一氧化氮合酶亚型的亚细胞和细胞位置是健康和疾病的决定因素

摘要

介绍

自1987年以来，内皮衍生舒张因子被确定为一氧化氮[1,2]，许多报告表明，这种小气体分子一氧化氮是许多不同生物过程的普遍介质，例如血管舒张[三]、神经传递[4,5]，巨噬细胞介导的细胞毒性[6]、胃肠道平滑肌松弛[5]和支气管扩张[7]，通过各种下游途径(图1). 根据菲克扩散定律，一氧化氮的扩散系数为4.8×10⁻⁵厘米²在37°C的水中[8,9]与可比条件下的氧气相似[10]. 据估计，一氧化氮的半衰期在无血灌流豚鼠心脏中约为1s，在生理缓冲液中约为30s[8]. 根据这些半衰期值，扩散距离预计在120-700-μm范围内[8]. 在距离干扰素刺激的RAW 264.7巨噬细胞100至500μm处检测到一氧化氮，扩散半径为10至50个细胞（假设巨噬细胞平均直径为10μm）[11]. 因此，理论上，基于其扩散系数和培养细胞是一氧化氮扩散的代表性模型的假设体内，这种气体分子的影响可能扩展到其生产场所以外的许多细胞。

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图1

一氧化氮的生成和信号传递

NOS产生的一氧化氮激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）和颗粒鸟苷酸循环酶（pGC），并抑制细胞色素c氧化酶。cGMP激活cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）。如图所示，一些下游通路和细胞功能（灰框）与内源性cGMP的影响有关。cGMP的浓度可以通过磷酸二酯酶（PDE）的作用来控制。此外，一氧化氮可以通过蛋白质修饰影响其他途径（一氧化氮-金属加合物形成、S-亚硝化、硝化）。例如，复合物Vβ亚基中特定酪氨酸残基的硝化作用导致硝化应激或老化期间ATP酶活性降低[137,138]. 心钠素；PK，蛋白激酶（字母表示激酶的类型）；磷酸二酯酶；可溶性鸟苷环化酶；IRAG、IP_三受体相关cGKIβ底物；MLC磷酸酶（MLCP）；RhoA，cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）的底物；大电导率Ca²⁺-激活的K⁺（BKCa）通道。Hofmann等人之前对其他细节进行了描述[139].

然而，基于一氧化氮扩散半径的半衰期估计不适用于复杂的生物系统。限制一氧化氮扩散及其在生物系统中半衰期的因素包括其与可溶性鸟苷酸环化酶和其他蛋白质（如血红蛋白）、脂质和自由基的相互作用[11–13]. 例如，在隔离的大鼠主动脉中进行测量时，其在主动脉壁中的扩散比在均匀介质（如水）中的扩散小四倍[14]. 最近也有报道称，膜中的胆固醇含量使一氧化氮扩散减少了20至40%[12]. 这种下降归因于胆固醇引起的膜流动性变化。白蛋白存在时，活化巨噬细胞产生的一氧化氮流出量减少了41%，脂质体存在时减少了53-70%，表明细胞内结构或生物分子也可以限制一氧化氮的扩散[11]从而在细胞内建立一氧化氮的分区效应。

根据环境的不同，其他因素可能会影响一氧化氮的半衰期，从而影响其扩散。当活化的NOS2产生高浓度的一氧化氮，并且存在超氧化物阴离子时，过氧亚硝酸盐的形成将限制一氧化氮的扩散[8]. 此外，根据线粒体附近的氧梯度，细胞色素c（c）氧化酶可以成为一氧化氮的靶标，从而抑制线粒体呼吸[13].

除了一氧化氮从其生产场所扩散外，一氧化氮在极性介质和非极性介质之间的分配也可能在局部效应方面发挥重要作用[15]. 一氧化氮和氧在非极性介质中具有相似的分配系数，在疏水性介质中的溶解性是在亲水性介质中溶解性的70倍[16]. 因此，与极性环境相比，这两种分子更集中于疏水环境，如脂质体、脂蛋白、生物膜或蛋白质的疏水囊中[16,17]. 非极性环境中较高浓度的一氧化氮和氧气可能会导致化学反应，有利于形成化学性质不同于一氧化氮的氮氧化物[18,19].

一氧化氮在体内遇到扩散障碍以找到其靶点，一氧化氮介导的反应是细胞/组织特异性的，NOS亚型的存在及其在翻译前后的精细调节构成了一个必要条件实现其特定但多样化功能的条件。

鉴于这些论点，我们认为一氧化氮的全身效应源自特定器官中自分泌和旁分泌水平的累积效应。

一氧化氮合酶的异构体及其细胞特异性

一氧化氮由一氧化氮合酶（NOS）合成。一氧化氮的酶促合成由三种NOS亚型完成：神经元型NOS（NOS1）、内皮型NOS表1). 前两种酶的激活依赖于钙，而NOS2不依赖于钙[20]. 据报道，NOS1和NOS3是组成性表达的，而NOS2仅在免疫应答期间诱导[21,22]. 然而，最近的研究表明，NOS2在神经元中组成性表达[23,24]，肾脏[25]，肝脏[26]，肺[27]，冒号[28]和角质形成细胞[29]而NOS3在各种条件下（如运动）的表达水平高于本构水平[30]，雌激素刺激[31]，热疗[32]和剪切应力[33,34]. 因此，与最新的研究报告不同，NOS亚型的表达和活性似乎是细胞特异性的。在血管舒张的情况下，内皮细胞产生的一氧化氮扩散到平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶，从而引起血管舒张[20]即使两种细胞类型都有表达相同亚型NOS3的能力。这种差异归因于NOS3启动子的重甲基化，导致NOS3转录受到抑制，从而抑制小鼠主动脉血管平滑肌细胞（而不是内皮细胞）中一氧化氮的产生[35].

一氧化氮的合成及其随之而来的影响不仅取决于产生一氧化氮的细胞类型，还取决于细胞、器官和整个生物体在产生一氧化氮时所经历的特殊条件。例如，血管内皮细胞产生的一氧化氮通常是连续的，并且数量相对较少，有助于维持正常血压和血液内稳态[20]. 然而，在感染性休克期间，血管内皮细胞中诱导NOS2表达，进而释放高浓度的一氧化氮，这一过程与血管麻痹、持续低血压和失代偿有关[20,36,37]. 在另一个例子中，精氨酸酶（催化L-精氨酸生成L-鸟氨酸和尿素的酶）和二甲基精氨酸酶类的分布和表达会影响代谢控制的一氧化氮生成[38–40]、底物浓度有限（L-精氨酸）或瓜氨酸（二甲基精氨酸二甲氨基水解酶的竞争性抑制剂）的局部浓度[41])和不对称二甲基精氨酸（NOS1的非竞争性抑制剂K（K）_我=0.4微米[42];图2). NOS亚型与其他贩运蛋白在细胞和亚细胞水平上的相互作用也可能改变一氧化氮的命运[43–46].

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图2

NO的代谢控制生成

一氧化氮（NO）由L-精氨酸的一氧化氮合酶（NOS）产生。一氧化氮可以与特定靶点相互作用，如可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）和细胞色素c氧化酶（CCO），或与其他分子相互作用，例如超氧阴离子，从而触发硝化应激。高水平瓜氨酸（mM）抑制N个^G公司，N个^G公司-二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（Ddah），导致N个^G公司，N个^G公司-二甲基-L-精氨酸（ADMA）。反过来，ADMA是一种有效的NOS抑制剂。精氨酸浓度可以通过精氨酸酶的活性进行调节，精氨酸酶类催化L-精氨酸形成L-鸟氨酸（Orn）和尿素。另一个缩写：DMA，二甲基精氨酸。酶的名称用斜体表示。

我们的假设是，一氧化氮的分区生成和作用定义了其在病理生理学中的作用，因此，调节其局部生成可能是有效药物干预和理解病理生理学遗传差异的关键。这个假设基于这样一个事实，即细胞内一氧化氮生成的分区解释了其在不同临床条件下的不同功能和作用(图3).

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图3

NOS在肝脏、肝细胞和亚细胞区室中的定位

肝脏中存在NOS1、NOS2和NOS3。大鼠肝细胞中已显示NOS1([140]和Villanueva等人，2010年，提交了手稿）。NOS2和NOS3已在正常人肝细胞中得到证实[26]. NOS2存在于库普弗细胞中，而NO3存在于肝窦的内皮细胞中[26,141]. 在细胞内，NOS亚型位于不同的亚细胞隔室，如高尔基体、小窝或线粒体[94]. 在糖尿病等病理状态下，NOS1和NOS2可以从细胞质转移到细胞核（参见图4)和肝硬化[26]分别是。在细胞内，NOS产生的一氧化氮可与各种特定靶点（可溶性鸟苷酸环化酶、细胞色素c氧化酶）和其他生物分子（如脂类、蛋白质和碳水化合物）相互作用。

一氧化氮合酶在不同器官中的分区

在本节中，我们根据当前文献和我们小组的一些最新结果，介绍并讨论不同器官中NOS亚型的差异划分与临床示例的关系。

肝脏

在肝细胞中，一氧化氮可以由任何NOS亚型合成[26,73]. 各种细胞间的相互作用、氧的可用性以及不同程度地暴露于代谢副产物和由肠系膜或心脏循环提供的物质/底物可能会调节一氧化氮的产生和影响[26,74]在不同的肝细胞中取决于它们在肝脏中的定位。事实上，在主要由肝细胞组成的肝脏中，已知每个肝细胞的代谢功能和基因图谱取决于其位置[74–77]. 因此，我们假设NOS亚型的表达和一氧化氮的作用取决于细胞内酶的分区、细胞在器官内的定位以及酶表达的发育时间。我们还认为，测试和评估NOS亚型在门脉周围、小动脉周围、静脉周围或导管周围的表达是合适的，以更好地了解它们在肝脏中的不同作用和功能。此外，例如，来自NOS1的一氧化氮在门脉周围肝细胞中产生的作用可能因临床疾病的分期和类型而异。关于NOS1的表达，我们观察到，在实验性内毒素休克的晚期，NOS1主要在静脉周围肝细胞周围增加，而NOS1在所有类型的肝细胞中转移到细胞核，无论其在1型糖尿病器官中的位置如何(图4).

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图4

对照组、1型糖尿病组和内毒素治疗组大鼠肝脏NOS1的免疫组织化学研究

如免疫组织化学所示，对静脉周围区域的NOS1分布进行了评估（20倍；以红棕色显示）（Villanueva等人，2010年，提交了手稿）。箭头显示NOS1在内皮细胞（黑色）、肝细胞（白色）和枯否细胞（灰色）中的分布。在免疫染色过程中使用了兔NOS1多克隆一级抗体（来自Cayman Chemical Co.），随后进行了基于二氨基联苯胺的开发。在对照组动物中，NOS1表达仅在内皮细胞可见（对照组）。在1型糖尿病大鼠的相同条件下，肝细胞、内皮细胞和枯否细胞中存在NOS1。NOS1的核定位仅见于1型糖尿病大鼠的肝细胞（比较三组细胞）。内毒素动物（内毒素注射后5h）中NOS1阳性细胞数高于对照动物。

内毒素休克期间肝血循环的变化与肺血循环的变化相反[72]这是另一个可能由肝脏中NOS的差异分区引起的变化的例子。在休克的早期阶段，肝内脏循环（门静脉）受到限制，无法将血液流向肝脏以外的器官。在晚期，以多器官衰竭为特征的血管麻痹包括肝内脏循环[72,78]. 据推测，在失代偿性内毒素休克期间，这种血管麻痹主要是由于NOS2活性增加所致[20,36,79]. 在内毒素休克大鼠模型中，我们观察到NOS2表达增加，这与这些报道一致；然而，最相关的变化归因于NOS1的表达增加(图4)和NOS2（未显示）特异性存在于门脉周围和静脉周围肝细胞中。

一氧化氮合酶的细胞亚区化

鉴于一氧化氮在生物系统中的半衰期较短（见引言），以及细胞中特定位置对一氧化氮的需要，这种化合物的细胞内分隔对其信号转导活动至关重要[92,93]. 此外，如前所述，一氧化氮扩散受其与细胞内不同分子的相互作用的限制，因此NOS亚型的亚细胞位置影响一氧化氮扩散。通过空间调节一氧化氮的生成，进一步促进其特定靶向性，同时最大限度地减少副反应，如过氧亚硝酸盐的形成[94].

每个NOS亚型的表达都是细胞特异性的，在每个细胞内，每个亚型似乎都存在于特定的亚细胞隔室中。NOS亚型的修饰可以影响其亚细胞区隔化，研究最充分的例子是NOS3。共平移N个-NOS3的肉豆蔻酰化和随后的翻译后Cys棕榈酰化决定了其在高尔基体和小窝中的位置[95].

免疫组织化学显示，不同物种心肌细胞中三种NOS亚型的表达[96,97]. NOS1和NOS3的蛋白表达是结构性的，而NOS2的蛋白可由炎症介质诱导[97]. 最近，在NOS1中证明了NOS1和NOS3在心肌细胞中分区的重要性^−/−和NOS3^−/−老鼠。两组小鼠都出现了与年龄相关的心肌肥大，但只有NOS1^−/−小鼠患有高血压[98]. NOS3、β-肾上腺素能受体和L型钙通道位于心肌细胞小凹内，而NOS1靠近肌浆网[98]. 因此，两组小鼠的不同临床结果与心肌细胞内NOS1和NOS3的分区和蛋白质相互作用有关[98]. 众所周知，NOS1和NOS3对细胞内钙浓度有相反的影响，因此对收缩力的控制也有相反的作用。NOS3抑制β-肾上腺素能激动剂产生的钙内流（由L型钙通道介导），而NOS1促进钙从肌浆网流出。这些相反的作用似乎与酶的不同亚细胞位置有关，这些酶促进NOS3与小窝蛋白-3的蛋白-蛋白质相互作用，以及NOS1与赖氨酸受体的蛋白-蛋白相互作用[98].

线粒体中NOS1的调节受钙水平的影响[94]. 一氧化氮根据氧与一氧化氮的比率调节线粒体呼吸[94]，通过非竞争和竞争机制[92]. 可以想象，外层和内层膜的胆固醇含量不同可能解释了一氧化氮电极（用于评估一氧化氮从线粒体扩散）评估一氧化氮水平时观察到的差异或者通过氧化氧化肌红蛋白或其他血红蛋白（由于使用的浓度相对较高，它起到“一氧化氮陷阱”的作用），有效地与胆固醇竞争，也可能与其他生物分子竞争，例如细胞色素c（c）氧化酶。

一氧化氮合酶在细胞间的转移

如上所述，NOS亚型定位于不同的亚细胞隔室。然而，在给定刺激后，已知其中一些基因会改变位置，这表明发生了翻译后修饰，如磷酸化或易位激活，这是一个更复杂的过程，借助于特定的蛋白-蛋白质相互作用，如NOS3所述[43,44]. 如果一氧化氮在生物环境中扩散（阅读细胞)与水一样，除非寻求“局部”效应，否则不需要NOS易位。在病理生理条件下，细胞核中均观察到三种NOS亚型[99–103]. 鸟苷酰环化酶[104]，sGC的亚单位[105]、cGMP生产[105]、钙调素[106]和四氢生物蝶呤生物合成酶[107]也在核中检测到，这表明核产生一氧化氮并随后激活其下游靶点是可能的。

有人提出，NOS亚型对各种刺激的易位可以以不同的方式影响细胞，包括基因转录调控的变化、信号转导通路的激活/抑制以及通过蛋白质相互作用调节酶活性[43,44]. 例如，一氧化氮合酶相互作用蛋白（NOSIP）通过诱导NOS1和NOS3向细胞骨架中的肌动蛋白移位并抑制这些酶的活性，负向调节一氧化氮的生成[108–110].

基因转录调控

一些证据表明，一氧化氮生成的调节也可能发生在基因转录水平。例如，在一项研究中，NOS1在培养的前6天定位于大鼠皮层星形胶质细胞的胞浆中；然而，在7^第个d、 NOS1主要存在于这些细胞的细胞核中，伴随着核内一氧化氮的产生和NOS2蛋白表达的降低[104]. 这些结果表明，细胞核中NOS1的存在抑制了NOS2基因的转录[102].

在我们自己的研究中，我们发现，虽然所有三种NOS亚型都位于1型糖尿病大鼠肝脏肝细胞的胞浆中，但这些细胞的细胞核中只存在NOS1(图4). 在不同生物模型（内毒素休克）中进行的平行实验中，NOS1始终只在肝细胞的细胞质中检测到(图4); 1型糖尿病大鼠的胰岛素缺乏、高血糖或对氧化应激增加的反应可能是其肝细胞与内毒素休克大鼠之间检测到的差异的原因。有趣的是，在内毒素休克模型中，在LPS给药后1至6小时内，静脉周围肝细胞中NOS1主要增加(图4).

另一项有趣的研究在祖克进行fa/fa胡扯。棕色脂肪细胞的主要功能之一是通过解偶联线粒体产生热量，这一过程被称为不稳定产热。Zucker的这种功能受损fa/fa老鼠[111,112]. NOS2和NOS3均位于对照组和Zucker大鼠棕色脂肪细胞的细胞质和细胞核中[103]. 这个体内和在体外交感神经刺激非休眠产热增加了对照组和野生型Zucker大鼠脂肪细胞细胞核和细胞质中两种酶的表达和活性。然而，Zucker棕色脂肪细胞中的核定位NOS2蛋白减少，而非核定位NOS3蛋白减少fa/fa交感神经刺激后的大鼠。作者认为，NOS亚型的核定位可能为一氧化氮生成系统提供一个比胞浆更适合的亚细胞环境，使其发挥更为特异和有效的作用，尤其是密切控制棕色脂肪细胞的产热反应[103].

在用溶血磷脂酸（一种激活NOS3的G蛋白偶联受体激动剂）刺激的新分离大鼠肝细胞中，NOS3从细胞质转移到细胞核[100]. 一旦进入细胞核，NOS3通过一氧化氮的产生调节编码NOS2的基因的转录，该基因由核因子κB诱导[100,113].

信号转导通路的激活/抑制

NOS3主要表达于内皮细胞的高尔基体和质膜小凹[114,115]. 研究表明，血清饥饿增加了牛主动脉内皮细胞培养物中NOS3/小窝蛋白复合物的核周定位[116]. 如果将胰岛素添加到培养物中，NOS3通过Akt途径磷酸化，作为小窝蛋白棕榈酰化的反应，复合物转移到小窝；这种NOS3/小窝蛋白的结合抑制了NOS3的活性[117] (图5). 这种贩运与NOS3的磷酸化状态无关，这解释了在胰岛素存在下，无论NOS3磷酸化的持续时间如何，一氧化氮生成的持续时间都较短[116]. 在高脂肪喂养的小鼠中，胰岛素诱导的主动脉中NOS3磷酸化降低，这表明NOS3磷酸化可能在内皮细胞功能障碍中起作用，而内皮细胞功能障碍是肥胖和胰岛素抵抗的特征[118]. 因此，NOS3易位可能与血管舒张的调节有关。在另一个NOS3易位的例子中，内皮细胞与氧化低密度脂蛋白的孵育降低了一氧化氮的生成，这一事件与NOS3从小窝移向高尔基体有关[119]. 在内皮细胞中，NOS3在顺式-高尔基比在反式-高尔基体、线粒体或细胞核[120]. 基于对细胞器靶向NOS2结构的研究，还发现NOS2在顺式-高尔基体比任何其他细胞隔室[96]. 因此，可以得出结论，NOS3活性的提高是由于促进了细胞内钙库的获取顺式-正常条件下的高尔基体[120].

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图5

小窝蛋白在调节NOS3活性中的作用

Caveolin-1（CAV1）通过将蛋白质锚定在膜上，抑制某些蛋白质的活性，例如NOS3。在配体或机械刺激后，NOS3从CAV1中分离出来，使其能够接触到钙调蛋白（CaM）和90kD热休克蛋白（HSP90），从而产生一氧化氮（由卡弗和施尼泽改良[142]).

有趣的是，在脑豆状小动脉的内皮细胞（其病理恶化与中风有关）中，NOS3从基底表面向细胞核的移位与血管紧张素高血压大鼠一氧化氮生成减少有关，但在对照动物中没有[121]. 这一结果表明NOS3定位错误在血管紧张素依赖性高血压的内皮细胞功能障碍中起作用[115]. 其他人认为NOS3定位错误可能是由于氧化应激的增加[121,122].

酶活性的调节

在这里，我们介绍了有关酶活性调节的文献中的两个例子：一个是NOS对脂氧合酶活性的调节；另一个是关于NOSIP对NOS活性的调节。NOS3主要在人肥大细胞的细胞核中检测到，而NOS1主要定位于这些细胞的胞浆中[99]. 在用A23187（一种钙离子载体）或IgE/抗IgE激活肥大细胞后，胞浆NOS3被磷酸化并转移到细胞核，并且在这些细胞的细胞质和细胞核中都检测到一氧化氮。由于NOS3与5-脂氧合酶在细胞核内共定位，白三烯的形成受到一氧化氮供体的抑制，并受到一氧化氮合成抑制剂的刺激，作者认为，细胞核定位NOS3通过一种不依赖于cGMP产生的机制调节白三烯形成[99]. 与核内任何NOS亚型相关的效应是通过一氧化氮的产生还是通过蛋白质相互作用发生的，需要进一步研究。

NOSIP（一氧化氮合酶相互作用蛋白）在心脏、大脑和肺以及内皮细胞中表达[110]. NOSIP在细胞周期的G2期从细胞核转移到细胞质[108,109]. 通过与NOS1和NOS3相互作用[109,110]，NOSIP通过诱导NOS1和NOS3转位到肌动蛋白细胞骨架并抑制其酶活性来负调控一氧化氮的生成[108–110].

结论

尽管一氧化氮是一种小分子，在不同类型的细胞内的密闭隔间中产生，但其特定位置的影响在整个生物体内都能感受到。这种分子在生物体水平上的作用并不是半衰期长、稳定性高或自由扩散的结果，而是一氧化氮在不同细胞水平和不同细胞类型中局部作用的结果，调节和协调需要器官间相互对话的复杂反应[25,101,120,123–127]. 一氧化氮的产生取决于参与其合成的酶亚型的正确定位、这些亚型在不同条件下的亚细胞运输以及调节蛋白与NOS亚型的适当结合，以确保正确的生理功能[43,44,46,121,128]. 了解一氧化氮的复杂功能有一天可以帮助我们开发改进的诊断工具，并针对特定的NOS亚型和细胞区室设计新的预防或治疗策略。

致谢

缩略语清单

脚注

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