc/flag｝31（30），基因型的处女w；GMR-GAL4；无人机。Q48myc/标志（Q48）与SOD转基因雄性杂交P（P）{UAS-Sod2.M}UM83(31)，或P（P）{UAS-Sod.A}B36(32)或使用w个¹¹¹⁸同基因雄性作为对照。眼睛中SOD的过度表达不会影响眼睛的表型。雄性苍蝇表达SOD1（UAS-Sod.A，w；GMR-Gal4/UAS-草皮。一)或SOD2（UAS-SOD2，w；GMR-Gal4/UAS-Sod2.M)与对照苍蝇（GMR-Gal4，P（P）{GAL4-ninaE.GMR}12)研究SOD过表达对无polyQ结构的影响。在25°C下进行苍蝇杂交和实验。在相同的时间和条件下进行所有单独实验的杂交。

斑马鱼实验

我们感谢J.Lawrence Marsh（加利福尼亚大学，加利福尼亚州欧文分校，美国）、G.R.Jackson（加州大学洛杉矶分校医学院，美国）和Bloomington果蝇属库存中心果蝇属股票和克里斯·米勒教授（伦敦国王学院精神病学研究所）为SOD1构建。我们感谢Adrian McNabb、Gay Chalklin、Cheryl Kennerson和Tomasz Dyl的技术支持。我们还要感谢波琳·兰索斯小姐在飞行得分方面的帮助，感谢J.戴维斯博士、F.孟席斯博士和B.Ravikumar博士对手稿的有益评论。

利益冲突声明。未声明。