雌激素对公猪精子获能的影响在体外

摘要

背景

获能包括精子在女性生殖道或在体外获得穿透卵子并使其受精的能力[1-三]. 电容是一个复杂的分子过程，导致钙浓度、蛋白质磷酸化、顶体基质和膜重排的变化。作为一个复杂的生物过程，获能受子宫和输卵管液中许多分子因素的影响[4]子宫和输卵管液体的作用取决于发情周期的特定阶段[5]. 虽然获能自然发生在女性生殖道，但也可以进行在体外使用特定介质和物理条件[6,7].

雌激素是一组类固醇化合物，因其在发情周期中的重要性而得名。虽然雌激素被认为主要是女性生殖激素，但它们在调节男性生殖功能方面也起着重要作用。这一领域的主要突破是由雌激素受体敲除小鼠带来的。典型的表现是，这些小鼠睾丸组织学、精子发生发生显著变化，并且患有不孕症[8].

在体细胞中，雌激素通过三种已知的雌激素受体（ERa、ERb和GPR30）发挥作用。ERa和ERb被称为经典雌激素受体。它们结合DNA中的特定基因座（雌激素反应元件），并作为转录因子。最近，有证据表明这些受体具有非基因组效应[9]这种效应可能对雌激素调节精子功能很重要，因为精子被认为是转录沉默的。在人类精子中发现了经典的雌激素受体，有证据表明它们与磷脂酰肌醇-3-OHKinase/Akt途径直接相互作用[10]. 这一观察很重要，因为精子膜上的一些受体被认为只起被动作用[11]. 最近在猪精子中发现了经典雌激素受体和芳香化酶和雄激素受体[12]. 除了经典受体外，雌激素还可以通过膜雌激素受体GPR30发挥作用。GPR30信号传导伴随着钙动员，因此，通过该受体的信号传导似乎是精子雌激素途径的一个很好的候选者。然而，到目前为止，还没有证据表明精子中存在这种受体。最后，有一些证据表明精子中存在假定的雌激素受体，这与经典的雌激素受体不同。针对这些假定受体的抗体阻断雌激素的刺激作用，但其功能尚待阐明[13].

尽管有几项研究报告了雌激素对成熟精子的影响，但在这一领域仍有一些相互矛盾的结果。20世纪70年代至80年代，有几篇论文涉及雌激素和孕酮对仓鼠和兔子精子获能的影响体内和在体外Gwatkin和Williams报道了富含孕酮和雌激素的卵泡液对兔精子获能的抑制作用在体外[14]. 布里格斯对仓鼠精子也获得了类似的结果[15]. 与此相反，Bathla等人报告称，在富含外源性雌激素的隔离子宫中孵化的精子数量显著增加[16]. 此外，哈姆纳和威尔逊得出结论，抗雌激素对兔精子获能过程没有影响[17]. 最近，有报道称雌激素和不同的外源雌激素对小鼠精子的获能、顶体反应和受精能力有刺激作用[18]. 此外，雌激素预孵育不会改变人类精子与卵母细胞融合的能力[19].

在本研究中，我们研究了三种天然雌激素，如雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）、雌三醇（E3）和一种合成雌激素（17α-乙炔雌二醇，EE2）对公猪精子获能和AR的影响在体外.

方法

CTC测定

金霉素（CTC）荧光分析如前所述[20,21]. 获能过程结束后，将精子悬浮液离心：取出获能培养基并冷藏以进行生化分析。将精子重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并与等量（45μl/45μl）的CTC溶液（750 mmol/l CTC溶于130 mmol/lNaCl、5 mmol/l半胱氨酸、20 mmol/lTris-HCl，pH 7.8）混合，并培养30分钟。然后用8μl 12.5%多聚甲醛将细胞固定在0.5 mol/l Tris-HCl（pH 7.4）中。孵化后，将精子悬浮液放在玻璃载玻片上，涂抹并用盖玻片覆盖。为了避免蒸发和CTC褪色，在进行评估之前，将载玻片保存在湿室中。样品用配备有40×Nikon Plan 40/0.65的Nikon Labothot-2荧光显微镜进行检查，并用COHU 4910 CCD相机（Inc.Electronics Division，San Diego，USA）和LUCIA成像软件（Laboratory imaging Ltd.，Prague，Czech Republic）拍摄。精子根据顶体染色模式进行分类：（A）整个精子头部和尾部阳性中段的明亮荧光——无容量、顶体完整的精子；（B） 显著的荧光阳性赤道段、尾部中段和顶体后区无荧光（暗）带-获能、顶体接触精子；（C） 整个精子头部的荧光信号较低，赤道段和中段顶体反应精子的荧光信号仍为阳性（图。​（图1）。1). 没有选择具有非特异性或中间荧光信号状态的精子进行后续分析。在每个样本中，对200个细胞进行评估，评估样本的最小数量为5个。

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图1

CTC顶体荧光图谱三种特定CTC顶体荧光模式的代表性图片。（A） 无容量、顶体完整的精子——整个精子头部和尾部正中间部分发出明亮的荧光；（B） 获能，顶体接触精子-显著的荧光阳性赤道段和尾部中段，顶体后区域无荧光（暗）带；（C） 顶体释放精子-整个精子头部的低荧光信号，赤道段和中段的信号仍为阳性。

抗顶体酶ACR.2单克隆抗体间接免疫荧光

ACR.2免疫荧光分析如前所述[22,23]. 获能过程结束后，对精子悬浮液进行离心；去除获能培养基，并保持在-20°C。将精子重新悬浮在等量的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，涂抹在玻片上，干燥并保持在4°C。在荧光标本制备过程中，精子载玻片用丙酮固定10分钟，用PBS冲洗，用ACR.2单克隆抗体处理，并在37°C的湿室中培养60分钟。在PBS中彻底清洗后，用FITC-结合的抗鼠IgG抗体（捷克共和国布拉格Sigma）处理涂片，并再次在37°C的湿室中培养60分钟。涂片在PBS和水中清洗后，用带有DAPI的Vectashield安装介质进行安装（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Lab.）。样品使用配备40×Nikon Plan 40/0.65的Nikon Labothot-2荧光显微镜进行检查，并使用COHU 4910 CCD相机（美国圣地亚哥电子公司）使用LUCIA成像软件（捷克共和国布拉格实验室成像有限公司）进行拍照。精子根据顶体染色模式进行分类。（A） 顶体区中度荧光——无容量、顶体完整的精子；（B） 顶体获能、顶体接触精子的强荧光；（C） 精子头部荧光信号低或无荧光信号，赤道段剩余阳性-顶体反应精子（图。​（图2）。2). 没有选择具有非特异性或中间顶体状态的精子进行后续分析。在每个样本中，对200个细胞进行评估，评估样本的最小数量为5个。

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图2

ACR.2顶体荧光模式（FITC-结合二级抗体）三种特定ACR.2顶体荧光模式的代表性图片。（A） 无容量、顶体完整的精子-顶体区域中度均匀荧光；（B） 有能力的顶体完整精子——顶体的荧光强度强；（C） 顶体反应精子-精子头部低或无荧光信号。细胞核用蓝色DAPI染料染色。

结果

ACR.2流式细胞术分析选定获能时间1μM E2对获能的影响

为了确定对照组和实验组获能过程中的潜在差异，在选定的获能时间用ACR.2抗体对精子样本进行流式细胞术分析。用浓度为1μM的E2对实验样品进行电容，用与实验样品中相同数量的乙醇对对照样品进行电容。根据之前的小鼠研究选择1μM浓度的E2[18]其中，它被定义为对精子获能有显著影响的最低浓度。在获能后0、10、30、60、120、180和240分钟以及诱导的顶体反应后收集精子。对照组和实验组之间的第一个显著差异是60分钟获能时FITC通道荧光强度的算术平均值（图。​（图3）。三). 最大的显著差异出现在获能120分钟时。在诱导顶体反应后，与对照组相比，实验组中接受AR的精子数量显著增加。

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图3

用流式细胞术和ACR.2抗体测量1μM E2暴露的样本A-D和对照样本的获能和AR进展差异。0、60、120、180、240分钟和诱导AR后FITC通道直方图的代表性图片。对照样品为黑色，实验样品为绿色。荧光强度的增加（右峰值）与获能过程相对应。通过t检验评估对照样品和实验样品在FITC通道中荧光强度算术平均值方面的差异*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。最显著的差异在120分钟时可以识别。

CTC荧光法和抗顶体酶ACR.2单克隆抗体分析1μM E2对获能的影响

在实验浓度为1μM E2和乙醇（对照）的情况下，在获能120分钟后收集8只动物的精子样本，并用CTC和ACR.2免疫荧光分析。在随后的统计分析中，只使用了高度相关的结果。E2对公猪精子的预电容效应几乎显著（p=0.059）（图。​（图4）。4). 为了评估个体动物获能过程和对E2的反应性的潜在差异，分别分析了每头公猪的样本。个体动物的获能过程和对雌激素的反应性存在显著差异（图。​（图5）。5). 在4个样本中，E2显著增加了获能精子的数量；在其他4个样品中，E2对获能过程没有显著影响。

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图4

受1μM E2影响的8只动物对照组和实验组获能精子数量的差异用1μM E2和乙醇（对照）对8只动物的精子样品进行容量测定。获能120分钟后收集精子，用CTC和ACR.2免疫荧光分析。通过Mann-Whitney U检验分析差异*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

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图5

个体动物获能过程和对雌激素（E2）反应的差异动物A-H。对照样品（A（C）-H（C）和用1μM E2（A（E2）-H。Whiskers表示±SE。通过Mann-Whitney U检验分析差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

ZP诱导AR与1μM雌激素孵育后精子数量差异分析

获能240分钟后分析精子样本，并用CTC、免疫细胞化学和ACR.2抗体ELISA诱导AR。采用顶体酶试验进一步评估雌激素对获能和顶体反应的影响。与实验组相比，所有实验样本中接受ZP诱导AR的精子数量显著增加（图。​（图6）。6). 免疫细胞化学数据通过ACR.2抗体ELISA和顶体酶试验进一步验证（图。​（图77).

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图6

用ACR.2抗体评估AR后精子数量在获能240分钟后，用1μM浓度的四种雌激素处理公猪A-D的对照和实验样品，以诱导AR。与实验组相比，所有实验样品中的精子数量显著增加，这些精子都经历了ZP钙诱导的AR。所有雌激素均显著增加了ZP-AR后的精子数量。通过KW-ANOVA分析差异；事后比较通过多重平均等级比较进行。晶须表示±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

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图7

用顶体酶法测定诱导AR后培养基中顶体酶的浓度，用ACR.2抗体ELISA免疫化学法测定240分钟后在体外获能过程中，用4种雌激素浓度为1μM的公猪A-D实验样品经猪卵透明带处理后诱导AR。通过ELISA、ACR.2抗体和顶体酶分析对获能培养基进行分析，生化测定AR后精子数；采用Newman-Keuls试验进行事后比较。晶须表示±SE。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

讨论

在这项研究中，我们解决了有关雌激素对公猪精子影响的几个问题在体外虽然之前的几项研究已经报道了雌激素在不同物种成熟精子中的作用，但在这一领域仍有一些相互矛盾的结果。因此，我们采用多种评估技术来综合分析雌激素对公猪精子的影响在体外在寻找哺乳动物精子中介导雌激素效应的具体机制时，从每种方法获得的结果可能是有用的。

第一个实验解决了强的天然雌激素（E2）在不同获能时间对公猪精子获能进程是否有显著影响的问题。精子获能受限在体外在1μM E2或乙醇（对照）存在下。我们发现1μM E2对公猪精子有促电容作用在体外此外，我们还证明了E2在不同孵育时间对获能的不同影响。对照组和实验组之间的第一个显著差异出现在60分钟时，最大反应出现在获能120分钟时。在180分钟后的获能阶段，对照组和实验组之间的差异不显著。雌激素对获能过程的时间依赖性效应是一项重要发现。在以前的出版物中，作者分析了30分钟后精子获能状态[18]，180-300分钟[16]和360分钟[14]这一事实可能是一些矛盾结果的重要来源。因此，应在仔细选择的获能时间分析雌激素对哺乳动物精子获能的影响，以反映单个物种正在进行的精子获能过程的状态。此外，分析雌激素对获能的时间依赖性效应可能有助于寻找与雌激素最显著效应（如钙内流、胆固醇外流、肌动蛋白聚合、蛋白磷酸化、顶体重排等）在时间上相关的特定分子过程[24].

在第二个实验中，我们想知道E2对从不同个体采集的精子样本是否有类似的影响。我们观察到不同个体动物在获能过程中对雌激素的反应存在很大差异在体外根据我们的结果，分析受试动物个体对雌激素的不同反应可能很重要，因为个体变异性强烈影响总体结果。此外，对雌激素高反应性和低反应性个体的详细分析可以阐明雌激素在精子中的作用机制。迄今为止，还没有可信的参数，例如与雌激素反应性相关的不同雌激素受体的表达[25].

在第三个实验中，我们测试了四种不同的雌激素对公猪精子获能过程的影响，结果显示，四种雌激素对公猪精子的获能过程影响很大，且无显著差异。对具有类似生理效应的多种化合物（E1、E2、E3、EE2）的效应进行分析，比仅基于一种化合物的分析提供了更可靠的数据。在雌激素反应强烈的动物中，雌激素以浓度依赖的方式刺激获能。E2在5nM浓度下具有显著作用；所有其他雌激素在100 nM浓度下都有显著作用。尽管与其他雌激素相反，E2在5 nM和10 nM浓度下有显著影响。在适当浓度水平下，个体雌激素之间没有显著差异。在对1μM E2无明显反应的公猪样本中，只有非常高浓度的雌激素刺激获能（10-100μM）。这表明雌激素具有一般的促电容效应，但在某些动物中，对雌激素的反应性很低，只有非常高浓度的雌激素才能激发促电容效应。雌激素反应的差异进一步表明，精子中雌激素的作用可能涉及多种机制。在高反应性样品中，雌激素（E2）在雌激素受体介导的细胞反应所需的浓度下具有显著作用[26,27]. 雌激素受体几乎饱和的高浓度雌激素仍会以浓度依赖的方式增加获能细胞的数量，这一事实表明，高浓度雌激素的作用可能由另一种非受体机制（膜变化等）介导[25]. 在对1μM E2无明显反应的样品中，雌激素在高浓度（10-100μM）下具有显著作用，而这远远不是体细胞中雌激素受体介导的细胞反应所需的浓度，这一事实进一步支持了这一观点。这一事实表明，在对1-10 nM E2无反应的样品中，负责低浓度雌激素反应的特定机制（例如受体信号化）不起作用。然而，高实验浓度的雌激素（10-100μM）远远低于雌激素的生理血浆水平（例如10μM）^-10-10^-11大鼠和小鼠中E2的M[28]). 然而，另一方面，卵泡液中雌激素的浓度更高[28]因此，精子在女性生殖道获能期间可能会暴露在高浓度下[29,30].

最后，在最后的实验中，我们证明了雌激素对ZP诱导的顶体反应的显著影响。所有实验组AR后的精子数量均显著高于对照组。通过显微镜评估诱导的顶体反应数据，并通过客观生化方法进行确认。因此，从ZP诱导的顶体反应中获得的结果不仅证实了获能实验，而且还表明雌激素对精子获能有实际的生理影响，因为该分析尤其基于获能的分子和细胞标记物（钙内流、顶体重排）。此外，客观生化方法（ELISA、顶体酶分析）的分析为主观显微镜评价方法提供了重要的支持数据。

总之，在这项研究中，我们解决了有关雌激素对公猪精子获能的影响的几个重要问题在体外.我们发现在野猪精子中在体外雌激素通常具有促电容作用。这种效果在很大程度上取决于获能进展的阶段、雌激素浓度和受试动物的个体反应性。个别雌激素具有相对相似的作用。这些观察结果对我们理解先前关于雌激素在精子中的作用的结果产生了重大影响，并有助于揭示雌激素在精子生理学中的具体作用机制。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

LD负责精子获能，通过所有描述的方法分析获能过程，并进行统计分析和手稿准备。PD负责制备特定浓度雌激素的培养基、精子获能、CTC分析精子获能状态和ACR.2抗体免疫细胞化学。AD负责精子获能和诱导AR后获能介质的分析。JP和KH负责研究的构思、实验的协调、手稿的修订和最终批准。所有作者阅读并批准了最终手稿。

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