低氧诱导因子对人体代谢的调节

摘要

低氧诱导因子（HIF）家族转录因子在协调细胞对不同水平氧气的反应中起着关键作用。这些转录因子是由两个亚基组成的异二聚体蛋白：氧调节的HIF-α亚基（HIF-1α、HIF-2α或HIF-3α）和组成型HIF-β亚基(1). 在生理氧水平下，HIF-α亚基会迅速降解，限制转录复合物的形成(2). 通过特定脯氨酰羟化酶使HIF-α蛋白羟基化来启动降解(三–5). 这种羟基化使von Hippel–Lindau（VHL）蛋白结合(6,7)以及泛素-蛋白酶体系统随后对HIF-α的破坏。在低氧水平下，HIF-α的羟基化速率降低。这种减少损害VHL与HIF-α的结合，使转录活性HIF复合物在细胞内积聚。

许多HIF靶基因已在代谢和其他细胞功能中被确定（有关综述，请参阅参考文献。8–10). 在代谢方面，早期发现HIF在糖酵解途径中编码酶的基因的转录调控中起作用(11). 随后的细胞培养实验也证实了HIF在(我)通过直接或间接诱导丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）降低线粒体耗氧量，PDK抑制线粒体丙酮酸酶复合物（PDC）将丙酮酸转化为乙酰辅酶A(12–14); (ii（ii）)调节细胞色素的差异表达c（c）氧化酶亚基4亚型优化不同O下的呼吸效率₂紧张局势(15)、和(三)诱导线粒体自噬作为缺氧的适应性反应(16). 然而，迄今为止，这些观察主要局限于细胞培养，其对完整生物体的意义（或缺乏意义）在很大程度上尚未探索。

在人类中，丘瓦什红细胞增多症（CP）为了解HIF生理改变对综合代谢功能的影响提供了机会。CP是一种常染色体隐性遗传疾病，是楚瓦西地区的地方病(17)位于俄罗斯的中欧地区。CP患者的外显子3有纯合生殖系突变VHL（甚高频）基因(VHL（甚高频）598C→T），损害基因产物VHL与HIF-α亚单位的结合。这种损伤降低了HIF-α降解的速率，并导致HIF复合体的稳定，以及在正常氧条件下HIF-靶基因的表达增加(18,19). 对慢性胰腺炎患者的研究表明，红细胞压积和血红蛋白值较高，肺动脉血压升高，全身动脉压降低，呼吸系统和肺血管对急性缺氧的敏感性显著增加(17,18,20). 然而，在这些研究中没有任何代谢测量的报告。

在这项研究中，我们着手确定是否可以通过让患者暴露在运动和标准化饮食的代谢压力下来检测CP患者的任何代谢异常。特别是，我们通过在自行车测力计上进行递增运动测试来测量整体运动能力；小腿肌肉能量代谢³¹磁共振波谱（MRS）；标准膳食的代谢反应（动脉和静脉血液代谢物）；以及从休息时获得的活检样本中获得的体外骨骼肌纤维组成、酶活性和mRNA表达水平。结果表明，在代谢活性增强的条件下，CP患者产生的乳酸大大高于对照参与者。从细胞培养中HIF系统的研究中预测的部分（但不是全部）效应在患有CP的人体内观察到。

结果

CP患者和对照组参与者的年龄、性别、身高、体重、体重指数、每周体育锻炼量和红细胞压积见表1对照组参与者在日常生活中的体力活动水平、体重指数和年龄方面都很匹配。

CP增加运动期间的乳酸生成，限制整体运动能力。

图1说明了递增运动试验期间静脉血乳酸浓度、二氧化碳潮气末分压和通气量的平均值与工作速率的关系。CP患者的静脉血乳酸浓度在运动试验开始的早期增加，在运动试验后的约4分钟内以80 W的运动速度显著高于对照组。CP患者以低于对照组的运动速度停止运动。每公斤体重达到的最大工作速率（报告单位：表1)CP患者的得分显著低于对照组，约为对照组的70%。CP组最大工作率与红细胞压积无相关性。CP组在休息时的潮气末二氧化碳分压显著降低，并且在整个运动方案中保持不变。此外，与对照组相比，CP患者在运动期间的通气量增加更快。

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图1。

CP患者和对照组参与者对自行车测力计上递增运动的反应。(A类)静脉血乳酸浓度(B类)二氧化碳（PCO）的潮末分压₂)、和(C类)通风量表示为工作速率的函数。空白圆圈表示对照组的结果；填充的圆圈显示CP组的结果。数据为平均值±标准偏差。每个数据点的平均值数量取决于达到工作效率的参与者数量；个人的最大工作率报告于表1水平线表示CP患者的每个潜在平均值与对照组参与者的相应值存在显著差异*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.

在小腿肌肉运动过程中，CP会导致明显的磷酸肌酸消耗、无机磷酸盐升高和pH值下降。

图2说明³¹代表性对照组参与者和代表性CP患者在休息和小腿运动期间的P MR频谱。休息时，这两个人的光谱看起来很相似。然而，在运动期间，磷酸肌酸（PCr）峰值几乎消失，无机磷酸盐（P_我)CP患者的峰值明显高于对照组。每组中的所有受试者都获得了类似的结果。

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图2。

期间小腿肌肉获得的光谱示例³¹P女士(A类和B类)代表性控制参与者的光谱。(C类和D类)代表性CP患者的光谱。(A类和C类)静止时记录的光谱(B类和D类)在5-W运动周期的最后一分钟记录的频谱。PCr耗竭和P增加_我与对照组相比，Chuvash患者在运动中的表现要明显得多。

PCr的平均值，P_我在小腿运动的三个阶段和休息的中间阶段，CP和对照组的pH值如所示图3在CP组，肌肉PCr明显减少，P升高_我即使在最低水平的运动中也很明显。这些影响在所有工作速率下都是显著的，即使是最轻的工作速率（3W）也会导致PCr耗竭和P升高_我CP组的最大工作速率（5 W）高于对照组。同样，在所有三种运动水平下，CP组的肌肉pH值下降远远超过对照组参与者的肌肉pH下降。同样，这种影响使得CP组在最低运动水平下pH值的下降大大超过了对照组在最高运动水平下的pH值下降。两组的肌肉ATP浓度均因运动而降低，但在任何运动水平下，两组之间的浓度没有显著差异。

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图3。

CP组和对照组的结果³¹小腿肌肉的P MRS：(A类)PCr浓度(B类)P（P）_我浓度，以及(C类)pH值随时间变化。垂直虚线表示5分钟跖屈运动的开始和偏移，相关的黑色条表示功率输出（3、4和5 W）。空圆圈显示控制组的结果(n个= 5); 实心圆圈显示CP组的结果(n个= 5). 数值为分钟平均值±SD。带阴影的水平条表示显著差异的时段(P（P）<0.05）。

讨论

这项研究表明，HIF–VHL途径中的功能突变可以在整体上对人体能量代谢产生重大影响。特别是，该研究表明，运动，无论是大肌肉块还是小肌肉块，对CP患者来说都是一种巨大的代谢压力，与正常对照组相比，CP患者的乳酸积累量显著增加。与正常对照组相比，CP患者的最大运动能力较低，在轻度踝关节跖屈运动期间表现出早期和更严重的PCr耗竭和酸中毒。在CP患者中，休息时骨骼肌mRNA表达水平因糖酵解酶和PDC抑制而升高。

在正常健康志愿者中，最大摄氧量是最大运动量和血乳酸开始升高的工作速率的重要决定因素(21). CP患者存在一定程度的肺动脉高压(20)可以限制运动时心输出量的增加，从而导致最大运动能力低和肌肉早期产生乳酸。在本研究中，我们没有记录肺动脉血压，因此不知道在递增运动试验中肺动脉血压可能升高了多少。然而，我们研究了轻运动期间小肌肉块的能量代谢，其中CP患者显示肌肉中PCr显著耗竭，P累积_我与正常对照组相比，出现明显的肌肉酸中毒。因为这些发现与小肌肉块的轻度运动有关，他们认为心肺供氧限制不太可能解释代谢异常。运动强度较低，也不太可能是肌肉内氧气扩散限制所致。最后，五名患者中有三名没有明显的红细胞增多（因为通过静脉注射进行临床治疗），因此血液粘度的变化不太可能限制氧气供应。CP组的红细胞压积和最大工作速率之间没有任何相关性，这也支持了最后一点。

含有高比例快速抽搐（II型）白色肌纤维的骨骼肌更有可能在运动期间进行厌氧代谢，因此在收缩开始时产生更多乳酸，PCr耗竭更大。因此，进一步的可能性是，CP患者的骨骼肌可能含有较高比例的此类纤维。然而，活检结果并不支持这一假设，活检结果显示，CP患者和正常对照组的纤维类型比例几乎相同。

另一种可能性是，慢性胰腺炎患者的运动能力受到限制，不是因为氧气的可用性，而是因为他们使用氧气的能力。这种能力下降可能是由于三羧酸循环的底物供应受到限制，其方式类似于正常人在运动开始时的乙酰基缺乏(22,23). 特别是，乙酰辅酶A的产生需要PDC的激活，PDC通过激酶（PDK1-4）和磷酸酶（PDP1-2）分别控制的失活/激活循环受到严格调控。在CP患者的骨骼肌活检中，我们检测到PDK1、PDK2和PDK4的转录物显著升高（后两种是骨骼肌中激酶的主要亚型）(24,25). HIF抑制氧化代谢的能力与骨骼肌中缺乏HIF-1α的小鼠的观察结果一致；这些小鼠的运动耐力增加，乳酸水平降低，PDK1 mRNA水平降低(26). 虽然有CP的小鼠模型(27,28)，未见代谢表型报道。除了PDK外，我们还观察到另外两个已知HIF调节基因的转录水平升高(PFKM公司和PKM公司) (29,30)但其他HIF靶基因的转录物在CP患者中没有显著改变。由于我们的患者数量有限，这个结果可能只是作为II型错误出现。总的来说，尽管PDCt活性在两组之间没有显著差异，但其调节激酶或磷酸酶表达的改变可能解释骨骼肌能量代谢的异常。

在细胞培养中，HIF-1水平的升高与线粒体自噬有关(16). 因为线粒体总体积和最大摄氧量之间有很强的关系(31)，CP患者运动能力下降和乳酸生成增加的另一种可能解释是线粒体体积减少。然而，线粒体体积标记物（GluDH和CS活性）在各组之间没有任何差异，没有证据支持CP患者线粒体体积减少。在HIF-1α缺失小鼠的骨骼肌中，线粒体的数量也没有改变(32).

细胞培养中的进一步发现是HIF-1可能调节细胞色素氧化酶亚基4亚型的表达(15). 因此，CP患者和对照组的表达可能不同，这种差异可能会影响他们在肌肉内消耗氧气的效率。我们的肌肉活检分析受到可用组织数量的限制，我们无法评估这种可能性。

鉴于CP在运动期间对骨骼肌代谢的影响程度，CP患者餐后的葡萄糖、乳酸和丙酮酸代谢几乎没有异常。餐后血糖稳态正常。值得注意的是，CP患者在静息餐前和餐后状态下前臂的乳酸摄取量与对照组参与者没有差异。CP患者餐后动脉血乳酸浓度增加更多，但这种乳酸的来源尚不清楚。乳酸净生成的组织包括大脑、肠、血细胞、皮肤和脂肪组织(33–35)而肾脏（肾皮质）和肝脏清除乳酸(36). 骨骼肌会根据代谢状态和肌肉工作量提取或产生乳酸。血浆乳酸的升高与红细胞压积之间没有关联（某些慢性胰腺炎患者的血乳酸水平高于对照组），这表明血乳酸的产生与两组之间的差异无关。皮肤中乳酸的产生也可能是恒定的。从全身角度来看，脂肪组织产生的乳酸的贡献不太可能非常显著，至少在这些中等瘦的人群中不是如此。因此，餐后乳酸升高似乎更可能取决于CP对肠道乳酸生成的特异性影响、餐后肝乳酸清除率的降低或两者的结合。丙酮酸浓度的变化反映了乳酸的变化，血液中的乳酸/丙酮酸比率在各组之间没有差异；这些发现与细胞胞浆氧化还原状态没有受到重大干扰相一致。

膳食摄入使我们有机会检查餐后血浆胰岛素的升高，以寻找胰岛素分泌缺陷。最近在胰腺β细胞内VHL有条件缺失的小鼠中报告了此类缺陷(37–39). 由于饮食刺激胰岛素的升高似乎正常，并且似乎可以将餐后血糖浓度控制在正常范围内，因此我们得出结论，CP患者存在的轻微系统性VHL缺陷不会导致胰岛素分泌严重异常。

就心肺表型而言，慢性胰腺炎患者通常表现为适应高海拔缺氧的海平面本地人(20). 然而，关于运动，主流观点是，与未适应气候的人相比，适应海平面的本地人和高海拔的本地人在运动期间血液中积累的乳酸较少，并且在力竭运动后乳酸峰值较低(40,41). 这种情况被称为“乳酸悖论”(41–43). 相反，我们的CP患者表现出相反的效果。然而，并不是所有的研究都检测到了在适应环境后的运动中乳酸积累的减少(44,45)乳酸悖论的存在是一个有争议的问题(43,46–50). 以类似的方式，对于耐力运动员的“高住低练”方案是否有任何益处，除了可能由相关红细胞增多症引起的益处，还有争议(51). 我们的结果表明，人类HIF途径的持续激活更有可能对这种表现有害。最后，CP和氧气利用率降低之间的比较不应过于接近，因为氧气不仅影响HIF水平，而且本身也是新陈代谢的关键底物。代谢变化也会影响2-酮戊二酸的浓度，而这些浓度反过来又会影响HIF的水平(52,53).

总之，CP是一种细微的遗传异常，在缺氧条件下导致HIF调节基因产物的表达适度增加。在这项研究中，由于我们的患者数量有限，我们无法检测到细胞培养中HIF系统更强大的操作可能预测到的一些影响。然而，尽管CP缺陷具有微妙的性质，但只要代谢受到足够的压力，就可以检测到对整体代谢的主要影响。这些发现强调了HIF在代谢功能的整体调节中发挥着重要作用，而完整生物体内的其他机制并不能完全补偿CP修饰的代谢效应。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

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