转录因子ZEB1(δEF1）通过抑制上皮极性的主调节器促进肿瘤细胞去分化

敲除蜗牛1不足以确定上皮特征

我们最近证明，与ZEB1不同，在一组20个乳腺癌细胞系中，Snail1的表达与E-cadherin的抑制没有密切关系(埃格尔等., 2005). 为了直接比较ZEB1和Snail1在MDA-MB-231细胞中的功能，我们通过siRNA处理消除了Snail1的表达。尽管蜗牛1的转录水平降低了约90%(图1a)，蜗牛1的下调不足以激活E-cadherin Crumbs3和HUGL2的表达(图1b和d). 因此，MDA-MB-231细胞仍然是成纤维细胞（数据未显示）。因此，ZEB1而不是Snail1控制MDA-MB-231细胞的上皮可塑性。

敲除ZEB1部分恢复上皮极性

ZEB1敲除后Crumbs3、HUGL2和PATJ的去表达也诱导了相应蛋白的强烈上调(图2a和b). 上调的Crumbs3和HUGL2在MDA-MB-231细胞的细胞质和质膜中积累(图2a). PATJ积聚在细胞核内，但未能定位于膜(图2a). PATJ与紧密连接的生物成因有关(米歇尔等., 2005;小腿等., 2005)，我们分析了ZEB1击倒后紧密连接的形成。在细胞接触部位检测到紧密连接标记ZO1(图2a)，表明PATJ可能在紧密连接形成的初始阶段是不必要的。总之，ZEB1消耗导致从头开始细胞极性蛋白的表达，它们部分移位到质膜，形成基本的外周紧密连接复合体。

在单独的窗口中打开

图2

细胞极性蛋白在ZEB1缺失时上调并部分重新分配到质膜。(一)Crumbs3（CRB3）、HUGL2、PATJ和ZO1在用非特异性（si-Control）或ZEB1特异性（si-ZEB1）siRNA处理的MDA-MB-231细胞中的免疫定位(b条)当ZEB1（si-ZEB1）被击倒时，Crumbs3（CRB3）和HUGL2蛋白水平上调。si-对照，非特定加扰si-RNA(c（c）)Crumbs3（CRB3）和HUGL2在E-cadherin表达的MDA-MB-231细胞（MDA-Ecad）中的免疫定位。(d日)模拟和E-cadherin转染MDA-MB-231细胞中Crumbs3（CRB3）、HUGL2和PATJ的转录水平。通过RT-PCR测定转录水平。MCF7细胞的转录水平作为阳性对照，肌动蛋白作为负荷对照。条形图英寸(一)和(c（c）), 10μ米。

异位E-cadherin表达不足以诱导上皮基因

E-cadherin在未分化癌细胞中的表达拯救上皮结构并影响几个信号通路(惠洛克和约翰逊，2003年). 由于E-钙粘蛋白上调是MDA-MB-231细胞中ZEB1下调的标志(埃格尔等., 2005) (表1,图1b和d)ZEB1缺失时观察到的基因表达变化可能是由E-钙粘蛋白水平增加间接引起的。为了解决这个问题，我们在MDA-MB-231细胞中稳定表达E-cadherin。在90%的细胞中，在细胞质中检测到E-cadherin(图2c，E-cadherin-1）和细胞无法形成明显的上皮特征(图2c，E-钙粘蛋白-1）。只有10%的细胞形成“上皮样”细胞簇，其中E-cadherin积聚在细胞-细胞接触部位(图2c，E-钙粘蛋白-2）。RT-PCR分析表明，ZEB1靶基因（Crumbs3、HUGL2和PATJ）的转录不受E-cadherin表达的影响(图2d). Crumbs3和HUGL2蛋白既没有上调，也没有重新分布，即使在10%表达E-钙粘蛋白的“上皮样”细胞中也是如此(图2c).

ZEB1直接抑制细胞极性基因的启动子活性

接下来，我们研究了ZEB1是否能直接抑制Crumbs3、HUGL2和PATJ的启动子。由于ZEB1通过与E-box元件（5′-CACTG-3′）的结合抑制转录(Grooteclaes和Frisch，2000年;埃格尔等., 2005)，我们筛选了Crumbs3和HUGL2的近端启动子区域是否存在E-box共识位点，并将相关片段克隆到报告结构中。对于人类Crumbs3，我们生成了三个跨越不同但重叠的启动子区域的报告结构（CRB3-prom 1-3，图3a)，覆盖约3.5 kbp（−3421至+74），包含20个E-box共识站点，主要排列在三个集群中(图3a). 对于HUGL2，生成了一个包含约900 bp片段和四个E-box共有位点的报告子结构（−743到+135）(图3c).

在单独的窗口中打开

图3

ZEB1直接抑制细胞极性基因的近端启动子。(一)Crumbs3启动子的方案。电子箱用黑色竖条表示。(b条)ZEB1和蜗牛抑制人类Crumbs3启动子。启动子片段的相对抑制（参见(一))图中显示了ZEB1和蜗牛1与空控制向量的比较。平均值来自四个独立的实验。横线表示标准误差。(c（c）)ZEB1和Snail1抑制近端HUGL2启动子（−743/+135）。启动程序方案中的黑色竖条表示电子盒的相对位置。(d日)上面板：ZEB1在染色质水平上与近端Crumbs3启动子相关。在ChIP实验中使用了ZEB1特异性（ZEB1）或无关山羊抗体（对照）。显示扩增的人类Crumbs3启动子片段（ChIP1，−282/−29；ChIP2，−924/−646；ChIP3，−2284/−2037）。中的插图(一)显示了扩增的Crumbs3启动子片段的相对位置。Crumbs3启动子在输入中的数量证实染色质的负载相等。下图：ZEB1（si-ZEB1）的敲低降低了ZEB1与Crumbs3启动子片段的相互作用。si-对照，非特定加扰si-RNA(e（电子）). 上面板：ZEB1在染色质水平上与PATJ启动子相关。图表示两个电子盒（黑色竖条）的相对位置以及ChIP中扩增的DNA片段（−335/−127）。下面板：与对照实验（干扰si-control）相比，siRNA（si-ZEB1）耗尽ZEB1导致PATJ启动子片段沉淀减少。

表达内源性Crumbs3和HUGL2的MCF7上皮细胞与报告质粒、ZEB1表达载体或空白对照载体和组成型质粒一起转染β-半乳糖苷酶表达质粒转染效率标准化。与对照组不同，ZEB1抑制了两个最接近的Crumbs3启动子片段CRB3-prom1（−1402/+74）和CRB3-porm2（−1958/+74）以及HUGL2启动子片段HUGL2-prom（−743/+135）的活性(图3b和c). ZEB1的表达对位于较远位置的Crumbs3启动子区（CRB3-prom3；−3421/−1402）没有影响(图3b). 蜗牛1的异位表达也抑制了这两个基因的启动子活性(图3b和c)但与ZEB1不同，Snail1优先抑制最上游启动子片段（CRB3-prom3；−3421/−1402）的活性。

测试ZEB1是否能直接与内源性启动子相互作用体内，我们进行了染色质免疫沉淀（ChIP）。根据报告分析，含有Crumbs3启动子的第一或第二近端E-盒簇的染色质片段被ZEB1抗体（Abs）有效地拉下(图3d，ChIP1和ChIP2），而位于最远端E-box簇的碎片在背景水平以上几乎无法检测到(图3d，第3章）。类似地，ZEB1与包含两个E-box共识位点的近端PATJ启动子发生物理相互作用(图3e). 为了证明特异性，我们在ChIP之前通过siRNA敲除ZEB1。降低ZEB1显著降低共沉淀Crumbs3和PATJ启动子片段水平(图3d和e; 下面板，siRNA-ChIP）。因此，ZEB1可以通过与定义的近端启动子片段结合，直接抑制Crumbs3和PATJ。

ZEB1增强细胞迁移潜能

接下来，我们进行了跨核迁移分析，以确定ZEB1的敲除是否也影响细胞运动在体外将用ZEB1特异性siRNA处理3天的MDA-MB-231细胞接种到Transwell过滤器插入物上，24小时后分析细胞通过孔的迁移。ZEB1缺失使细胞运动受损80%(图4a). 运动性降低不仅是E-cadherin上调的结果，因为E-cadherin在MDA-MB-231细胞中的异位表达几乎不影响运动性(图4b). 有趣的是，蜗牛1的缺失也影响了MDA-MB-231细胞通过过滤器的迁移(图4a)尽管它们保留了纤维母细胞形态。

在单独的窗口中打开

图4

ZEB1和蜗牛耗竭降低了MDA-MB-231细胞的运动能力在体外MDA-MB-231用对照或ZEB1和蜗牛特异性siRNAs处理3天，MDA-MB231细胞稳定转染空质粒或E-cadherin表达质粒，接种在Transwell过滤器插入物上，24h后通过Hoechst染色和荧光显微镜定量迁移细胞。

不同E-cadherin阻遏物的转录程序

与ZEB1一样，E-钙粘蛋白阻遏物Snail1、Snail2、SIP1和E47也调节上皮结构并诱导EMT(佩纳多等., 2004;德克雷恩等2005年b). 然而，这些阻遏物对EMT在发育和肿瘤进展中的具体作用尚不清楚。最近的微阵列研究首次揭示了这些蛋白在人类结肠癌或Madin–Darby犬肾细胞中的过度表达决定了特定的转录程序(德克雷恩等2005年;范德维尔等., 2005;莫雷诺-布诺等., 2006). 尽管使用了不同的细胞系和实验装置，但从四个数据集的概要中可以得出一些重要结论。首先，在E-钙粘蛋白阻遏物中，ZEB1对上皮特异性转录的负作用最强。其次，其他阻遏物都不能抑制细胞极性基因。第三，相关阻遏物ZEB1和SIP1可能调节不同组的连接基因。

有趣的是，Snail1并不总是足以抑制E-cadherin，正如DLD-1结肠癌细胞过度表达Snail1所证明的那样(德克雷恩等2005年a)在我们之前的研究中，发现Snail1的表达与人类乳腺癌细胞系中E-cadherin的抑制无关(埃格尔等., 2005). 在本研究中，我们表明，敲除Snail1不足以激活MDA-MB-231细胞中E-cadherin、Crumbs3或HUGL2的表达。然而，许多研究表明，Snail1对E-cadherin表达和上皮分化有负面影响(巴特勒等., 2000;卡诺等., 2000;帕尔默等., 2004;佩纳多等. 2004;佩纳等., 2005,2006). 此外，我们发现过表达的Snail1也影响Crumbs3和HUGL2启动子活性，这表明Snail1在乳腺癌细胞中影响这些基因的固有能力。因此，E-钙粘蛋白阻遏物的总体表达水平和辅因子的可用性可能决定靶基因的特异性及其对EMT、肿瘤进展和转移的最终影响(佩纳等., 2006).

报告者分析，RT–PCR

近端人Crumbs3启动子片段−1402/+74和−1958/+74被克隆到Nhe公司我/Sma公司我和萨克我/Sma公司pGL3-基本报告载体的I位点（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）分别将人类Crumbs3启动子片段−3421/−1402插入千磅我/Nhe公司I位点和人类−743/+135 HUGL2片段Mlu公司我/Xho公司I站点。瞬时报告分析按所述进行(埃格尔等., 2000).

RNA和cDNA的制备以及PCR分析如所述进行(埃格尔等., 2005)PCR引物见补充表1ZEB1和Snail1转录水平通过实时PCR测定，如埃格尔等. (2005).

抗体

使用了以下抗体：针对E-cadherin和ZO1的小鼠单克隆抗体（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）；兔多克隆Ab to Crumbs3，由Ben Margolis（密歇根大学医学院，密歇根州安娜堡，美国）提供；兔抗HUGL2多克隆抗体；山羊抗ZEB1多克隆抗体（ZEB-E20）和PATJ（美国加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司）；抗活性的-β-catenin Ab（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY，USA）；抗细胞角蛋白18的小鼠单克隆抗体和抗肌动蛋白的兔多克隆抗体（美国密苏里州圣路易斯Sigma）；次级抗体与Alexa Fluor 488偶联（Molecular Probes Inc.，尤金，俄勒冈州，美国）；德克萨斯红或过氧化物酶（Jackson Laboratories，West Grove，PA，USA）。

免疫荧光显微镜、免疫印迹和免疫组织化学

细胞固定在2.5%甲醛中（美国新泽西州怀特豪斯站默克公司），并进行免疫荧光显微镜检查(埃格尔等., 2000). 其他地方描述了总细胞裂解物的免疫印迹(埃格尔等., 2000).

从手术切除标本中获得福尔马林固定、石蜡包埋的大肠腺癌或乳腺导管和小叶肿瘤。肿瘤样本取自爱尔兰根纽伦堡大学病理研究所档案室和蒂罗尔帕斯OEG病理实验室Obrist和Brunhuber。结肠癌患者的年龄范围为45至65岁，乳腺癌患者的年龄为40至60岁。根据Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）的说明进行免疫组化。

染色质免疫沉淀

根据Upstate Biotechnology的ChIP分析试剂盒的说明进行ChIP分析(埃格尔等., 2005). PCR引物见补充表1.

RNA抑制实验

ZEB1和蜗牛1特异性siRNA实验如所述进行(埃格尔等., 2005). 从Ambion（美国德克萨斯州奥斯汀）购买了蜗牛1特异性siRNA(补充表1).

我们感谢维也纳分子病理研究所的Gabriele Stengl和Peter Steinlein进行流式细胞术（FACS）实验。此外，我们感谢Jürgen Pollheimer和Martin Knofler在跨核迁移分析方面的技术专长，以及Heidemarie Huber在免疫组织化学方面的支持。本研究由维也纳市Hochschuljubiläumsstiftung向AE（H-703/2005）提供的资金支持，由奥地利科学研究基金（FWF）第SFB 006号向RF（603）和HB（612）、SFB-F28号向WM提供的资助，以及由奥地利教育、科学和艺术部（奥地利基因组研究计划GEN-AU）向MS、WS、，NS、AW.AS得到了？AD-Pakistan奖学金项目的支持。