2材料和方法
同位素：[U-13C] -葡萄糖[2,3-13C] -丙氨酸和[3-13C] -乳酸购自剑桥同位素实验室（马萨诸塞州安多弗），使用时未经进一步纯化。
2.1初级皮层神经元培养
如前所述准备皮层神经元培养物(Hao等人2004)稍作修改。简言之，CO对怀孕（E-18）的Sprague-Dawley大鼠（Charles River，Frederick，MD）实施了安乐死2根据NIH批准的实验动物护理和使用协议进行吸入。胚胎被取出，在冰上冷冻，在无菌条件下对皮层进行显微解剖。皮质细胞在钙中解离2+-和镁2+-含0.125%酪氨酸的游离HBSS 15分钟，在含有10%FBS和抗生抗肌力药物（Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM，Invitrogen，Carlsbad，CA）中研磨，并在150 mm的盘子中镀上5µg/ml聚乳酸-d日-赖氨酸（西格玛，密苏里州圣路易斯）。细胞在37°C、5%CO下生长2和95%的湿度，首先在10%的FBS/DMEM中，一天后切换到无血清的Neurobasic培养基（Invitrogen，Cat#21103）。丙氨酸2 mg/l；乳酸0；谷氨酸0），加上B27（Invitrogen）。在用于实验之前，培养物在无血清培养基中培养10天，每3天更换一次培养基。经抗NeuN抗体免疫细胞化学鉴定，这些培养物产生了>95%的神经元（Cat#MAB377；Millipore，Billerica，MA）。
2.2星形胶质细胞培养
如前所述，从出生后第3天Sprague–Dawley大鼠的大脑皮层分离出星形胶质细胞(Zhang等人，2002年). 简单地说，大脑被移除，在PBS中清洗，并与抗生抗肌药（Invitrogen）一起放入HBSS中。组织被解剖并转移到15 ml试管中，用10 ml移液管通过机械分离研磨，然后通过#19针一次，#21针两次，最后进入#25针一次。将细胞研磨好后，在75cm培养基中培养2烧瓶（相当于每个烧瓶两个大脑），并在保持5%CO的加湿培养箱中保持37°C2.
2.3细胞处理
将培养物转移到无葡萄糖培养基（来自Sigma的DMEM。来自Invitrogen的定制神经基底培养基），提供0.2%13C-葡萄糖（10.75 mM），2 mM13C-丙氨酸或5mM13C-乳酸，用或不用1.0 mM氯化锂（西格玛）处理细胞1、2、3天。这在患者血液、啮齿动物血液和脑组织中的治疗性锂浓度范围内(Jensen等人，1996年). 将相同浓度的非同位素葡萄糖、丙氨酸或乳酸盐（Sigma）提供给另一组进行比较。过滤培养基，用PBS清洗细胞，造粒并立即在−80°C下冷冻。
2.4代谢物提取和测定
用10%冷三氯乙酸（TCA）提取冷颗粒或培养基两次，然后按前述方法进行冻干(Fan等人，2005年;Fan等人，2006年). 使用核磁共振定量葡萄糖13C-1αH卫星信号以5.22 ppm为中心。这占总葡萄糖的36%。这个13C和12通过甲基峰及其卫星的积分来确定C乳酸盐和丙氨酸的浓度，并将其标准化为标准DSS的浓度。由此，可以估算消耗的葡萄糖量（ΔGlc）和转化为乳酸和丙氨酸的部分（F），根据等式1和2(车道和风扇2007):
1–F代表进入细胞团中的其他代谢物和大分子的葡萄糖碳或其他未被考虑的葡萄糖碳。
丰富的培养基成分（如苏氨酸和缬氨酸）也进行了类似的整合，并将其浓度作为采样时间的函数进行测定，以评估必需氨基酸的利用率。如前所述，胆碱代谢物（胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱）的浓度是根据接近3.22 ppm的三甲基铵共振区域测定的(Fan等人，1993年).
2.6 GC-MS分析
核磁共振分析后，样品被冻干并在纳米纯H中重新悬浮20.将等分样品与40%TCA混合至最终10%TCA浓度。还添加了50µl 0.1 mM去甲肾上腺素（Sigma）作为内部标准。用50µl乙腈：MTBSTFA对样品进行冻干和硅烷化处理(N个-甲基-N个-[第三种-丁基-二甲基硅基]三氟乙酰胺，Regis Chemical，Morton Grove，IL）（v/v 1:1），超声处理3 h，然后过夜培养。如前所述，在使用PolarisQ GC离子阱MSn（ThermoFinnigan，Austin，TX）进行分析之前，对衍生提取物进行离心以去除颗粒(Fan等人，2005年). 使用XCalibur软件（ThermoFinnigan）对代谢物进行鉴定和量化。
2.7免疫印迹
如前所述进行免疫印迹(Hao等人，2004年). 用ECL检测印迹上的特定信号，并用柯达X射线胶片进行可视化。用柯达图像工作站440CF对PC和β-肌动蛋白免疫反应进行密度分析。
RNA分离和反转录：根据制造商的说明，使用Trizol试剂和PureLink RNA迷你试剂盒（Invitrogen）从神经元细胞中分离出总RNA。使用SuperScript III第一链cDNA合成系统（Invitrogen）进行反转录反应，并在50℃下进行45分钟，然后在70℃下进行15分钟的反应失活。
2.8定量实时PCR
用Invitrogen合成了PC和β-肌动蛋白的引物。PC引物序列为：正向引物5′-GCGTGTTGACTACAGTGA G-3′和反向引物5’-TCTGACCCTTGAACTT G-3′。使用iQ5实时PCR检测系统（加州Hercules生物实验室）进行定量PCR。实时PCR程序包括95°C（10分钟）和40个95°C循环（30秒）和60°C循环的酶激活步骤。使用Ct与对数拷贝数的标准图将获得的周期阈值（Ct）值转换为mRNA拷贝数。对目标cDNA扩增的三次重复运行获得的数据进行平均，并表示为对照的%。
2.9统计分析
GC-MS分析一式三份，并计算每个报告代谢物的分析%RSD（相对标准偏差）。方差分析用于多组比较。使用Student’st吨-用适当的多重比较修正进行测试。P（P）<0.05被认为是显著不同的。
3结果和讨论
3.1锂对星形胶质细胞和神经元代谢产物摄取和释放的影响
星形胶质细胞和神经元对葡萄糖代谢有不同的需求，并且交换的特定代谢产物也不同。因此，我们测量了细胞从沐浴液中摄取葡萄糖和其他代谢物，并将代谢物释放到培养细胞的培养液中。
在三天的时间里，细胞消耗了大约三分之一的初始葡萄糖，并将大约90%的葡萄糖转化为分泌的乳酸（参见。等式1;). 与葡萄糖消耗相比，必需氨基酸如Thr和Val的摄取在3天内非常低（数据未显示）。葡萄糖到乳酸的高转化率意味着很少有葡萄糖碳用于生物合成或线粒体氧化，而是用于能量，并可能为神经元提供可用的底物。经锂处理的细胞最初的乳酸释放速率比对照细胞快，而葡萄糖消耗速率相似。这导致锂处理细胞中葡萄糖到乳酸的转化率高于对照细胞，表明锂影响了乳酸发酵和其他葡萄糖利用之间的平衡（见下文）。
1[U中生长的星形胶质细胞葡萄糖消耗和乳酸释放的H NMR分析-13C] -葡萄糖。面板一培养基中代谢物浓度的时间进程。开放符号为控制，填充符号为+1 mM锂。红色：缬氨酸；蓝色:13C类三乳酸盐，黑色：[U-13C] -葡萄糖。缬氨酸没有显著消耗，而标记葡萄糖减少，而标记乳酸增加。面板b条时间进程13乳酸中的C富集和标记葡萄糖转化为乳酸(等式1,2). 实心方块：分数13C类三-乳酸。实心圆圈：的分数13细胞消耗并分泌的C-葡萄糖13C类三-乳酸。红色控制，蓝色+1 mM锂+
此外，还通过GC-MS检测了代谢产物在生长培养基中的释放。13C类三-与许多哺乳动物细胞一样，乳酸是星形胶质细胞释放的最丰富的代谢物。然而，与我们分析的其他哺乳动物细胞不同(Fan等人，2005年;Fan等人，2008;Lane等人，2009年)，星形胶质细胞也释放出相当数量的13C标记的柠檬酸盐、谷氨酰胺和丙氨酸进入培养基(). 锂增强了这些标记代谢物的释放，特别是在治疗3天后。鉴于星形胶质细胞对神经元的“辅助”地位，在所谓的星形胶质细胞-乳酸神经元穿梭假说中，星形胶质细胞释放的乳酸被假定为神经元的补充燃料来源(Bonvento等人，2005年;Bouzier-Sore等人，2003年;Bouzier-Sore等人，2006年). 星形胶质细胞对乳酸释放的锂刺激可能有助于改善神经元的能量状态。新合成的Gln的释放是以Gln-Glu在星形胶质细胞和神经元之间循环为前提的(Zwingmann和Leibfritz 2003年). 然而，释放的柠檬酸和丙氨酸的去向尚不清楚。
时间进程发布13C标记代谢物进入星形胶质细胞培养基以响应LiCl处理。星形胶质细胞在[U-13C] -Glc作为示踪剂，有或没有LiCl。用10%三氯乙酸提取星形胶质细胞培养基中的极性代谢物，并按照“材料和方法”一节中的描述通过GC-MS进行分析。代谢物浓度表示为µmole/g细胞干重/ml培养基。13C代谢物代表测量的所有质量同位素的总和。每个时间点是重复样本的平均值
的时间进程发布13通过GC-MS分析培养的神经元细胞的C标记代谢物和锂对释放的影响。与星形胶质细胞一样，13乳酸是迄今为止神经细胞释放的最丰富的代谢物，而13C-Glu和13C-Gln位居第二，其次是Ala、琥珀酸和Asn(图S1和数据未显示）。与星形胶质细胞不同（见上文），锂对这些代谢物的释放没有显著影响，对13C-Ala和13C-琥珀酸酯（数据未显示）。
为了更详细地了解锂对通路的影响，我们接下来测量了标记前体的细胞内命运。
3.2锂对星形胶质细胞代谢途径的影响
我们使用[U-13C] -葡萄糖追踪锂处理诱导的星形胶质细胞初级代谢途径的变化。这个13通过1-D和2-D组合分析C标签并入各种代谢物1H TOCSY公司(图S2)和1H（H）-13C-HSQC公司(图S3)核磁共振实验，提供定量13C位置富集数据(风扇和车道2008)以及GC-MS，其量化了13无论标记位置如何，代谢物中的C富集(13C质量同位素）。图1-D1H（H）-13C HSQC分析从锂和对照处理的星形胶质细胞中获得的极性提取物。这个一维版本的2-D HSQC实验检测直接附着在13C标记的碳，从而揭示13C位置异构体。锂处理导致乳酸峰值强度大幅增加（与浓度成正比）13C-3位置的C标签(13C-3-乳酸），相对于对照治疗。较小的锂引起的13C-3-Ala，13C-1–5′-核糖AXP，以及13C-1′-核糖-UXP也很明显。
一维1H（H）-13氯化锂与对照处理星形胶质细胞提取物的C HSQC光谱。星形胶质细胞在[U-13C] -葡萄糖（作为示踪剂），含或不含氯化锂。用60%乙腈从处理过的星形胶质细胞中提取极性代谢物，并在14.1T下获得光谱，如“材料和方法”部分所述。每个1H峰由直接附着在其上的质子产生13C和峰值赋值表示13C-碳。因此，峰值强度反映13C附着碳的丰度。虚线LiCl处理引起的峰值强度的显著变化
用GC-MS分析了相同的极性提取物，这既证实了核磁共振分析，又补充了核磁共振的分析。代谢物及其干重的总绝对浓度（µmol/g细胞干重）13通过GC-MS测定了碳质量同位素作为锂处理反应时间的函数(表S1，补充材料). 与对照组相比，锂处理的细胞积累了更多的糖酵解代谢物（乳酸、丙氨酸、α-甘油-3-磷酸或GlyOH3P）、克雷布斯循环中间产物（琥珀酸、柠檬酸和α-酮戊二酸或α-KG）、必需氨基酸（Ile、Thr）、神经递质氨基酸（Gln而非Glu）和其他非必需氨基酸（Asn、Asp、Pro、Gly）三天后(;补充材料表S1). 然而，这种积累的时间过程因代谢物而异；一些在3天内持续存在（例如乳酸、丙氨酸、琥珀酸、柠檬酸、α-KG、苯丙氨酸和脯氨酸），而另一些在三天内稳定（例如天冬氨酸）或下降（例如谷氨酸）。一些13C-标记代谢物（例如。13C-乳酸，13C-Ala，13C-琥珀酸酯，13C-柠檬酸盐，13C-αKG，13C-Asp，三重标记Asp或13C类三-Asp）表现出质量相似的时间进程，而其他时间进程则不同(13C-Glu、，13C-Gly）(). 特别是，尽管总Glu浓度在三天后下降13C标记的Glu浓度随着锂处理的增加而增加。同样，13C类三-天冬氨酸同位素继续累积，而星形胶质细胞中天冬氨酰氨酸总浓度的增加因锂处理而趋于稳定（参见。). 标记代谢物与总代谢物的这种不同行为表明，示踪剂能够区分来自不同途径的每种代谢物对总代谢产物库的贡献。
氯化锂引起的选定代谢物和13在[U培养的星形胶质细胞中的C-标记代谢物-13C] -葡萄糖。相同的极性提取物如“材料和方法”一节所述，进行硅烷化并通过GC-MS进行分析。总代谢物的氯化锂和对照处理之间代谢物浓度的差异（面板一)或的总和13碳同位素（面板b条)绘制为治疗天数的函数。每个时间点是重复样本的平均值（参见表S1，补充材料标准误差）。锂对照：锂处理细胞的代谢物浓度减去对照；aKG：α酮戊二酸盐；GlyOH3P:α甘油-3-磷酸；13C代谢物：μmol/g干细胞质量13C-标记代谢物；13C类三-天冬氨酸：三倍13C-标记的天冬氨酸
大部分13C-标记的乳酸和丙氨酸被均匀标记（[U-13C] -乳酸或13C类三-乳酸(图S4)和13C类三-Ala（未显示数据），如13乳酸的C卫星峰(风扇和车道2008;Lane等人，2008年)在1-D中1星形胶质细胞提取物的核磁共振氢谱。生产13C类三-乳酸和13C类三-来自[U的Ala-13C] -Glc意味着活性糖酵解，在较小程度上意味着磷酸戊糖途径（PPP）。这个13C-2、3和4位Glu和谷胱甘肽（GSH）的C标记()和13C-标记柠檬酸盐、α-KG、琥珀酸盐和柠檬酸盐()可能是从[U-13C] -Glc通过糖酵解序列和Krebs循环(Fan等人，2009年)同时13C类5-核糖AXP()由[U合成-13C] -通过PPP的Glc。因此，在为期3天的治疗期间，锂治疗增强了糖酵解途径，这一点可以从以下时间依赖性反应中得到证明：13C-标记的乳酸、丙氨酸和GlyOH3P。长时间锂处理后Krebs循环的刺激作用从增加的13C-标记的克雷布斯循环中间产物、柠檬酸盐、琥珀酸盐、αKG、谷氨酸和天冬氨酸(Fan等人，2009年)3天后(). 也有证据表明，锂通过丙酮酸羧化反应（PC）在Krebs循环的回补输入中诱导增强，如合成13C类三-Asp超过3天(;表S1)，似乎是从13C类三-丙酮酸（糖酵解最终产物）加CO2(Fan等人，2009年). 众所周知，PC在星形胶质细胞中很活跃，对Glu合成有重要贡献(Hertz等人，2007年). 锂对PC的进一步增强可能对线粒体能量学和Glu/Gln循环具有重要意义。这种增强的PC以及PPP的加速可能是135′-腺嘌呤核苷酸（5′AXP）的C-核糖部分().
3.3锂对神经元代谢途径的影响
3.3.1使用[U观察到的效果-13C] -Glc作为示踪剂
相同[U-13C] 采用Glc示踪法研究锂对培养神经元的代谢影响。这个13从锂处理和对照神经元中提取的极性代谢物的C同位素通过1-D分析1H（H）-13C HSQC分析(图S5). 至于星形胶质细胞，所有代谢物和13C-同位素通过2-D鉴定1H TOCSY和2-D1H（H）-13C HSQC分析。积极转化的神经细胞[U-13C] -谷氨酸通过糖酵解（乳酸、丙氨酸）、克雷布斯循环（琥珀酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷胱甘肽、谷氨酸）和PPP（5'AXP、5'UTP的核糖部分）转化为代谢物。基于峰值强度（与13C同位素浓度）13C英寸图S5，锂在合成13C-2,3位C标记的乳酸，13C-3处C标记为Ala，13C在C2,3标记的Asp，以及13与对照组相比，C标记的C1-5处5'AXP的核糖部分。LiCl增强了5'AXP-核糖的合成，这也从131-D中5'AXP的1′-核糖部分的C卫星峰强度1神经元提取物的核磁共振波谱（数据未显示）。通过根据内部标准DSS校准，未标记和13对照组第1天至第3天混合神经元提取物中的C-标记AXP浓度分别为7.2和8.2µmol/g细胞干重，LiCl组为9.4和10.2µmol/g细胞干重量。
相同提取物的定量GC-MS分析证实了13通过1-D HSQC分析确定C位置同位素水平。此外，GC-MS提供了总代谢物和各种代谢物的绝对定量13C质量同位素，包括单同位素（全部12C物种），尤其是难以分解或浓度太低而无法通过核磁共振测量的代谢物（参见。表S2). 与对照组相比，锂增强的丙氨酸积累在治疗2天后达到最大值，而乳酸积累在治疗1天后达到峰值，之后减少(). 这种趋势与星形胶质细胞的观察结果不同。同样，锂诱导的氨基酸积累，如Ile、Pro、Asn、Gln、Asp、Thr、Phe和Tyr，与星形胶质细胞的相应变化不同。特别是，经过3天的锂治疗后，神经细胞中的Glu仍然显著升高，而星形胶质细胞中的Glu却被耗尽（参见。,). 有趣的是，在神经元中，随着时间的推移，锂耗尽了神经递质前体Trp()然而，与对照细胞相比，锂处理的星形胶质细胞明显相反(). 在锂处理的神经元细胞中，琥珀酸积累（相对于对照组）在2天后达到峰值。这些琥珀酸变化的程度远大于星形胶质细胞中观察到的变化。相反，锂对其他克雷布斯循环中间产物柠檬酸盐、苹果酸盐和αKG的影响较小。
氯化锂引起的选定代谢物和13培养神经元中的C-标记代谢产物-13C] -葡萄糖。制备神经元细胞的极性提取物并通过GC-MS进行分析，如。每个时间点是重复样本的平均值。绘图面板内一是总代谢物浓度，而绘图面板内b条是所有的总和13碳同位素(13C代谢物）和选定个体13碳同位素(13C类x个-代谢物是质量同位素x个 13碳）
如前所述，代谢物总浓度的这些变化并不能为特定途径的扰动提供可靠的见解，因为每个代谢物池都可以从多个途径获得。这是详细了解13个别代谢物的C标记模式是必要的（cf表S2，补充材料). 基于总数13C同位素浓度、乳酸和谷氨酸是主要的13[U的碳汇代谢物-13C] -神经细胞中的Glc示踪剂(;表S2). 大量13示踪剂中的C标记也并入天冬氨酸、丙氨酸和琥珀酸。大部分13C-乳酸，13C-Ala和13C-甘油-3-P池作为统一标记的物种（即。13C类三-乳酸，13C类三-Ala和13C类三-甘油-3-P）(表S2)，表示它们是由[U合成的-13C] -Glc通过糖酵解而无代谢紊乱。13C-标记乳酸(13C类2-和13C类三-乳酸）也可以通过戊糖磷酸途径（PPP）合成，但程度要小得多。
对于克雷布斯循环代谢物（琥珀酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、天冬氨酸和谷氨酸），含有2、3和4的质量同位素13C原子全部存在并通过GC-MS进行量化(表S2). 这些代谢物的+2同位素（即。13C类2-阿斯普，13C类2-柠檬酸盐，13C类2-富马酸盐，13C类2-谷氨酸，13C类2-苹果酸，13C类2-琥珀酸）的浓度最高，其次是+3和+4等位异构体。+2同位素反应了一圈后克雷布斯循环的活动()而柠檬酸的+4同位素(13C类4-柠檬酸盐）应来自两次克雷布斯循环活动(). 克雷布斯循环活动的三个循环将产生13C类5-柠檬酸盐种类（参见。). 然而，由于13C类5-柠檬酸盐可以忽略不计（数据未显示），在这个实验中，神经元经历3圈克雷布斯循环的程度必须是最小的。还应注意13C类2-柠檬酸盐高于13C类4-柠檬酸盐，表明大多数神经元只经历了克雷布斯周期的一个周期。
预期13从[U合成的糖酵解和Krebs循环代谢物的C-位置等位异构体模式-13C] -哺乳动物细胞产生的Glc。未标记的碳在黑色圆圈，已解读13碳在红色圆圈，在加扰时13碳是洋红的，绿色，或橙色圆圈可逆反应描述为双头箭头而两种不同的丙酮酸池通过黑色和蓝色字母。个人计算机丙酮酸羧化酶，南海琥珀酰辅酶A合成酶。面板a、 c、d，分别显示13正常克雷布斯循环活动一圈、两圈和三圈后代谢物中的碳。面板b条和e（电子）追踪13输入无补体丙酮酸羧化的克雷布斯循环代谢物中的碳
对于一个循环转弯，没有13C类三-应产生未观察到的天冬氨酸(表S2;). 因此，产生了可观数量的13C类三-天冬氨酸同位素表明丙酮酸羧基化（PC）对合成13C类三-一圈后的Asp（参见。). 此外，琥珀酸、苹果酸和天冬氨酸有数量可观的+4种同位素(表S2)，可以从13C类三-丙酮酸加缩合13C类2-一个循环后的乙酰辅酶A()或者在三圈后通过正常的克雷布斯循环活动(). 由于大部分神经元只经历了一个克雷布斯周期转折，因此可以合理地得出结论，PC是神经元产生的主要途径13C类4-天冬氨酸。因此，谷氨酸、天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸的个别同位素是区分锂在回复性PC和正常克雷布斯循环活动之间的作用的有价值的指标。同样，乳酸和丙氨酸的+3同位素揭示了锂是如何影响糖酵解的。
对于糖酵解，尽管乳酸总浓度增加逐渐减少()，锂处理的电池显示出13C类2-和13C类三-乳酸，相对于对照(). 这与13C类2-和13C类三-锂引发的丙氨酸水平。如上所述，13C类三-乳酸和13C类三-Ala源自[U-13C] -Glc通过糖酵解作用，其浓度增加，因此表明锂的糖酵化作用增强。另一方面，乳酸和丙氨酸的+2同位素是PPP非氧化分支的杂乱产物。提高了13C类2-乳酸和13C类2-锂引发的丙氨酸可能来自PPP的刺激().
关于克雷布斯循环产物，谷氨酸和柠檬酸+2同位素的相对水平未被锂显著改变()这表明锂对1标准Krebs的旋转通过Glu臂循环。然而，与时间相关的消耗13C类4-与对照组相比，柠檬酸盐是由锂诱导的。这一结果可以解释为第二个克雷布斯循环周期的锂衰减和/或将新合成的柠檬酸盐转移到其他代谢途径（如脂质生物合成）的增强。锂对琥珀酸、苹果酸和天冬氨酸的+2同位素的时程效应是刺激性的(;表S2)，这表明1标准克雷布斯循环的转折得到加强。这与锂对13C类2-Glu，这可以解释为从草酰乙酸（OAA）到琥珀酸的通量增加（即克雷布斯循环相反，参见。)以及通过转氨作用从OAA到Asp，而Krebs循环从OAA至Glu的正向流量未受影响。催化OAA转化为琥珀酸的三种酶（苹果酸脱氢酶、富马酸水合酶和琥珀酸脱氢酶(赫斯特等人1996))是自由可逆的，而琥珀酰辅酶A合成酶（SCS）步骤是不可逆的（参见。)导致观察到的总量和13C-标记琥珀酸盐(). 此外，锂提高了13C类三-天冬氨酸()，这反映了如上所述，丙酮酸羧基化的回复增加。增强的PC反过来会增加OAA的产量，这可能导致通过大规模作用从OAA到琥珀酸和天冬氨酸的通量增加。
虽然已知PC在星形胶质细胞中活跃，但人们认为它在神经元中不存在(Hertz等人，2007年). 然而，哨兵代谢物中标记的同位素模式表明，在培养的神经元细胞中，PC有显著的通量。RT-PCR测量进一步支持了这一点印刷电路板丙酮酸羧化酶蛋白的mRNA和Western Blot分析(图S6，补充材料). 在从大鼠皮层获得的初级神经元中，无论是mRNA还是蛋白质方面，这种酶都存在显著水平。然而，锂对丙酮酸羧化酶的影响在mRNA水平上为负，在蛋白质水平上不显著。由于PC的绝对活性还取决于变构激活剂乙酰辅酶A的浓度(Jitrapakdee等人，2008年)锂可能改变了乙酰辅酶A的浓度，这可以解释其对PC的刺激作用。
总的来说，锂刺激的糖酵解是神经元和星形胶质细胞中Krebs循环和PPP的回补部分。锂对这两种细胞类型影响的主要差异在于合成和释放标记糖酵解和克雷布斯循环代谢物的时间进程和程度。锂刺激神经细胞产生这些代谢物的时间早于星形胶质细胞，除了13C-Glu呈相反趋势。锂增强了13C-乳酸、丙氨酸、柠檬酸和谷氨酰胺由星形胶质细胞产生，但不由神经元产生。对星形胶质细胞和神经元的这种差异效应可能有助于提高星形胶质细胞为神经元提供燃料底物的能力，以维持两种细胞类型之间的能量生产和Glu/Gln循环。
3.3.2使用13C-3-乳酸或13C-2,3-Ala作为假设驱动的示踪剂
由于锂增强了13C-Ala和13这些代谢产物是否被神经元利用，如果是的话，它们参与了哪些途径，仍然是个问题。为了解决这个问题，13C-3-乳酸（乳酸与13C标记在甲基碳上）和13C-2,3-Ala（Ala与13在甲基和甲硫氨酸碳上标记的C）被用作示踪剂，以探测锂对神经元通路的影响。补充材料中的图S7显示了1-D1H（H）-13用任一种锂治疗1天后神经元的C HSQC谱图13C-3-乳酸或13C-2,3-Ala作为示踪剂。
在培养1天后13C-3-乳酸133-乳酸、3-丙氨酸、3-谷氨酸、4-Glu、4-Gln、2,3-琥珀酸、3-Asp、2-Glu和2-Asp的C丰度比天然丰度（名义上为1.11%）显著提高(图S7A). 这意味着神经元不仅从培养基中摄取标记的乳酸，还将乳酸碳纳入克雷布斯循环代谢物中。乳酸代谢的主要汇是谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和琥珀酸（参见。表S3，补充材料). 这与乳酸可以作为神经细胞的能量来源的观点一致(Bouzier-Sore等人，2006年). 生长于13C-2,3-Ala，除了Glu是一个不如乳酸盐显著的汇点(图S7B). GC-MS对相同细胞提取物的绝对定量(;表S3)同意并补充了核磁共振分析。GC-MS分析还显示，细胞内标记的乳酸和天冬氨酸水平从第1天到第3天增加，而标记的谷氨酸在第3天基本消失（参见。). The transformation of13C-3-乳酸转化为13C-4-Glu，13C-2或3-琥珀酸，13C-2或3-Asp表示在转换13C-3-乳酸13C-2-Glu，13C-3-Asp，13C-1-或4-琥珀酸（在图S7A)将由补偿性PC活动引起(图S8B，补充材料).
氯化锂影响的GC-MS分析13生长于13C-3-乳酸。神经细胞生长于13C-乳酸标记在碳2或13C-Ala在碳2和碳3处标记为含有或不含LiCl的示踪剂。极性萃取和GC-MS分析如所述.13C类x个-代谢物是质量同位素x个 13碳，例如13C类1-Asp和13C类2-天冬氨酸13分别具有一个和两个的碳同位素13碳。每个值是重复样本的平均值
锂处理似乎对13C-3-乳酸代谢。图S7A说明了锂对附着在其上的质子峰值强度的相反影响13C-4-Glu和13C-2-Glu。增加13C-2-Glu强度表明PC活性增强，而13C-4-Glu强度可能由正向Krebs循环活动衰减到Glu阶跃引起（参见。图S8A). 这种相反的水平变化13Glu的C位置同位素不能从总量的定量中揭示出来13C标记的Glu(13C-Glu输入;表S3)和主要同位素(13C类1-Glu和13C类2-Glu输入; 表S3）。这里，这种对神经元通路的影响再次说明了需要详细了解13C位置同位素（除13Glu的C-质量同位素）。锂对PC活性的刺激与使用[U-13C] -Glc作为上述示踪剂。
从GC-MS分析中可以明显看出锂的第二个显著影响(). 锂减少了13C类2-第3天的谷氨酸，这可能是由于抑制13C-乳酸衍生谷氨酸通过前克雷布斯循环和/或减少标记谷氨酸的利用。Glu的主要吸收途径可能是Gln的合成及其释放到培养基中。我们发现13C-标记的Gln（参见。图S9，补充材料)在对照和氯化锂处理介质中。然而，锂并没有减少第3天标记的Gln的释放，因此这不是减少细胞内消耗的促因13C-葡萄糖。相反，锂显著提高了13C类1-第3天的天冬氨酸同位素()，加上13C-3-Asp和13C-2-Glu同位素(图S7)也可以用乳酸衍生的丙酮酸的羧基化增强来解释（参见。图S8B). 这种与乳酸相关的PC刺激和锂对Glu氧化的抑制表明，长时间的LiCl处理和细胞外乳酸的代谢可能会导致通过PC合成Glu，而不是出于能量目的的总氧化。
总之13C标记示踪剂和13通过核磁共振和GC-MS对培养的神经元和星形胶质细胞进行C同位素解析代谢组学（SIRM）分析，揭示了神经元和胶质细胞代谢的一些一致但出乎意料的特征以及它们之间的相互作用，总结如下：特别值得注意的是神经元中存在回补性吡咯酸羧基化。锂增强了两种细胞类型的糖酵解和PPP13核苷酸的乳酸、丙氨酸和核糖部分的C标记模式。此外，正如详细的13两种细胞类型中克雷布斯循环代谢产物的C标记模式。此外，锂促进星形胶质细胞释放燃料底物，这些底物被神经元积极代谢以产生能量和神经递质，星形胶质细胞刺激释放标记的乳酸和丙氨酸以及神经元的代谢就是证明。对这些代谢特征的分子调控的进一步研究将为情绪障碍的病理生理学和早期诊断标记以及有效治疗的新靶点提供新的见解。具体而言，我们计划利用其他示踪剂，如13C-标记Gln。我们还计划探讨氯化锂如何改变这两条回补途径的相互作用和分子调控。从这些细胞研究中获得的信息应该有助于设计和解释模型动物和人类受试者的全脑研究。
神经元和胶质细胞之间的代谢相互作用图。该图总结了SIRM揭示的神经元和胶质细胞代谢及其相互作用，并与文献一致。神经元和胶质细胞通过糖酵解代谢葡萄糖，Krebs循环产生神经递质Glu和能量（ATP）。在大脑激活过程中，神经元将谷氨酸释放到突触间隙，然后通过谷氨酸转运1（GLT1）将其转运到周围的神经胶质终末突起。谷氨酸一旦进入胶质细胞，就会通过谷氨酰胺合成酶（GS）转化为谷氨酰胺（Gln）。然后，胶质细胞释放谷氨酰胺，将其转运至神经元，并通过磷酸激活的谷氨酰胺酶（Glnase）转化为谷氨酸，从而完成谷氨酸/谷氨酰胺循环(Bittar等人，1996年;Haberg等人，1998年;Hyder等人，2006年;Magistretti，2009年;Patel等人，2004年). 锂刺激胶质细胞中的糖酵解和乳酸/丙氨酸的生成以及丙酮酸补体羧化（PC）。乳酸和丙氨酸最终被转移到神经元，用作ATP生成的氧化底物和/或谷氨酸合成的前体。从乳酸到谷氨酸的神经元途径包括乳酸到丙酮酸的转化，然后是丙酮酸脱氢酶（PDH）或克雷布斯循环中的PC途径，后者被锂增强。红色葡萄糖表示[U-13C] -葡萄糖，而绿色乳酸和丙氨酸代表13C-3-乳酸和13分别为C-2,3-Ala。块箭头指示运输过程。斜体文本表示酶或途径，红色箭头胶质细胞中的葡萄糖相关通路被锂激活橙色箭头在神经元中代表与乳酸和葡萄糖代谢相关的PC的激活。黑色、红色和绿色圆点分别描述神经元、突触裂和胶质细胞中的Glu
参与者信息
特蕾莎·W·M·范，美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心化学系，邮编40292。美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心结构生物学项目医学系，邮编40202。路易斯维尔大学化学系，2210 S.Brook St，348室John W.Shumaker Research Building，Louisville，KY 40208，USA，moc.liamg@nafmwt.
袁培雄，美国马里兰州贝塞斯达NIH国家精神卫生研究所分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室生物标记实验室，邮编：20892。
安德鲁·莱恩，美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心化学系，邮编40292。美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心结构生物学项目医学系，邮编40202。
Richard M.Higashi，美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学监管与环境分析代谢组学中心化学系，邮编40292。美国肯塔基州路易斯维尔市路易斯维尔大学詹姆斯·格雷厄姆·布朗癌症中心结构生物学项目医学系40202。
王云，美国马里兰州贝塞斯达NIH国家精神卫生研究所分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室生物标记实验室，邮编：20892。
阿纳希塔·哈米迪，生物标志物实验室，分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达，20892。
周如伦，美国马里兰州贝塞斯达NIH国家精神卫生研究所分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室生物标记实验室，邮编：20892。
泽维尔·吉塔特，美国马里兰州贝塞斯达NIH国家精神卫生研究所分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室生物标记实验室，邮编：20892。
陈光，美国马里兰州贝塞斯达NIH国家精神卫生研究所分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室生物标记实验室，邮编：20892。
侯赛尼·曼吉，美国马里兰州贝塞斯达NIH国家精神卫生研究所分子病理生理学、情绪和焦虑症项目实验室生物标记实验室，邮编：20892。强生公司，美国新泽西州提图斯维尔。
Rima Kaddurah Daouk，杜克大学医学中心精神病学系，美国北卡罗来纳州达勒姆3950号信箱，邮编：27710，ude.ekud.cm@100uddak.
