实验室投资。作者手稿；PMC 2011年2月1日提供。
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肝星状细胞参与祖细胞介导的肝再生
美国佛罗里达州盖恩斯维尔佛罗里达大学医学院病理学、免疫学和实验医学系及干细胞生物学和再生医学项目
摘要
我们实验室以前的研究表明，伊洛前列素抑制转化生长因子β（TGFβ）介导的结缔组织生长因子（CTGF）上调导致大鼠卵圆形细胞对2-乙酰氨基芴/部分肝切除术（2AAF/PH）的反应大大减弱。我们假设这种作用是由于肝星状细胞的活化减少所致。为了验证这一假设，我们在大鼠的饮食中添加2%的L-半胱氨酸，以抑制卵圆细胞对2AAF/PH反应期间的星状细胞激活。体外实验表明，L-半胱氨酸确实阻止了星状细胞的激活，但对卵圆细胞没有直接影响。2AAF/PH动物肝脏切片的Desmin免疫染色表明，维持L-半胱氨酸饮食导致门脉周围区活化星状细胞数量减少11.1倍。用L-半胱氨酸处理的动物肝门静脉周围区增殖的细胞总数显著减少。进一步的分析表明，通过OV6和甲胎蛋白（AFP）免疫染色测定，维持L-半胱氨酸饮食的动物的卵圆细胞反应幅度减少了四倍以上。在L-半胱氨酸处理的动物中，通过实时PCR检测到的AFP的全球肝脏表达降低了4.7倍。这些数据表明，激活肝星状细胞是对2AAF/PH产生适当卵圆细胞反应的必要条件。
关键词：肝星状细胞，L-半胱氨酸，肝再生，卵圆细胞激活，肝祖细胞
对于导致肝实质大量丢失的肝脏病变，前体细胞治疗是肝移植的一种替代方法。“卵圆细胞”是兼性肝祖细胞，当成熟肝细胞的增殖能力受到损害时，它有助于肝再生。这些细胞是双能细胞（即能够沿肝细胞和胆道谱系分化），被认为位于Hering管的肝门区内1许多人类疾病与卵圆细胞增殖有关；其中包括嗜肝病毒感染和肝硬化末期2我们实验室以前的数据表明，在再生过程中，各种肝细胞类型之间，尤其是肝星状细胞和卵圆细胞之间，存在协调的相互作用三在2-乙酰氨基芴/部分肝切除术（2AAF/PH）模型以及其他几个肝脏重塑过程中，包括肝纤维化，已经证明了它们的共同激活4肝部分切除术（PH）或D-氨基半乳糖暴露后的肝脏再生5在生理条件下，星状细胞处于静止状态，显示出维生素A滴和星形形态。其激活后会增殖并分化为可收缩的肌纤维母细胞样细胞。活化的星状细胞对细胞外基质（ECM）的合成和重塑有贡献，是细胞因子和生长因子的重要来源，也是肝硬化过度纤维化的原因6前列环素类似物伊洛前列素对TGFβ-CTGF信号轴的干扰导致卵圆细胞增殖显著降低三由于TGFβ对各种细胞类型具有如此复杂的作用范围，我们进一步探讨了这些作用是星状细胞抑制的结果，还是可归因于再生肝脏内的其他相互作用。半胱氨酸是一种非必需氨基酸，广泛用作营养补充剂、抗氧化剂和粘蛋白溶解剂。最近的数据表明，它也可能是一种有效的肝纤维化抑制剂，可防止星状细胞活化7其对肝脏的复杂影响归因于多种机制，包括：谷胱甘肽的合成8,9; 活性氧（ROS）介导细胞周期蛋白D1的降解，随后锰超氧化物歧化酶（MnSOD）被激活10; 血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）的下调和血小板衍生生长因素（PDGF）信号的抑制11,12尽管其作用机制多种多样，但它被广泛认为是一种有效、无害的肝星状细胞抑制剂，并被提议作为人类肝硬化的辅助治疗。为了验证我们的假设，即星状细胞在促进卵圆细胞增殖中起着必要的作用，补充L-半胱氨酸的饮食与特征鲜明的2AAF/PH方案相结合13,14用于大鼠卵圆细胞激活。这项研究清楚地表明，激活肝星状细胞是对2AAF/PH产生强大卵圆细胞反应的必要条件。
材料和方法
动物治疗
本研究中涉及的动物程序得到佛罗里达大学IACUC的批准。根据Horie制定的方案，在实验期间，将6周大的Fisher 344只雄性大鼠（马萨诸塞州威尔明顿Charles River Laboratories）饲养在补充了2%L-半胱氨酸的标准实验室食物中（Dyets Inc.，Betlehem PA）等7开始饮食一个月后，将70 mg 2AAF粒剂（美国创新研究公司，佛罗里达州萨拉索塔）腹腔内植入，一周后，按照希金斯和安德森的描述进行70%的部分肝切除术15。在表中规定的时间点处死动物.组织样品通过甲醛固定或OCT复合物冷冻收集和保存（Sakura Finetek USA Inc，Torrance CA）。
研究设计——肝星状细胞抑制和卵圆细胞诱导模型的图解♂ Fisher 344大鼠：2%L-半胱氨酸饮食、2-AAF颗粒植入、部分肝切除和选择的牺牲时间点（月、周、日）。
细胞培养和BrdU标记
WB-F344卵圆细胞（由William Coleman博士善意提供）在37°C、5%CO下培养2在RPMI-1640培养基（Mediatech Inc.，Herndon VA）中添加10%FBS（Sigma-Aldrich，St.Louis MO）和1%青霉素-链霉素（Mediaech Inc.，赫恩登VA）。原代分离的门静脉成纤维细胞和HSC T6肝星状细胞（分别来自Rebecca Wells博士和Scott Friedman博士）在相同条件下在DMEM（Hyclone Lab Inc.，Logan UT）中用10%FBS和1%青霉素-链霉素培养。当达到30%的融合率时，将它们与0.4μg/ml的去甲半胱氨酸（西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯密苏里州）同步24小时，并用100μM的L-半胱氨酸处理（MP Biomedicals LLC，克利夫兰俄亥俄州），从而抑制肝星状细胞的激活。在暴露于L-半胱氨酸三天后，用10μM溴脱氧尿苷（BrdU）（西格玛-奥德里奇，圣路易斯MO）处理室贝里内酯，并将其固定在4%多聚甲醛中。
组织学和免疫组织化学
用苏木精和伊红对石蜡包埋或冷冻切片进行染色，或使用抗OV6（Stewart Sell博士提供）、抗Ki67（BD Biosciences Pharmingen，新泽西州富兰克林湖）或抗α-脂肪蛋白（Dako Cytochromarin，Carpinia CA）抗体进行免疫染色。抗结蛋白抗体（Dako细胞染色质，Carpindia CA）也用于星状细胞免疫染色。使用抗BrdU抗体（Dako细胞染色质，Carpindia CA）对福尔马林固定腔内酯进行免疫染色。使用Aperio ScanScope图像分析平台（Aperio，Vista CA）和MetaMorph软件（MDS Technologies，Concord ON，Canada）对免疫染色切片进行计算机图像分析，以进行组织学评估和定量。
实时定量PCR
使用DNA Engine Opticon 2连续荧光检测器（MJ Research Inc Waltham MA），通过两步定量实时PCR反应评估mRNA水平。使用RNA蜂分离试剂盒（Tell-Test Inc.Friendswood TX）提取总RNA，用DNase I（Ambion，Austin TX）处理，并用Superscript III第一链合成系统逆转录RT-PCR（Invitrogen，Carlsbad CA）。使用iQ SYBR Green Supermix（加州Hercules Bio-Rad实验室）在定制的RT2Profiler PCR阵列板上对感兴趣的基因（SA Biosciences，Frederick MD）进行扩增。使用的引物对是：正向CAGGAGGAAAAGGACAAAAAA和反向ATTCCTAAGCATAGAAATCCCA。放大条件为95°C下10分钟，然后在95°C条件下40次循环，每次15秒，55°C下30秒，72°C下30s。使用比较Ct阈值循环法评估表达水平，并将其归一化为β-actin m RNA表达。
统计分析
数值表示为平均+/-标准偏差（SD）。统计学意义通过方差分析确定，学生t检验在Microsoft Excel中进行。P值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
L-半胱氨酸似乎是选择性的在体外肝间充质细胞抑制因子
我们首先检查了在体外L-半胱氨酸对培养中几个肝细胞群的影响。通过BrdU掺入新合成的DNA鉴定S期细胞。为了排除L-半胱氨酸直接作用于卵圆细胞的可能性，对肝祖细胞系WB F344进行了有无培养(100μM L-半胱氨酸。正如预期的那样，L-半胱氨酸治疗对这些细胞的增殖率没有影响(). 接下来我们检查了原代门静脉成纤维细胞培养()以及肝星状细胞系HSC-T6(). 与祖细胞系相比，当培养基中添加100μM L-半胱氨酸时，两种间充质细胞培养物的增殖率均显著降低。HSC T6的BrdU掺入减少了3.56倍，门静脉成纤维细胞减少了5.6倍(). 综合来看，定量图像分析数据表明，L-半胱氨酸选择性地作用于所检查的间充质细胞群体().
体外L-半胱氨酸对选定肝细胞群增殖的影响：（A，D）WB F344细胞，（B，E）初级门静脉成纤维细胞，（C，F）HSC T6细胞。面板A-C未接受任何处理，而面板D-F在补充2%L-半胱氨酸的培养基中培养；均以x10倍放大显示。
BrdU指数：L-半胱氨酸对培养的间充质细胞和卵圆细胞增殖影响的定量分析：WB 344F-大鼠卵圆细胞系；PF——原代分离的门静脉成纤维细胞；HSC T6——肝星状细胞系；白柱-在培养基中用100μM L-半胱氨酸处理的细胞；黑柱–在不添加L-半胱氨酸的培养基上生长的细胞。
L-半胱氨酸饮食下卵圆细胞活化的组织学变化
大鼠卵圆细胞激活的2-AAF/PH模型中肝再生的组织学特征表明，来自门脉周围区的小细胞的预期强劲增殖(). 未经治疗的大鼠肝脏中不存在这些椭圆形小细胞(). 在维持2%L-半胱氨酸饮食的动物中，门静脉区的小细胞反应仍然相当温和(). 两组小细胞反应幅度的差异在肝部分切除术后第9天最为明显。已知该时间点与大鼠2AAF/PH激活方案后卵圆细胞增殖的峰值一致。除了L-半胱氨酸处理的动物中的小细胞减少外，细胞形态也有显著差异。在L-半胱氨酸处理组中，一些细胞趋向于较大（直径超过10μm），核质比略有降低，细胞核更圆，细胞质嗜碱性空泡，类似于小型肝细胞样细胞。
苏木精和伊红染色肝脏样本的比较组织学检查显示，喂食L-半胱氨酸的动物的肝再生情况存在差异：（A，D）正常动物，（B，E）2-AAF/PH治疗大鼠PH后9天，（C，F）L-半胱甘氨酸/2-AAF/PH方案急性肝损伤后9天。BD—胆管，PV—门静脉分支，HA—肝动脉分支，OC—卵圆细胞，SHL—小肝细胞样细胞。上面板以x20显示，下面板以x40放大显示。
在2AAF/PH模型中，L-半胱氨酸饮食抑制肝星状细胞活化
通过对结蛋白（一种细胞骨架中间丝，在大鼠肝脏中仅由活化的星状细胞表达）的免疫染色，可以在显微镜下的肝切片中明确识别活化的肝星状细胞16.
肝星状细胞在正常肝组织中数量很少(). 然而，在2AAF/PH模型中，它们在再生卵圆细胞附近增殖和迁移(). 在用L-半胱氨酸治疗的动物中，2AAF/PH后结蛋白阳性细胞明显减少(). 定量计算机图像分析显示，与食用标准饮食的2AAF/PH动物相比，食用L-半胱氨酸饮食的2AAF/PH大鼠的结蛋白阳性细胞数量减少了11倍以上(). 这些结果表明，L-半胱氨酸对肝星状细胞激活的抑制作用与我们的2AAF/PH卵圆细胞诱导模型中预期的作用相同。
体内L-半胱氨酸喂养大鼠肝脏切片的结蛋白免疫染色显示肝星状细胞群的活化降低：正常大鼠肝脏（A，D，N），2AAF/PH（B，E，9AP）后第9天的肝脏，接受L-半胱胱氨酸饮食/2AAF/PH（C，F，9DAP）的动物的同一时间点肝脏切片。BD—胆管，PV—门静脉支，HA—肝动脉支，SC—星状细胞。上面板以x20显示，下面板以x40放大显示。（G） 对免疫染色肝脏样品上结蛋白阳性区域的定量计算机图像分析证实，免疫染色切片上的星状细胞活化显著降低。
L-半胱氨酸暴露与门脉周围区域细胞增殖减少相关
接下来，我们试图确定2AAF/PH处理动物肝门静脉周围区细胞的增殖状态，包括有和无L-半胱氨酸饮食。在PH后第9天通过免疫染色Ki67核抗原来确定增殖。Ki67识别所有不在G中的细胞0在正常肝脏中，很少有肝细胞在没有损伤的情况下增殖(). 在接受2AAF/PH方案的大鼠肝脏的门静脉区出现大量增殖细胞(). 在维持L-半胱氨酸饮食的大鼠肝门静脉区，增殖细胞数量减少了三倍以上().
通过随机显微镜视野下Ki67阳性细胞核的定量分析评估肝细胞群的增殖状态：正常肝脏（A，N）和急性肝损伤后9天采集的样本；（B，9AP）大鼠接受2AAF/PH方案，（C，9DAP）大鼠在卵圆细胞激活治疗期间喂食L-半胱氨酸。均以放大倍数x20显示。
L-半胱氨酸暴露期间门脉周围区域细胞增殖减少与再生肝中结蛋白减少相关
对Ki67核抗原和III型中间丝结蛋白进行双重免疫荧光染色。结蛋白由活化的星状细胞特异表达，存在于正常肝脏的门脉肌成纤维细胞和伊藤细胞中(). 2AAF/PH暴露动物门脉周围的大量增殖细胞被结蛋白阳性细胞质投射物包围(). 从喂食L-半胱氨酸的动物身上采集的切片显示，再生肝腺泡I区的增殖细胞减少，伴有少量结蛋白阳性细胞().
Ki67和结蛋白免疫荧光染色分别反映了肝细胞增殖和卵圆细胞激活的同时减少：正常肝脏（A，D）；从接受2AAF/PH方案（B，E）的动物和维持L-半胱氨酸/2AAF/PH（C，F）的大鼠肝切除术后9天采集的切片。PV—门静脉分支，HA—肝动脉分支。上面板以x20显示，下面板以x40放大显示。
门脉周围区域的再生细胞为AFP和OV6阳性
为了确定2AAF/PH后第9天门区内的卵圆细胞群，石蜡切片染色以检测甲胎蛋白（AFP）。在正常肝脏切片上未发现AFP阳性细胞(). 正如预期的那样，2AAF/PH治疗动物的肝门区含有大量AFP阳性细胞(). 接触L-半胱氨酸的动物AFP阳性细胞减少了四倍以上(). 值得注意的是，在喂食L-半胱氨酸饮食的动物的肝门区内，更大比例的细胞似乎是过渡性肝细胞（即较大的肝细胞样细胞，AFP表达较弱）。
定量图像分析（G）表明AFP免疫染色肝切片上的卵圆细胞减少：正常肝脏（A、D、N）、PH后第9天2AAF/PH处理的大鼠（B、E、9AP）和PH（C、F、9DAP）后第9天保持2%L-半胱氨酸饮食的2AAF/PH-处理的大白鼠，OC-卵圆细胞，TC-移行肝细胞。上面板以x10显示，下面板以x20放大显示。
通过实时定量PCR测定2AAF/PH动物肝脏中AFP的整体表达(). AFP信息相对于正常肝脏进行测量，并归一化为β肌动蛋白。与喂食正常饮食的动物相比，接触L-半胱氨酸的动物的AFP总肝脏表达减少了4.7倍。这些结果表明卵圆细胞对肝质量恢复的贡献显著降低。
通过实时PCR分析AFP mRNA定量的卵圆细胞反应的大小，相对于正常肝组织表达，并标准化为β-肌动蛋白（A），9AP–喂食正常大鼠食物并接受2AAF/PH方案的动物；9DAP–与2AAF/PH治疗相关的L-半胱氨酸饮食的动物。GAPDH被用作负荷控制（B）。
使用另一种卵圆细胞标记物来确认AFP免疫染色的结果。OV6是卵圆细胞和胆管细胞的特征性标记物。在正常肝脏中，只有门脉三联体内的胆管OV6阳性(). 受2AAF/PH影响的动物的肝脏样本在门脉周围区含有大量OV6阳性细胞，这些细胞向中央静脉放射(). 这与2AAF/PH模型中PH后第9天的正常卵圆细胞反应一致。与此相反，在PH后第9天，用L-半胱氨酸饮食喂养的动物的肝脏切片显示出非常温和的卵圆细胞反应(). 扫描玻片的计算机图像分析证实，与服用L-半胱氨酸的动物相比，喂食正常大鼠食物的动物的卵圆细胞反应幅度相差3.5倍().
通过对正常肝脏（A，N）和急性肝损伤后9天处死的动物组织切片上OV6阳性区域的定量图像分析（D）评估卵巢细胞反应减少：（B，9AP）接受2-AAF/PHx方案，（C，9DAP）在卵巢细胞激活治疗期间喂入L-半胱氨酸。OC–卵圆细胞，BD–胆管。上面板以x20显示，下面板以x40放大显示。
讨论
前体细胞介导的肝再生是一种替代性代偿性增生，当肝细胞增殖受到大规模肝坏死或慢性肝硬化条件的严重损害时，能够恢复肝质量17卵圆形细胞和星状细胞是遵循2AAF/PH祖细胞激活协议进入细胞周期的首批细胞18关于再生肝脏中卵圆形细胞和星状细胞激活之间的确切时间关系，目前知之甚少。正是由于这个原因，我们选择在2AAF/PH方案开始之前很久就开始L-半胱氨酸饮食(). 在研究期间，对所有动物的每日食物摄入量和体重进行了监测，以确定饮食的任何潜在影响，喂食实验饮食和对照饮食的动物之间未发现显著差异。我们的在体外研究还表明，L-半胱氨酸并不直接控制卵圆细胞增殖；也不会引起他们表型的任何改变(). 综上所述，这些事实表明，在我们的模型中，L-半胱氨酸的作用是由于对肝星状细胞的特异性抑制所致。
肝细胞增殖抑制剂2-AAF被肝脏通过一系列羟基化和结合来激活和解毒19导致水溶性衍生物在肾脏排泄20,21作为谷胱甘肽合成的前体，有理由考虑L-半胱氨酸可能会提高2AAF解毒率。这可能导致2AAF/PH模型中肝细胞增殖的不完全抑制。然而，对L-半胱氨酸治疗组的Ki67染色肝切片的检查显示，没有成熟肝细胞增殖的迹象，唯一的Ki67阳性细胞是卵圆细胞和小肝细胞样表型(). 这似乎排除了2AAF代谢差异是这些研究中的一个复杂因素。用L-半胱氨酸维持的动物体内Ki67的减少与门脉周围间隙结蛋白的减少有关，表明肝星状细胞的活化减少。在这种情况下，门脉周围区域的增殖细胞数量也减少，这表明星状细胞的贡献减少与肝再生减少之间存在关联().
前体细胞介导的肝再生是一个复杂的过程，涉及细胞因子分泌的连续波和细胞外基质的重塑。这两个过程紧密耦合，因为基质在降解时可以释放化学信号，并集中化学信号22绑定到特定区域内的矩阵23,24因此，ECM在肝脏中起到生物活性分子的主要贮存器的作用18在肝再生过程中，在靠近卵圆细胞处发现肝星状细胞数量增加25活化的肝星状细胞是参与基质重塑和结合细胞因子释放的MMPs和TIMPS的主要来源18,26基质重塑导致建立独特的微环境，有利于再生区内细胞的增殖和迁移。这使得肝星状细胞的激活成为祖细胞介导的肝再生过程的关键组成部分。我们小组先前进行的研究表明，在祖细胞介导的肝脏再生过程中，富含纤连蛋白的临时基质在门区合成23我们认为，这种临时基质可能有助于卵圆细胞反应，作为卵圆细胞增殖所需的底物，并为调节卵圆细胞表型的信号分子提供结合位点。一个这样的例子是CTGF，它与富含纤维连接蛋白的门静脉周围区临时基质结合，在那里它被浓缩并提供给已知表达CTGF受体的卵圆细胞23.
最近发表的几项研究清楚地表明，肝脏中的星状细胞可能通过间充质细胞向上皮细胞过渡的过程，产生肝细胞27这种现象可能涉及具有椭圆细胞特性的中间细胞类型。在我们的模型中，不可能确定间充质细胞向上皮细胞转化的减少是否有助于卵圆细胞增殖的减少。然而，这种可能性值得一提。
L-半胱氨酸处理的肝脏的另一个有趣的特征是过渡或中间肝细胞的明显积聚()表现出再生过程的表型特征，没有饮食引起的任何改变。
这些细胞在形态学上与肝细胞相似，但体积较小，AFP表达较弱。在我们的模型中，我们推测这些细胞是未能完成分化程序的卵圆形细胞，但在这一阶段，由于缺乏可靠的标记物，因此无法对其进行精确鉴定。这表明，2AAF/PH后抑制星状细胞活化不仅影响卵圆细胞增殖，也影响卵圆上皮细胞分化。同样，这很可能是由于再生区内缺乏适当的微环境所致，并提倡星状细胞在再生过程中的“滋养作用”。虽然细胞反应似乎因星状细胞抑制而定量减弱，但我们尚未注意到卵圆细胞在再生过程中的任何表型改变。总的来说，喂食L-半胱氨酸饮食的动物的卵圆细胞反应迟钝可能是由于主要细胞因子来源（即活化的星状细胞）的丧失，以及卵圆细胞群扩张所需的适当微环境（即富含纤维连接蛋白的临时基质）的丧失。L-半胱氨酸治疗的最终结果是2AAF/PH后肝脏再生所需时间大致增加了一倍（数据未显示）。由于L-半胱氨酸治疗组的损伤最终会消失，因此可能存在调控卵圆细胞表型的冗余途径。然而，在通常被认为是卵圆细胞增殖最大的时候，卵圆细胞的显著减少首次证明了星状细胞在卵圆细胞介导的肝脏再生中的关键作用。
致谢
作者感谢宾夕法尼亚大学的Rebecca Wells博士、北卡罗来纳大学的William Coleman博士和西奈山医学院的Scott Friedman博士分别捐赠了原代分离的门静脉成纤维细胞、WB F344细胞和HSC T6细胞，并感谢Dr。来自奥德韦研究所的Stuart Sell慷慨提供了OV6抗体。
赠款支持DK58614；DK65096授予BEP
缩写
| 2AAF/PH（美国空军/菲律宾） | 2-乙酰氨基芴/部分肝切除术 |
| 发动机控制模块 | 细胞外基质 |
| TGF-b型 | 转化生长因子-b |
| CTGF公司 | 结缔组织生长因子 |
| 法新社 | 甲胎蛋白活性氧自由基 |
| 锰超氧化物歧化酶 | 锰超氧化物歧化酶 |
| PDGFR-b型 | 血小板衍生生长因子受体-β |
| PDGF公司 | 血小板衍生生长因子 |
| 溴化铀 | 溴脱氧尿苷 |
| MMPs公司 | 基质金属蛋白酶 |
| TIMP公司 | 金属蛋白酶组织特异性抑制剂 |
工具书类
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