变构抗体抑制剂对赖氨酰氧化酶样2酶活性的调节

LOXL2蛋白的来源

重组人LOXL2购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。将LOXL2以0.96 mg/ml的浓度冷冻在25 m内米人工编码站，0.5米氯化钠，pH 6.5。纯度通过SDS-PAGE 4–12%BT用还原样品测量，并用简单蓝色安全染色法染色。通过Western blot分析和质量肽指纹图谱验证了身份。通过在还原条件下在SDS-PAGE 4–12%BT上运行500 ng LOXL2进行蛋白质印迹。然后使用iBlot设备将凝胶转移到硝化纤维素膜上。PBST中的5%脱脂牛奶堵塞了膜（10 m米磷酸钠，140米米氯化钠，0.05%吐温20，pH 7.4），在室温下摇晃1h。用PBST冲洗膜三次。用Arresto产生的抗LOXL2抗体在上述5%牛奶溶液中以1μg/ml抗体的浓度在室温下冲洗膜1h。用PBST清洗膜三次，然后用1:5000稀释度的抗鼠二级抗体在PBST中进行探测。在UVP（EC3）成像系统中使用ChemiGlow试剂对膜进行可视化。NextGen Sciences（密歇根州安阿伯）进行了质量肽指纹分析。简言之，如上所述，在SDS-PAGE上分离2μg重组人LOXL2并染色。将对应于～90和～60 kDa分子量的两条带切除并发送至NextGen进行分析。使用重组蛋白，无需进一步纯化。

活性LOXL3蛋白的来源

重组人LOXL3购自R&D Systems。将LOXL3以0.204 mg/ml的浓度冷冻在25 m内米人工编码站，0.5米氯化钠，pH 6.0。用SDS-PAGE 4–12%BT评估纯度，减少样品并用简单蓝色安全染色。

人LOXL2 SRCR结构域的构建与表达

组装了包含以下人类LOXL2 SRCR域的表达结构体：SRCR1、SRCR2、SRCR3、SRCR4、SRCR1-2和SRCR1-4。将每个片段克隆到pSecTag2hygro（B）载体（Invitrogen）中。用于克隆的片段是使用Platinum通过PCR产生的Pfx公司DNA聚合酶（Invitrogen）和pSectag2hygro-humanLOXL2作为DNA模板（由Arresto Biosciences生成），以及以下引物集和限制性内切酶位点：SRCR1，5′tatagctagccacacatggagagcctctgctcc-3′（NheI）和5′-tatactcgagcacacacacatc-3′（XhoI）；SRCR2，5′-tataggccccagccaaaaggattccggttc-3′（SfiI）和5′-statactcgatcacacacacaaccccg-3′（XhoI）；SRCR3，5′-tataggcccagcgctgcaggtctcagc-3′（SfiI）和5′-tataggcccgttgcatccaccagc-3’（ApaI）；SRCR4，5′-ataggcccagccctgccatggcttgc-3′（SfiI）和5′-tataggccggcggttctgagcaactc-3’（ApaI）；SRCR1–2，5′-tataaagcttcagtatgacagctgcccattac-3′（HindIII）和5′-statactcgagtccgatcgaggtctcag-3′（XhoI）；和SRCR1–4，5′-tataaagcttcagtatgacagctgcccattac-3′（HindIII）和5′-statactcgagcagcagcaactccccg-3′（XhoI）。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，8.8 ml Opti-Mem-I（Invit罗gen）中形成的转染复合物，使用175μl Lipofectamine和70μg DNA瞬时转染Hek293细胞，并将其添加到含有44 ml Dulbecco改良Eagle培养基的T175烧瓶中，浓度为90%。4小时后将转染培养基换成Dulbecco改良的Eagle's培养基加0.5%胎牛血清，72小时后收获细胞。细胞在37°C、5%CO下生长₂). 在非还原条件下，使用10μl纯条件培养基进行Western分析，并用抗pentaHis（1:500稀释度）单克隆抗体进行探测，验证其表达，然后使用1:5000的抗鼠HRP偶联物进行开发。在UVP（EC3）成像系统上使用ChemiGlow试剂对膜进行可视化。

人LOXL3和LOXL4 SRCR结构域的构建与表达

组装了包含以下人类LOXL3和LOXL4 SRCR结构域的表达结构体：SRCR1-2和SRCR1-4。使用以下引物和限制性位点生成表达载体并与LOXL2 SRCR片段一致表达：LOXL3 SRCR1–2，5′-tataaaagctttccccccttccacggccctg-3′（HindIII）和5′-tatagcggcgcgggatgcggacaggcctg-3’（NotI）；LOXL3 SRCR1–4，5′-tataagctttccgtccccttccacggccctg-3′（HindIII）和5′-tatagcggccccagacagagatagactccagcagcag-3′（NotI）；LOXL4 SRCR1–2，5′=ataggcccagcgccagtccactgggcaccact-3′（SfiI）和5′-tataggcggccttcggtgggaagtgaggcc-3′（NotI）；和LOXL4 SRCR1–4，5′-ataggcccagccccagtccactggccaccact-3′（SfiI）和5′-tataggcggcgctccatgcagagactc-3′（NotI）。

人LOXL1、LOXL3和LOXL4蛋白的表达和纯化

带有多组氨酸亲和标记的重组人赖氨酰氧化酶的构建物来自GeneCopoeia（Rockville，MD）。使用Lipofectamine 2000将所有三种构建体瞬时转染到Hek293细胞中，使用175μl Lipofectamine和70μg DNA在8.8 ml Opti-Mem-I中形成转染复合物，并在90%汇合处将其加入含有44 ml完全Dulbecco改良Eagle培养基的T175烧瓶中。4小时后将转染培养基换成Dulbecco改良的Eagle's培养基加0.5%胎牛血清，72小时后收获细胞。细胞在37°C、5%CO下生长₂.使用玻璃Dounce均质器在0.1中分离和均质细胞颗粒米Tris，2%十二烷基硫酸钠，pH 8.0，4°C。澄清后，丢弃可溶性物质，并在16 m内溶解所得颗粒米磷酸钠，8米尿素，5米米β-巯基乙醇，pH 7.8。细胞颗粒和增溶缓冲液的混合物在室温下摇晃45分钟，然后澄清。然后将可溶性部分加载到16 m平衡的Ni-Sepharose树脂上米磷酸钠和6米尿素，pH 7.8，在4°C下分批装订1小时。用16 m冲洗树脂米磷酸钠，6米尿素，20米米咪唑，pH 7.8。结合蛋白用16 m洗脱树脂米磷酸钠，6米尿素，0.4米咪唑，pH 7.8。洗脱物被广泛透析至16 m米磷酸钠，6米尿素，1米米二硫苏糖醇，pH 7.8。通过SDS-PAGE评估纯度。通过NextGen Sciences进行的质量肽指纹图谱评估纯化蛋白的身份。蛋白质浓度通过280nm处的吸光度测定，使用基于构建物氨基酸序列计算的消光系数(22).

人LOX的表达与纯化

从Open Biosystems（亚利桑那州亨茨维尔）购买了一种重组人LOX细菌构建物。DNA连接到pET20b（+）（Novagen）周质表达载体。在BL21（DE3）中进行转换。选择阳性菌落并在100μg/ml羧苄青霉素存在下生长。人类LOX在0.4 m诱导后表达为不溶性包涵体米1-硫代-β异丙基-d日-在600 nm波长下，吡喃半乳糖苷的光密度为0.6。收集细菌，用8米尿素，5米米β-巯基乙醇和16 m米NaPO公司₄pH值7.8。以14000 rpm离心分解30 min，然后将可溶性样品加载到16 m平衡的Ni-Sepharose树脂上米磷酸钠和6米尿素，pH值7.8，在4°C下分批搅拌1小时。用16 m冲洗树脂米磷酸钠，6米尿素，20米米咪唑，pH 7.8。结合蛋白用16 m洗脱树脂米磷酸钠，6米尿素，0.4米咪唑，pH 7.8。洗脱物被广泛透析至16 m米磷酸钠，6米尿素，1米米二硫苏糖醇，pH 7.8。通过SDS-PAGE评估纯度。通过NextGen Sciences进行的质量肽指纹分析来评估纯化蛋白质的身份。蛋白质的浓度通过280 nm处的吸光度测定，使用计算出的消光系数(22).

LOXL2片段His标签纯化

Ni-Sepharose树脂与0.1进行平衡米三氯化氢，pH 8.0。将条件培养基加载到平衡树脂上。加载后，用0.1清洗镍亲和柱米三氯化氢，pH 8.0，0.25米氯化钠和0.02米咪唑。用0.1进行洗脱米Tris，pH 8.0，0.150米氯化钠，0.3米咪唑。SDS-PAGE 4–12%BisTris凝胶在还原条件下对所有纯化样品进行操作，以确定纯度。然后在0.05中于4°C下透析纯化蛋白过夜米硼酸钠，pH 8.0。以BSA为标准，采用Bradford法测定蛋白质浓度。

数据分析

所有曲线拟合均使用GraFit 6.0进行。使用Microsoft Excel或SoftMax Pro对数据进行了处理或预处理。所有实验至少进行三次，平均值和标准偏差从至少三个独立实验中获得，每个实验至少进行两次。

过氧化物检测法测定LOXL2活性

通过将辣根过氧化物酶（HRP）活性与LOXL2偶联，并使用Amplex Red转化为resorufin作为读数来测量LOXL2的酶活性(23). 所有活性测定均在分子器件（加州森尼维尔）的SpectraMax M5上以动力学模式进行，激发波长为544 nm，发射波长设置为590 nm。在37°C下每隔30秒测量1小时。进度曲线的斜率，即每秒相对荧光单位（RFU），在线性区域内测定(24). 将RFU值转换为使用模拟运行产生的过氧化物的最终浓度，最终的终点RFU测量值用于构建标准曲线，以根据RFU读数反算过氧化氢的最终浓度。酶反应通过添加底物混合物（50 m米硼酸钠，pH 8.0，100μ米Amplex红色试剂，30 m米DAP或精胺和1×10⁻⁴%消泡剂204）添加到酶混合物（50 m米硼酸钠，pH 8.0，2单位/ml HRP，50 n米LOXL2和1×10⁻⁴%消泡剂204）。使用I型胶原作为底物的检测混合物的组成类似，但LOXL2的浓度增加到100 n米胶原蛋白在使用前根据制造商的指示进行聚合，并保持在冰上，直到添加到基质混合物中（见上文）。

底物滴定

迈克尔斯常数(K（K）_米)和k个_猫通过测量LOXL2在一系列底物浓度下的活性来确定。数据绘制为速率（初始速度）与底物浓度和适合方程式1，其中K（K）_米迈克尔斯常数，k个_猫是产品形成的一阶速率，E类_T型是总酶浓度，以及S公司是底物浓度。的产品k个_猫和E_T型是最大速度(V（V）_最大值).

集成电路₅₀决定

试验药物的抑制作用按以下方式进行。对于不可逆抑制剂BAPN，在上述底物溶液中对抑制剂进行稀释，并通过添加酶溶液开始反应。对于抑制性抗体，将抗体稀释系列与LOXL2或LOLX3在环境温度下孵育1小时以允许结合，然后通过添加底物启动反应。如上所述收集数据，并将观察到的速率绘制为抑制剂浓度的函数。IC₅₀通过将该数据拟合为四参数拟合（参见方程式2). 在哪里？年是观测速率，范围是拟合的非禁止值减去背景值，秒是斜率因子，“背景”是背景速率，以及x个是抑制剂的浓度。在抑制抗体的情况下只观察到部分抑制，因此报告的IC₅₀是外观IC₅₀观察到的影响的大小。

失活动力学

使用上述活性测定法，通过以下修改，测量BAPN对LOXL2的灭活作用。将含有BAPN的底物溶液与酶溶液（LOXL2为75n米最后）启动酶反应。进度曲线荧光与在37°C下监测时间3小时。然后将进度曲线拟合至方程式3，它描述了灭活过程中产品的形成，作为灭活率的时间函数(25),

哪里P（P）是产品，五_我是初始速度，k个_{光突发事件}是失活率，以及t吨就是时间。然后将失活率绘制为BAPN浓度的函数，并在GraFit中使用线性回归进行拟合，以获得斜率，即二阶速率常数k个_不正确的/K（K）_我.

稳态分析抑制模式

使用动力学方案（方案1）评估了本研究中药物的抑制模式，该方案不假设抑制模式。实验装置包括在不同浓度的抑制剂下进行底物滴定。然后使用以下方法对这些数据进行全局拟合方程式4给出与动力学方案（方案1）相关的值。α值为1是非竞争性抑制剂；小于1的值是无竞争性抑制剂，大于1的值则是竞争性抑制剂。K（K）_米迈克尔斯常数，K（K）_我是抑制剂的离解常数，S公司是底物浓度，我是抑制剂浓度，V（V）_最大值是最大速度，对于线性抑制剂，β通常设置为零，但在抑制抗体的情况下，允许β浮动，因为抑制效果只是部分和非线性的。

基于ELISA的结合分析

在4°C（100μl/孔）的硼酸钠缓冲液中用1μg/ml抗原涂布Maxisorp板过夜。第二天，用PBST（10 m）清洗板三次米磷酸钠，140米米氯化钠，0.05%吐温20，pH 7.4），并用BSA溶液封闭（10m内5%BSA米磷酸钠，140米米氯化钠，pH 7.4，200μl/孔），在环境温度下保持1小时。然后用300μl PBST清洗平板三次，将不同稀释度的抗LOXL2抗体（100μl）添加到封闭的平板中，并在室温下培养1小时。再次清洗平板，并加入二级抗体：100μl在0.5%BSA溶液中稀释的1:10000稀释的抗小鼠HRP二级抗体（在10 m中稀释0.5%BSA米磷酸钠，140米米氯化钠，pH 7.4），然后在环境温度下培养1小时。再次清洗平板，并使用100μl 3,3′，5,5′-四甲基联苯胺显影，使所得蓝色显影，但不要太浓。添加100μl的1米盐酸。注意不要超过1的光学密度。在450 nm的吸收模式下对SpectraMax M5进行定量。所有读数均在环境温度下。通过绘制吸光度值来确定解离常数与抗体浓度和数据拟合方程式5式中，PL是结合浓度，与吸光度读数成比例，L（左）是抗体浓度，B类_最大值是最大绑定，并且K（K）_天是离解常数。

表面等离子体共振结合

AB0023与LOXL2的结合亲和力是使用ProteOn XPR36仪器（加州Hercules Bio-Rad）测定的。将LOXL2固定在GLC传感器芯片上。GLC传感器芯片用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐和N个-按照制造商的说明制备的羟基磺基琥珀酰亚胺以30μl/min的流速流过芯片300秒。LOXL2以3μg/ml的速度在pH 4.5的醋酸盐缓冲液中流过芯片300秒钟，然后以30μl/min的速率流过芯片，芯片上未反应的部位用1堵住米乙醇胺以30μl/min的流速在芯片上流动300 s。使用相同的程序，通过在表面流动醋酸盐缓冲液来创建参考通道。这种固定化为LOXL2提供了约2000个响应单位的涂层密度。AB0023的稀释液以100μl/min的速度在表面流动150 s，并在该系列中加入缓冲对照。使用ProteOn管理器软件分析传感器图，并将数据拟合到软件中的Langmuir模型。数据表示四个单独实验的平均值和标准偏差。

抑制性抗体的产生

用人重组LOXL2免疫小鼠，以产生抗LOXL2抗体（抗体溶液，加州山景城）。杂交瘤文库由抗LOXL2抗体阳性的小鼠产生。使用上述ELISA分析筛选文库与LOXL2的结合。然后进一步筛选与LOXL2结合的抗体，以检测其抑制LOXL2酶活性的能力。AB0023是一种对LOXL2具有抑制作用的抗体。从类似的免疫接种中，我们确定了一种对人LOXL2催化结构域具有特异性的鼠单克隆，并发现它是一种优秀的Western blot试剂，用于本研究。

底物特异性

虽然LOX底物专一性之前已经过研究，但对LOXL2的酶活性知之甚少。为此，我们在37°C的硼酸盐缓冲液中使用HRP偶联分析法检测了LOXL2对三种不同底物（1,5-二氨基戊烷、精胺和纤维胶原I）的酶活性。图2图中显示了过氧化物生成速率与底物浓度的函数关系，数据符合Michaelis-Menten方程。在DAP或精胺存在下，最大速度(V（V）_最大值)几乎是一样的(图2)以及计算出的米氏常数(K（K）_米)，定义为达到一半最大活性的底物浓度为1.01±0.18m米DAP和1.05±0.32 m米用于精胺。纤维胶原在浓度增加时的粘度使我们无法完全确定速率曲线与胶原蛋白浓缩，从而提取k个_猫和K（K）_米胶原蛋白I作为底物的参数。尽管如此，当胶原以0.5mg/ml的最终浓度使用时，观察到对抗胶原I作为底物的活性。所有测试的底物也评估了它们对HRP的可能影响，单独使用HRP和在1mg/ml的存在下进行类似的实验米过氧化氢。当与该过氧化物酶单独培养时，DAP、精胺和胶原蛋白均未对HRP酶活性产生可测量的影响，以确保我们测量的活性是由于LOXL2酶活性而非HRP的次要影响。

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图2。

在底物浓度范围内测量1,5-二氨基戊烷（○）和精胺（●）的稳态酶速率。稳态值k个_猫和K（K）_米通过拟合数据测定DAP和精胺(线)Michaelis-Menten方程（见“实验程序”）。K（K）_米=1.01±0.18米米和k个_猫=0.015±0.001秒⁻¹DAP和K（K）_米=1.05±0.32米米和k个_猫=0.014±0.001秒⁻¹用于精胺。

BAPN对LOXL2的抑制作用

BAPN已被证明是赖氨酰氧化酶的不可逆共价抑制剂(15,16). 然而，有关BAPN对LOXL2酶活性影响的文献尚不明确。一些报告显示BAPN介导的LOXL2抑制(20)，而其他人认为它对LOXL2的活性没有影响(三,7,21). 我们发现，使用DAP或精胺作为底物，BAPN以剂量依赖的方式抑制LOXL2(图3). 将这些数据拟合为四参数方程，以获得BAPN的浓度，从而使活性降低50%（IC₅₀). BAPN抑制LOXL2，无论是DAP还是精胺用作底物。集成电路₅₀5.0±1.4μ米获得DAP和IC₅₀3.8±0.2μ米获得精胺。数据显示在BAPN的最高浓度下完全抑制。当纤维胶原I用作底物时，BAPN也抑制LOXL2（数据未显示）。

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图3。

底物为DAP（IC）的BAPN对LOLX2的抑制作用₅₀= 5. 0 ± 1.4 μ米)和精胺（IC₅₀= 3.8 ± 0.2 μ米).最终反应包含25 n米LOXL2，15米米DAP或精胺。数据标准化为“无抑制剂对照”

BAPN对LOXL2失活的动力学也通过分析“实验程序”中所述的抑制剂浓度范围内的进展曲线进行了研究。在不同底物浓度下对失活动力学进行了检查，以评估抑制形式。图4A类显示了使用DAP作为底物的BAPN对LOXL2的灭活率。观察到的失活率与BAPN浓度的增加呈线性关系，表明失活是由一个单步机制引起的(25). 随着底物浓度的增加，相对于较低的底物浓度，我们观察到失活率降低。中数据的斜率图4A类表示失活的二阶速率常数(k个_不正确的/K（K）_我).图4B类显示了这些速率对DAP浓度的依赖性。The decrease ink个_不正确的/K（K）_我表明BAPN的抑制方式与DAP相竞争。BAPN以前被证明是LOX的竞争性抑制剂(16)，我们观察到LOXL2的类似机制。

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图4。

LOXL2失活动力学。 A类当DAP用作不同浓度的底物时，失活率与BAPN浓度的依赖性的一个典型示例。给出了DAP的浓度。B类，二阶速率常数(k个_不正确的/K（K）_我)作为DAP浓度的函数。这个k个_不正确的/K（K）_我值是中数据的斜率A类。绘制的数据是重复数据的平均值误差线表示标准偏差。C类，表示灭活率与BAPN在不同精胺浓度下的函数关系的图。天，依赖k个_不正确的/K（K）_我精胺浓度。所示为重复次数的平均值误差线s是标准偏差。

我们还分析了用精胺作为LOXL2底物的失活动力学。图4C类显示了灭活率对BAPN浓度的依赖性。与DAP用作底物的情况一样，我们再次观察到BAPN失活率的线性依赖性，这表明失活是一种单步机制。二阶速率常数k个_不正确的/K（K）_我也随着精胺浓度的增加而减少(图4天)表明底物保护LOXL2免受抑制剂的灭活。