小鼠肝纤维化中肝细胞不经历上皮-间充质转化

摘要

肝纤维化是慢性肝损伤（包括病毒性、酒精性和自身免疫性肝炎）持续伤口愈合反应的结果(1). 进行性肝纤维化导致肝硬化及其相关并发症，包括门脉高压、肝性脑病和肝细胞癌。目前，几种抗肝纤维化药物正在开发中，用于治疗肝纤维化，但其疗效尚未在患者身上得到证实(2). 进一步了解肝纤维化的细胞和分子机制可能有助于开发更有效的治疗方法。

肝纤维化的一个关键问题是产生细胞外基质（ECM）如I型胶原的成纤维细胞或活化的肌成纤维细胞的来源。静止肝星状细胞（HSC）被认为是纤维化细胞的主要来源(三). 然而，越来越多的证据表明，造血干细胞并不是唯一的来源。门脉肌成纤维细胞(4)或骨髓源性纤维细胞(5)可能是肝纤维化中肌成纤维细胞的其他细胞来源。此外，有人提出了一个新概念，即肝细胞经历一种称为上皮-间充质转化（EMT）的表型变化，以获得肝纤维化中的成纤维细胞表型(6). 使用细胞命运追踪技术证明，肝细胞衍生的细胞表现出成纤维细胞样形态，并伴有成纤维细胞特异性蛋白1（FSP-1）的表达。然而，这些肝细胞源性细胞是否参与肝纤维化中ECM的生成，FSP-1是否是纤维化肝中成纤维细胞的标志物，尚不清楚。

我们开发了一种报告小鼠，其中绿色荧光蛋白（GFP）在胶原蛋白α1（I）启动子下表达，能够在体内外追踪胶原蛋白生成细胞(7,8). 本研究的目的是直接检测肝细胞源性细胞在体内外是否表达I型胶原。

材料和方法

结果

原代培养肝细胞在TGFβ-1刺激下表现出成纤维细胞样形态变化并激活胶原α1（I）启动子

从三重转基因小鼠ROSA26 stopβ-gal中分离培养肝细胞；Alb-Cre；和Coll GFP。肝细胞在TGFβ-1治疗前或培养48小时后GFP阴性(图1，A、左侧和中间）。用3 ng/ml转化生长因子β-1处理肝细胞48小时，诱导成纤维细胞样形态学改变(图1，A，右上角），与之前的发现一致(6,13). TGFβ-1治疗不仅诱导了成纤维细胞样的形态学改变，而且激活了胶原α1（I）启动子，如TGFβ1治疗的肝细胞中GFP的表达所示(图1，A，右中）。TGFβ-1处理的肝细胞中胶原α1（I）的信使RNA水平增加到与培养激活的HSC相当的水平(补充图S1，A). 这种增加并没有被胶质毒素所阻止，胶质毒素可以消除潜在的污染HSC，正如抑制结蛋白水平所证明的那样，结蛋白是HSC的标志物(补充图S1、B). GFP阳性细胞的β-半乳糖苷酶表达表明，这些细胞没有污染非实质细胞，而是来源于肝细胞(图1，A，底部，右侧）。另一个实验证实了这一结果，在该实验中，X-半乳糖染色后进行GFP免疫细胞化学。始终，在TGFβ-1刺激下，肝细胞出现GFP和β-半乳糖苷酶双重阳性(图1，B，右侧）。即使在缺乏TGFβ-1的情况下也能看到少量GFP阳性细胞(图1，B，中间）。然而，他们的β-半乳糖苷酶从未呈阳性，表明他们污染了非实质细胞。

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图1

CCl中的胶原产生细胞₄-诱导性肝纤维化并非源于肝细胞

三重转基因小鼠ROSA26阻断β-半乳糖诱导肝纤维化；Alb-Cre；和用CCl注射8次以清除GFP₄(补充图S2). 沿纤维间隔可见GFP阳性细胞（胶原蛋白表达细胞）(图2，上部）。然而，他们从未对β-半乳糖苷酶阳性，GFP和X-gal染色的合并图像中缺乏双重阳性细胞就证明了这一点(图2，底部）。高倍图像清楚显示GFP阳性细胞仅存在于X-gal-阴性区域(补充图S3). 通过细胞分离证实肝细胞源性胶原蛋白表达细胞（即GFP和β-半乳糖苷酶双重阳性细胞）的缺失；在整个肝细胞部分中未发现双阳性细胞(图3，A，左），肝细胞分数(图3，A或非实质细胞部分(图3，A，右侧）。我们拍摄了224个不同的区域，并评估了3522个GFP阳性细胞。β-半乳糖苷酶均未阳性。评估区域内有1737个β-半乳糖苷酶阳性细胞，没有一个是GFP阳性细胞。Ad-Ce介导的终止密码子切除后非表皮细胞表达β-半乳糖苷酶(图3，B)，表明非实质细胞缺乏X-gal染色是由于终止密码子的持续存在，而不是由于β-半乳糖苷酶表达水平不足。这一结果消除了一些GFP阳性细胞实际上来源于肝细胞但没有表达足够的β-半乳糖苷酶以通过X-gal染色检测的可能性。在肝损伤的不同阶段均无双阳性细胞；急性期（CCl单次注射₄)慢性期（16次注射CCl₄)在肝脏切片和从受损肝脏分离的细胞中(补充图S4,第5章,S6系列、和第7部分). 此外，通过FACS对GFP阳性细胞进行分类，没有一个细胞（450000个GFP阳性）β-半乳糖苷酶阳性(图4). 这些结果清楚地表明CCl中I型胶原表达细胞₄-诱导性肝纤维化并非来源于肝细胞。

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图2

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图3

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图4

CCl中肝细胞不表达间充质标记物₄-诱导性肝纤维化

为了解决肝细胞在肝损伤过程中是否表达间充质标志物，我们在X-gal染色后进行了免疫染色。CCl中没有细胞α-SMA和β-半乳糖苷酶双重阳性₄-双转基因小鼠的治疗肝脏(图5，A). 同样，CCl中没有细胞FSP-1、结蛋白或波形蛋白和β-半乳糖苷酶双重阳性₄-双转基因小鼠的治疗肝脏(图5，B和补充图S8). 非实质细胞组分中的β-半乳糖苷酶阳性细胞从未对α-SMA、FSP-1、结蛋白或波形蛋白呈阳性反应，这一定是罕见的肝细胞污染。肝切片的免疫组织化学染色和X-gal染色证实CCl中没有肝细胞衍生的α-SMA或FSP-1阳性细胞₄-治疗过的肝脏(补充图S9).

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图5

肝细胞即使在体外用TGFβ-1刺激也不表达间充质标记物

在TGFβ-1存在下培养的肝细胞表现出成纤维细胞样的形态学变化(图6，A和表达的GFP由胶原α1（I）启动子驱动(图6，A，第二）。虽然在肝细胞原代培养中检测到一些α-SMA阳性细胞(图6，A第三），它们甚至在没有TGFβ-1的情况下出现（数据未显示），β-半乳糖苷酶从未阳性(图6，A，底部），表明它们污染了非实质细胞，而不是来源于肝细胞。同样，TGFβ-1处理的肝细胞也不表达FSP-1(图6，B，第三）或desmin(补充图S10，第三）。肝细胞原代培养中存在少量FSP-1或结蛋白阳性细胞，但β-半乳糖苷酶从未阳性(图6，B、底部和补充图S10，底部）。肝细胞培养物中FSP-1的信使RNA水平既没有以时间依赖性的方式增加，也没有通过添加TGF而增加β-1 (补充图S11). 这表明FSP-1在塑料培养皿中培养的肝细胞中不表达，并且FSP-1不是由TGFβ1刺激诱导的。

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图6

讨论

尽管进行了深入的研究，但在肝纤维化中产生ECM的细胞的起源仍然存在争议。在正常肝脏中，HSC的特征是含有维生素A的脂滴，并以静止状态存在于Diss间隙。肝损伤后，HSC获得一种肌纤维母细胞表型，以应对炎症和纤维化前刺激，表达包括α-SMA在内的激活标记物，并合成包括I型胶原在内的ECM。目前，HSC被认为是肝脏肌成纤维细胞的主要来源(三,14). 然而，研究表明，HSC并不是导致肝纤维化中ECM积聚的唯一细胞类型。Beaussier等人认为门脉间充质细胞在缺血性或胆汁淤积性肝损伤中有助于肝纤维化(4). 我们最近确定纤维细胞是肝脏中产生ECM人群的另一个潜在来源。这些胶原蛋白表达细胞来源于骨髓，在受到损伤时迁移至肝脏(5).

另一个概念表明，肌成纤维细胞也可以通过称为EMT的表型变化起源于上皮细胞。在肾脏完成了EMT在器官纤维化领域的开创性研究(15)，透镜(16)和肺(17,18). 最近有人提出EMT也会导致肝纤维化(6,13). Zeisberg等人证明，以前表达白蛋白的细胞（即肝细胞）在CCl作用下获得FSP-1的表达₄体内或体外转化生长因子β-1(6). Kaimori等人报道，肝细胞在体外对TGFβ-1反应时表达胶原α1（I），Smad信号传导介导EMT(13)Dooley等人也报道了这一情况(19). 此外，建议对胆道上皮细胞进行EMT(20–22). 我们目前的研究没有调查胆管细胞是否经历EMT并在受损肝脏中贡献产生ECM的细胞池。

据我们所知，上述研究均未提供证据证明肝细胞源性细胞表达ECM基因并在体内肝纤维化中促进ECM的生成。例如，Zeisberg等人仅依赖FSP-1的表达作为纤维生成细胞的标记(6). 然而，到目前为止，肝脏中的FSP-1阳性细胞尚未被鉴定出来，这些细胞是否在体内合成ECM尚不清楚。Kaimori等人表明，TGFβ-1刺激的原代肝细胞培养物表达胶原α1（I），并且形态学变化与体外EMT一致(13). 然而，与所有原代培养细胞的实验一样，不能排除其他人群的污染。虽然本研究也观察到肝细胞系中胶原蛋白α1（I）的表达，但表达水平的增加先于EMT的形态学变化，且与EMT的形态变化不平行。细胞系中观察到的胶原α1（I）表达的短暂增加可能反映了与EMT无关的胶原αl（I）启动子的短暂激活。以前的研究结果表明，胆管细胞经历EMT是不确定的，因为它们完全依赖于胆管细胞标记物的双重免疫荧光染色和包括FSP-1在内的间充质细胞的替代标记物(20–22). 如上所述，目前尚不清楚FSP-1阳性细胞是否表达胶原蛋白，因此也有助于体内产生ECM细胞。迄今为止，尚未对胆管细胞进行细胞命运跟踪，因此，尚缺乏胆管细胞失去上皮特性并获得间充质表型并开始合成ECM的遗传证据。我们目前的研究没有涉及胆管细胞在EMT中的作用。

为了分析肝细胞源性细胞是否确实有助于肝纤维化中ECM的生成，我们使用了一只报告小鼠，其中GFP在小鼠胶原α1（I）启动子/增强子下表达，并结合Zeisberg等人先前研究中使用的细胞命运追踪技术(6). 我们使用原代培养肝细胞的体外结果最初似乎支持EMT的概念。肝细胞不仅表现出成纤维细胞样的形态变化，而且在TGFβ-1的作用下也表达胶原α1（I）。使用ROSA26 stopβ-gal和Alb-Cre小鼠的细胞命运追踪技术排除了GFP表达细胞污染间充质细胞的可能性。然而，表达GFP的肝细胞不表达间充质标志物，如FSP-1或α-SMA。肝细胞培养中FSP-1或α-SMA阳性的少数细胞β-半乳糖苷酶不阳性，并且是罕见的污染细胞。因此，我们观察到肝细胞表达具有“成纤维细胞样”形态变化的胶原α1（I），这不符合EMT的定义，因为它与间充质标记物的表达无关。许多研究表明，培养的肝细胞表达间充质标志物以应对TGFβ-1(13,23). 然而，这些研究未能表明间充质标志物阳性的细胞是真正的肝细胞来源的细胞，并不代表污染细胞。只有Zeisberg及其同事使用细胞命运追踪技术来证明肝细胞来源的细胞表达间充质标志物（FSP-1）(6). 免疫染色（FSP-1和β-半乳糖苷酶）的可靠性尚有疑问（稍后讨论）。事实上，我们(补充图S7)以及Kaimori等人(13)在接受TGFβ-1治疗的肝细胞中观察到FSP-1 mRNA水平没有增加，这对Zeisberg等人的观察提出了挑战。总之，我们的研究与以前的报告一致，没有提供证据表明原代培养肝细胞经历EMT并获得FSP-1的表达。

更重要的是，我们的体内实验没有检测到肝细胞源性I型胶原表达细胞。在CCl的各个阶段均证实无双阳性（β-半乳糖苷酶和GFP）细胞₄-诱导性肝损伤（1次、8次和16次注射）。因此，肝细胞源性纤维生成细胞不太可能真的存在，但它们的出现是短暂的，没有引起我们的注意。此外，我们的实验表明缺乏使用内源性基因而非转基因的肝细胞源性FSP-1阳性细胞，这与之前的研究相矛盾(6). 这种差异的原因很重要。Zeisberg利用双重免疫荧光染色检测FSP-1和β-半乳糖苷酶。相反，我们使用X-gal染色结合免疫细胞化学来代替双重免疫荧光来检测FSP-1。我们测试了两种不同的抗体，它们能够充分检测到腺病毒表达的β-半乳糖苷酶，但在本研究和Zeisberg的研究中使用的ROSA26停止β-gal小鼠中，这两种抗体都不能检测到β-半乳糖苷酶。为了在X-gal染色中获得蓝色信号，切片或细胞需要隔夜培养，而对于感染表达β-半乳糖苷酶的腺病毒的肝细胞或肝脏切片，仅需两小时就足够了。从这些观察结果中，我们得出结论，ROSA26停止β-gal小鼠中β-半乳糖苷酶的表达水平不够高，无法用免疫荧光检测，因此X-gal染色是首选方法。因此，可以得出结论，在我们的研究中，肝细胞源性FSP-1阳性细胞的缺失并不是由于方法不当而导致的假阴性。相反，我们怀疑Zeisberg研究中β-半乳糖苷酶的免疫荧光可能是非特异性染色或从另一个荧光探针渗出，因为两种不同抗原的染色模式几乎相同（参见参考文献中的图5E(6)并比较β-半乳糖和FSP-1的染色模式）。此外，值得关注的是，肝切片上β-半乳糖苷酶的染色模式与X-gal染色的模式不重叠（相比之下图5C和D). 综上所述，我们怀疑Zeisberg等人由于其免疫染色的局限性得出了错误的结论。

我们也理解我们研究的局限性。正如我们在之前使用Coll-GFP和α-SMA双转基因小鼠的研究中所示，GFP和RFP并不完全重叠(7). 然而，我们希望强调的是，本研究中的α-SMA染色仅在GFP阳性细胞中观察到，这表明用于生成α-SMA RFP小鼠的启动子活性与α-SMA蛋白表达之间存在差异。因此，完全依赖报告鼠系统可能会导致产生胶原蛋白的间充质细胞潜在缺失。我们研究的另一个弱点是，利用ROSA26阻断β-gal和Alb-Cre小鼠的细胞命运追踪技术不能标记100%的肝细胞。因此，不能排除潜在的肝细胞源性间充质细胞被监管的可能性。然而，我们想再次强调的是，Zeisberg等人使用了相同的方法追踪肝细胞，这种方法的所有提到的缺点也适用于他们的研究。

总之，我们认为，以往的研究认为EMT是肝脏中产生胶原蛋白的肌成纤维细胞的重要来源，但其方法、方法和数据质量受到了限制。这些研究依赖上皮标记物和EMT替代标记物的双重免疫荧光染色，但缺乏肝细胞衍生细胞产生ECM的功能证据。我们的研究清楚地确定了胶原蛋白表达细胞，但这些细胞都不是来自体内肝细胞。虽然我们认识到我们研究的局限性，但我们的结果强烈挑战了体内肝细胞通过EMT获得间充质表型从而在肝纤维化中产生ECM的概念。

补充材料

致谢

使用的缩写

脚注

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