Semliki森林病毒复制复合体从质膜到修饰溶酶体的磷脂酰肌醇3-激酶、肌动蛋白和微管依赖性运输^{▿ †}

质粒构建物。

pSFV-ZsG质粒设计为含有与nsP3融合的ZsGreen荧光蛋白。通过PCR从pZsGreen质粒（Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA）扩增出ZsGrean序列，并在序列两端添加CTCGAG（XhoI位点）。将得到的PCR产物插入pSFV4感染性cDNA的XhoI位点和pSFV1复制子(33).

抗体和试剂。

兔多克隆抗nsP3已在前面描述(28). 抗双链RNA（dsRNA）的小鼠单克隆抗体J2购自Scicons（匈牙利）。抗α-微管蛋白和γ-微管素的小鼠单克隆抗体来自Sigma-Aldrich，Inc.（密苏里州圣路易斯）和BD Transduction Laboratories（加利福尼亚州圣何塞）的GM130抗体。Phalloidin-AF568和LysoTracker Red DND-99是从分子探针（Eugene，OR）购买的，以及带有AF488和AF568荧光团的二级抗体。

（−）-Blebbistatin、wortmannin、LY294002和PI-103购自Sigma。用于破坏微管蛋白的诺可唑来自Calbiochem（德国默克KGaA）。

病毒、生长曲线实验和药物治疗。

野生型（wt）SFV和SFV-ZsG是从前面描述的克隆cDNA中获得的(56). Sindbis病毒（SIN）类似地从Charles M.Rice赠送的cDNA克隆pTOTO1101中获得。为了测定生长曲线，BHK-21细胞在感染培养基（MEM+0.2%牛血清白蛋白[BSA]+2 mM）中感染10 PFU/细胞1 h我-谷氨酰胺），然后进行广泛清洗。加入新的培养基，并在图中所示的时间点取出100μl等分试样。​图3A。3A级.病毒滴度通过菌斑试验测定(23). 使用SFV-ZsG获得了抑制剂存在下的病毒生长曲线。BHK-21细胞以10倍感染率（MOI）感染1小时，然后清洗五次。添加含有相应药物的新培养基，并在图中所示的时间点取出100μl等分样品。​图7。7用收集的样本稀释液感染BHK-21细胞，并在感染后4 h（p.i.）用直接荧光法计数nsP3-ZsG阳性细胞的数量，从而获得病毒滴度。如前所述进行蛋白质印迹(30).

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图3。

SFV-ZsG在固定细胞和活细胞中的复制分析。（A） （上图）SFV-ZsG基因组示意图。突出显示ZsG序列的插入。（底部）将SFV-ZsG的生长曲线与wt SFV4病毒的生长曲线进行比较。BHK细胞感染10个PFU/细胞，每2小时取一等分样品，通过斑块试验测定滴定度（PFU/ml）。10小时后，对细胞进行裂解，并用抗nsP3抗体对样品进行免疫印迹分析，以验证是否存在融合蛋白nsP3-ZsG（如插图所示）。（B） 感染早期含有ZsG的RCs的PM定位。BHK细胞以500 PFU/细胞的速度感染SFV-ZsG，并在2 h p.i固定。使用抗dsRNA抗体（红色）确认复制复合物中存在ZsG。图中显示了具有代表性的共焦截面。左侧和中间面板中方框中的区域在右侧以较高的放大倍数显示，并显示dsRNA和ZsG信号的共定位。棒材，10μm（左和中）和5μm（右）。（C） 用相关光电子显微镜（CLEM）研究细胞底部的RCs。BHK细胞被SFV-ZsG VRPs（MOI，500）感染，在每次2小时30分钟时，用戊二醛固定细胞。（a） 用共焦显微镜对一个有代表性的感染细胞成像（插图为绿色）。用EM重新定位同一个细胞，并分析第一个水平截面（sec 1）。（b） 同一个细胞的高倍放大显示，细胞底部有大量球体。棒材，1μm。（c） 图b放大倍数更高，显示了与核衣壳不同的球状簇（白色箭头）（黑色箭头）。条形，200 nm。（D） 感染SFV-ZsG VRP的BHK细胞的活细胞成像（MOI，500）。LysoTracker（红色）显示细胞酸性室。在下午4小时用共焦显微镜拍摄图像。显示了整个单元的三维重建（参见材料和方法）。条形，10μm（左侧和中央面板）和3μm（最右侧面板）。

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图7。

抑制剂存在下的病毒复制。显示了SFV-ZsG在沃特曼或诺卡唑存在下的一步生长曲线。如图所示，每隔2小时取出释放的病毒，并用直接荧光法测定病毒滴度（见材料和方法）。（插图）相同抑制剂对SFV RNA合成的影响。感染的BHK细胞被脉冲标记为[^三H] 尿苷和标记RNA在TCA沉淀后通过闪烁计数进行测量。结果是两个独立实验的平均值；误差条表示SD。

为了安全起见，在活细胞成像中，使用病毒复制子颗粒（VRP）代替感染性SFV-ZsG。采用分裂帮助系统将SFV1复制子RNA包装到VRP中(52).

对于药物治疗，BHK-21细胞在感染介质中感染500 PFU/细胞20分钟；然后对它们进行广泛清洗，并添加新鲜培养基。根据实验情况，每次20分钟或1小时30分钟添加药物，细胞分别固定在每次2小时或4小时。为了破坏微管，从感染开始就添加诺卡唑。感染4小时后进行LY294002冲洗（2小时30分钟药物治疗），并将样品固定在每天8小时。

病毒RNA合成。

将BHK-21细胞在MOI为10的情况下感染wt SFV 1 h。在五次洗涤后，添加含有相应药物和2μg/ml放线菌素D的新培养基。未经处理或模拟感染的样本作为对照。每组重复的培养皿分别在每次4.5小时和5.5小时脉冲标记，每皿25μCi[^三H] 尿苷在放线菌素D（2μg/ml）存在下维持30分钟。样品用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，并用2%十二烷基硫酸钠（SDS）在65°C的PBS中溶解。标记的RNA在10%三氯乙酸（TCA）中的冰上沉淀1 h。沉淀物收集在玻璃纤维过滤器（GF/C；Whatman）上，并用5%的TCA洗涤两次[^三H] 尿苷通过液体闪烁（Optiphase Supermix；Perkin-Elmer）计数进行定量。

间接免疫荧光。

细胞在室温下用4%多聚甲醛在磷酸盐缓冲盐水中固定15分钟，用50 mM NH淬火₄Cl，并用0.1%Triton X-100渗透。样品在室温下与一级抗体孵育1小时，然后洗涤，再与适当的二级抗体孵育1小时。使用含有2.5%DABCO[1,4-二氮杂二环（2,2,2）辛烷；Sigma]的Mowiol 4-88（Calbiochem）来安装盖玻片。

显微镜。

固定样品使用徕卡TCS SP5立式共焦显微镜进行分析，使用HCX APO 63×/1.30数字孔径，并针对21°C甘油物镜进行校正。此外，使用带有20×/0.50 Ph1空气物镜的Olympus AX-70 Provis显微镜拍摄现场照片进行定量分析。照片由Photometrics SenSys风冷电荷耦合器件（CCD）相机使用AnalySIS程序收集。dsRNA成像的曝光时间始终设置为200 ms。

对于活细胞成像，细胞在0号玻璃底培养皿（MatTek，Ashland，MA）和补充有0.2%BSA，2mM的MEM中生长我-谷氨酰胺和20 mM HEPES（pH 7.4）用作成像介质。奥林巴斯IX71 TILL成像系统配有37°C腔室和CO₂使用UPlanSApo 60×1.20数值孔径水物镜对活细胞进行成像。以2帧/秒（2 Hz）的速率采集图像。Leica TCS SP2共焦显微镜，配有37°C腔室和CO₂使用HCX PL APO 63×/1.20数字孔径对活细胞进行成像，并对0.17-mm盖玻片水物镜进行校正。以800 Hz的速度进行双向扫描，进行活细胞记录；图像堆栈的采集速度为0.5或1帧/秒（0.5或1赫兹），如图图例所示。为了可视化细胞的酸性室，在成像前20分钟将LysoTracker添加到样品中，并在记录过程中出现。

对于相关的光电子显微镜（CLEM），细胞生长在2号玻璃底部P35G-2-14-C网格培养皿（MatTek）中。戊二醛固定后，使用徕卡TCS SP2共聚焦显微镜分析样品，使用HC PL APO 20×/00.7 CS空气物镜和HCX PL APO63×/1.2水物镜进行放大。为了可视化网格，将显微镜设置为反射模式。对于透射电子显微镜（TEM），如前所述，对化学固定和锇染色的细胞进行平包埋和超薄切片处理(46). 使用80 kV下操作的JEOL 1200 EX II透射电子显微镜进行成像。使用蔡司DSM 962显微镜进行扫描电子显微镜（SEM）。在成像之前，用六甲基二硅氮烷（Fluka）覆盖细胞单层（按照TEM处理），并在室温下干燥过夜。

RC定位的定量分析。

时间进程实验清楚地表明，RCs的定位遵循时间顺序：首先在PM，然后在小而分散的细胞质小泡中，最后在大的核周空泡中，前面描述的CPV-I(1,15,28,44). 我们的目的是利用旨在阻断这三个阶段中每一个阶段的RCs的抑制研究，系统地剖析这个“循环”的主要步骤。为此，根据dsRNA的定位，目视区分了三个主要表型组（见材料和方法）：早期（PM）、中期（PM和小胞质点）和晚期（核周区的大液泡）（图。​（图1E）。1E级). 在这项和进一步的抑制实验中，每个细胞使用500个PFU感染细胞，因为快速同步的感染周期允许进行较短的时间尺度的实验。当细胞暴露于不同的药物治疗时，为了避免非特异性效应，这一点很重要。在这些实验条件下，超过60%的细胞在1小时30分钟p.i.的PM处有较强的dsRNA染色。在感染过程中，RC定位向中间（2小时30分钟p.i.）和晚期（4小时p.i.）表型转移，支持了CPV-i代表RC贩运的最后阶段的观点，从下午开始。

RCs的PM内化需要I类PI3K的活动。

为了证明在修饰的内体和溶酶体表面发现的RC球状物来源于PM，对一组药物进行了阻止内化的能力测试。诱导肌动蛋白解聚的药物（例如latrunculins和细胞松弛素）不能用于长时间的实验，因为BHK细胞单层对此类处理非常敏感，并且在几分钟内脱落。微管破裂的耐受性更好，但不能阻止球体内部化。相反，它影响了RC细胞内贩运的后期步骤（见下文）。我们发现沃特曼宁是PI3K的一种有效且不可逆的抑制剂(5)，完成了在PM保留RC球体的任务。

在培养1小时30分钟后，用不同浓度的沃特曼素处理SFV感染细胞。在p.i.第4小时，固定细胞，并通过dsRNA免疫荧光标记显示RCs。治疗导致PM处的RC几乎完全堵塞（图。​（图2A）。2安培). 在对照实验中，沃特曼的存在并没有抑制依赖于氯氰菊酯的转铁蛋白的摄取，如先前报道的那样，转铁蛋白积聚在扩大的细胞质空泡中(55). 为了获得超微结构信息并估计球粒在PM的滞留程度，通过扫描电子显微镜对药物处理的感染细胞进行成像。结果证实，PM上覆盖着数千个聚集的球体（图。2Bb和c)与平行实验中未经处理的感染细胞的光滑外观形成对比（图。2亿). 沃特曼素诱导的RC在PM处的滞留是浓度依赖性的，即使在30 nM的条件下也可以获得明显的效果。另一个对照实验是用沃特曼素处理未感染的细胞。这些细胞再次显示出光滑的外观，证实沃特曼素本身不会诱导任何细胞表面结构（数据未显示）。定量免疫荧光分析显示，当使用100nM的浓度时，超过65%的细胞在PM处显示出强的dsRNA信号，即使在4小时p.i.（图。​（图2C），2摄氏度)，类似于RC在感染早期的定位。这些结果在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）和HeLa细胞中也得到了证实。值得注意的是，当在感染开始时（20分钟p.i.）添加沃特曼时，沃特曼并未干扰对RCs的PM靶向（未显示）；dsRNA阳性的RC仍然靶向PM，而在细胞质中检测到很少或没有信号。为了证实我们的结果，我们测试了另外两种PI3K抑制剂。I类PI3K的特异性抑制剂PI-103和低特异性抑制剂LY294002(5,24)使用了。将PI-103（200 nM）和LY294002（50μM）以1 h 30 min p.i.的速度添加，并在4 h固定细胞。结果与使用沃特曼的结果相当：绝大多数球体在PM处被阻塞（图。​（图2C）。2摄氏度). MEF和HeLa细胞也观察到类似的结果，表明这三种不同的细胞系中使用了相同的贩运路线。对于可逆抑制剂LY294002，我们还测试了去除药物的效果。在每次4小时取出抑制剂，并持续孵育至每次8小时。dsRNA染色证实，所有RCs在药物洗脱后内化，并在核周定位（数据未显示）。

使用SFV-ZsGreen跟踪活细胞中的RC。

为了监测导致RCs从PM进入活细胞核周区的事件，将珊瑚礁ZsGreen（ZsG）荧光蛋白与复制酶蛋白nsP3融合，构建了一种重组SFV（图。​（图3A）。3A级). 因为只有病毒蛋白nsP1具有膜结合活性(三,56)nsP3-ZsG与活细胞膜（以及固定样本中的dsRNA）的共定位表明其作为复制复合物的一部分存在。病毒生长速率和nsP3-ZsG融合蛋白的稳定性如图所示。​图3A。3A级nsP3-ZsG与dsRNA在固定细胞中的共定位证实了其参与复制复合体和感染早期PM的大量积累（图。​（图3B第3页).

为了确定nsP3-ZsG荧光信号是否可以作为一个准确的标记来追踪活细胞中的球体，我们使用了相关光电子显微镜（CLEM）(41,42). 这是一种最近开发的技术，通过该技术，感兴趣的细胞首先通过荧光显微镜成像，然后通过电子显微镜定位和分析（参见材料和方法）。BHK细胞感染SFV-ZsG VRPs（500感染单位[IU]/细胞），并在2 h 30 min p.i.下固定。为了仅显示膜结合的nsP3-ZsG，用共焦荧光显微镜对盖玻片附近的PM进行成像（图。3Ca公司，插图）。然后制备样品用于常规透射电子显微镜，并使用与盖玻片平行的第一部分进行EM成像。首先在低倍率下对感兴趣的单元格进行重新缩放（图。3Ca公司). PM这一部分的放大倍数更高，证实存在数千个球体（图。3Cb和c)达到最大密度>100/μm²（该区域的平均密度为74±41/μm²[范围，26至132/μm²]; 共有1156个球体在实验中被计数），水平切片显示与周围细胞质断开。

与wt SFV感染细胞的情况一样，在感染的后期，nsP3-ZsG定位于集中在核周区域的大液泡的限制膜上，并且LysoTracker阳性，这是酸性细胞器的标记（图。​（图3D）。三维). 值得注意的是，绝大多数细胞酸性液泡现在完全被nsP3-ZsG包围（图。​（图3D）。三维). 平行样品的EM分析证实了大量CPV-I的存在，每个CPV-I都含有数百个球体（未显示）。

RCs的细胞内动力学。

一旦确定重组SFV ZsG是一种合适的工具，就进行荧光活细胞成像。作为一个起点，我们使用了宽场成像，以获得RCs细胞内动力学的一般概述。

用500 IU/细胞的SFV-ZsG VRP感染BHK细胞。在这些条件下，nsP3-ZsG信号在2小时p.i时已经可检测到。加入LysoTracker以同时观察细胞酸性区室。在活细胞成像中，RCs似乎与非常动态的细胞器相关，这些细胞器显示不同类型的运动。在感染早期，最小的ZsG-阳性细胞内小泡在细胞外周更为丰富，并且与LysoTracker没有共定位。这些LysoTracker阴性小泡经历了多向短程运动（参见补充材料中的视频S1）。另一方面，含有RCs的较大囊泡始终呈酸性，长距离跳跃运动较少（见补充材料中的视频S2），并且在细胞质中经历了多次融合和裂变事件。相反，最大的酸性ZsG-阳性囊泡（CPV-I）是不动的，集中在核周区域（见补充材料中的视频S3）。

为了获得关于不同类型RC运动的更多详细信息，在共焦活细胞成像后进行粒子跟踪。在感染早期（每次2小时30分钟），非酸性RC携带者的快速多向运动（i型）占主导地位（图。​（图4A，4A级，轨道1至5），平均速度在0.3μm/s范围内（图。​（图4C，4摄氏度、轨道A1和D）。然而，这些囊泡的位移仍然很小（2.1±0.5μm），这表明存在基于肌动蛋白的转运机制(22).

另一方面，与酸性细胞器相关的RCs表现出不同类型的动力学（II型运动）。他们行走的距离>10μm（图。​（图4A，4A级，轨道6），显示峰值速度高达1.3μm/s（图。​（图4C，4摄氏度、轨道A6和D），类似于基于微管的运输(37). 这些II型运动一直持续到感染后期（每次4小时），导致酸性ZsG阳性细胞器的核周定位（图。​（图4B）。4B类). 此时，还可以看到第三种动态（第三种运动）（图。​（图4B，4B类，磁道1和2）。核周区被RCs（CPV-I）覆盖的大型酸性细胞器表现出非常静态的性质（图。​（图4C，4摄氏度、轨道B1和D；另请参阅补充资料中的视频S3）。

下午3小时发生融合事件，导致RC载体从I型到III型发生不同类型的动力学运动。中性小ZsG-阳性囊泡和较大酸性细胞器之间发生快速融合事件。这种类型的事件之后是向核周区域的定向运输（图。​（图4E，第四版，箭头；另请参见补充材料中的视频S4），代表II型运动。酸性ZsG-阳性细胞器之间的缓慢融合事件也可以检测到，导致大型细胞器逐渐失去其动力学（图。​（图4E，第四版，圆圈区域；另请参见补充材料中的视频S4），说明III型运动。这些结果表明了CPV-I的生物发生机制，其中RCs从中性小泡中的PM内化，通过多次融合事件传递到较大的酸性细胞器，并传递到核周区域。

在RC运输的早期阶段，需要完整的肌动蛋白-肌球蛋白网络。

肌动蛋白在胞吞和囊泡转运中起重要作用(16,54). 例如，在哺乳动物细胞中，这种细胞骨架成分参与了网格蛋白和小窝介导的内吞作用的不同阶段，尽管对调节这一过程的分子事件的完整描述仍然缺失。研究了肌动蛋白网络对RC贩运早期事件的贡献。如图所示。1天，用抗dsRNA抗体标记的RC不是随机分布的，而是在2小时30分钟p.i时强烈排列成条纹。这种现象是可重复的(44)当人们对附在盖玻片上的PM进行成像时，这一现象更加明显，其中肌动蛋白网络非常丰富。因此，感染的BHK细胞分别与抗dsRNA（或抗nsP3）和指骨样蛋白共染色，以观察病毒复制酶和肌动蛋白纤维之间的可能联系。尽管用指骨苷染色更强烈的应力纤维不能检测到共定位，但在2小时30分钟p.i.时，nsP3分布的条纹模式遵循肌动蛋白纤维的方向（图。​（图5A）。5A级). 这在放大倍数较高时尤其明显（图。​（图5A，5A级，最右侧面板）。微管在感染时未遵循RCs的条纹模式（未显示）。药理学抑制研究证实了肌动蛋白网络在RC贩运早期的作用。为了测试对肌动蛋白网络动力学的干扰是否影响了RCs的运动，我们使用了一种肌动蛋白运动蛋白肌球蛋白II的抑制剂，即blebbistin(26,57). BHK细胞被SFV-ZsG VRPs（500 IU/cell）感染2小时30分钟，然后在成像前暴露于抑泡素（30 nM）2或10分钟。令人惊讶的是，即使是最小的含RC-的囊泡也不动，如粒子追踪所示（图。​（图5B），5亿)与未经处理的细胞中囊泡追踪检测到的高度动态运动相反（对比图。​图4A）。4A级). 在图中。​图5C，5摄氏度报道了泡状抑制素作用2或10分钟后细胞囊泡运动的不同参数（与图中的值相比）。4C和D).

当在不含药物的情况下，允许RC在下午聚集1小时30分钟时，添加镇静剂会显著延迟RC的内化。即使在p.i.的4小时，许多细胞仍有强的PM染色，只有很少的小胞质点（图。​（图5D，第五天，dsRNA）。长期接触该药物导致肌动蛋白纤维解聚（图。​（图5D，第五天，肌动蛋白）。RCs的条纹图案始终丢失。定量分析表明，在这个时间点上，只有11%的细胞在含有布利司他丁的情况下具有晚期表型（图。​（图5E），第五版)相比之下，未经处理的样品中有65%。

RCs和肌动蛋白纤维的排列仅在感染早期检测到。此前有报道称，在晚期，SFV会导致肌动蛋白细胞骨架的破坏。这是由病毒蛋白nsP1通过未知机制引起的(29). 有趣的是，我们发现RC的定位与肌动蛋白破坏的阶段之间有很强的相关性（图。5A和F). 当RC仍然排列成条纹时，肌动蛋白纤维是完整的。当RC向内移动时，肌动蛋白开始被破坏。到p.i.第6小时，当所有复制复合物都定位于核周区域时，阴茎倍体染色无法检测到肌动蛋白纤维。相反，肌动蛋白阳性的非常显著的丝状伪足样延伸被诱导（图。​（图5F）。5楼). 综上所述，这些结果表明肌动蛋白仅在RC贩运的早期阶段发挥重要作用。

微管与CPV-I的生物发生。

共焦显微镜后的宽场活细胞成像记录和速度测量表明，RC载体的定向长距离运动与微管依赖性运输一致（图。4A至D，II型运动）(37,63). 此外，在p.i.第4小时，CPV-i系统性地聚集在中心粒周围，并以环状排列包围间期细胞中的高尔基体（未显示）。

为了研究微管的作用，在BHK细胞中加入诺卡唑（5μM）以及SFV或SFV-ZsG VRP（500 PFU/cell）会破坏微管网络，因为之前已经证明SFV的进入并不依赖于微管(59). 在肝细胞成像前20分钟，通过添加LysoTracker标记酸性细胞器。在p.i.第4小时，未经处理的感染SFV的细胞在核周区域显示出典型的大CPV-i模式（图。​（图6A）。6A级). 高倍镜和3D重建显示，nsP3-ZsG-标记的RCs实际上包围着CPV-I的酸性腔。平行实验中的EM分析证实了核周区域存在大量CPV-I，每个直径为400至600 nm，在界膜处有高密度的球体（见图。​图88了解不同感染阶段的RCs概述）。

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图8。

α病毒RC的运输和CPV-I的生物发生模型。在通过网格蛋白介导的内吞作用进入SFV后，低pH触发的融合释放核衣壳，病毒mRNA被翻译成多蛋白。蛋白质-RNA复合物通过未知机制（白色箭头）运输到PM。在PM，形成球状结构（步骤1），然后以PI3K（沃特曼抑制）和肌动蛋白（布利司他丁抑制）依赖性方式内吞。小的内化囊泡携带一些球状物（步骤2），发生许多同型融合以及与晚期内体的融合（步骤3[诺康唑抑制]）。这些较大的、酸性的、含RC-的小泡通过使用微管（诺卡唑抑制）被运输到核周区域，在那里完成稳定的大CPV-I的成熟（步骤4）。晚期囊泡的酸性由粉红色表示。，沃特曼；EE，早期内体；LE，晚期内体。模型右侧显示了RC贩运每一步的代表性EM图像。

在诺克唑处理的感染细胞中观察到完全不同的模式。RCs主要与未用LysoTracker染色的较小囊泡相关。这些小泡散布在细胞质中（图。​（图6B）。6亿). 一些酸性细胞器对nsP3-ZsG也呈阳性反应，但如3D建模所示，RCs仅表现为少数稀疏斑块，不再饱和这些增大的酸性液泡的限制膜（图。​（图6B，6亿，右侧）。在单独的实验中进行的EM分析证实了诺克唑处理的样品中存在两个群体的球形液泡。较小的液泡通常直径为250至350nm，在每次4小时时有许多球状物。；较大的液泡直径为600至800nm，在其限制膜上有稀疏的球体（未显示）。

共焦显微镜下RC运动的追踪显示，在诺康唑的存在下，上述II型运动受到抑制（图。​（图6C）。6摄氏度). 尽管微管网络被诺卡唑完全破坏，但在注射后2 h，RCs显示出PM定位，细胞底部的特征条纹与肌动蛋白纤维保持一致（未显示）。共聚焦成像还显示，大多数nsP3阳性结构对dsRNA呈阳性，表明诺可唑既不干扰PM的球状体形成，也不干扰RNA复制（通过dsRNA染色评估），也不影响病毒RNA复制复合物的内化（图。​（图6D）。第6天). 相反，诺卡唑影响了携带小球的内化小泡的进一步运输，导致其分散分布在细胞质各处。

综上所述，这些结果与基于微管的运动是将小球从中性小泡运输到酸性细胞器表面的机制这一模型相一致。在没有诺卡唑的情况下，这一过程最终形成典型的、大的CPV-I，并在近中心点区域积聚。

PM的阿尔法病毒RCs：积聚和内吞。

病毒感染期间的早期事件很难监测，因为RCs的初始数量很低。然而，甲病毒复制非常有效，目前的研究中使用了相对较大的病毒剂量（50-500 PFU/细胞）。我们首先在PM处检测到nsP和dsRNA。在p.i.45分钟时，那里出现了可辨别的信号，在1小时30分钟时很容易检测到（图。​（图1D）。一维). 使用CLEM，PM处荧光信号的持续积累在时间和地点上与许多球状物的出现相关（图。​（图3C）。3C公司). 这个实验和以前的研究(28)，进一步证实了这样的观点，即诱导的膜改变确实是dsRNA积累的位点，因此，dsDNA和球粒都可以用作RCs的标记物。从PM开始，我们使用表达荧光杂交蛋白nsP3-ZsG的重组SFV追踪活细胞中的RCs，并继续参考dsRNA染色和EM实验。nsP3似乎是RCs的良好标记。nsP3不含膜结合域；因此，它与贩运囊泡的联系表明参与了RC。特别是，当单独表达时，在PM中从未发现nsP3(49)代表了当前结果中RC形成的突出初始位置。

图​图88提供了我们结果的总体总结。在感染早期，即使没有抑制剂，球状物也大量存在于PM处，达到最大局部密度高于100/μm²。我们还没有研究新翻译的nsPs和初级RNA模板是如何在球体形成之前递送到PM的。球体成分可能通过细胞质中的被动扩散或主动运输到达那里。目前的数据表明，微管介导的转运和PI3K活性与PM处小球的形成无关，因为在感染的同时添加诺可唑或沃特曼不抑制这一过程。RCs首先在PM的积累可能延伸到整个α病毒超家族，因为在感染的早期阶段，感染SIN（另一种与SFV关系相当遥远的α病毒）的细胞也在PM强烈积累dsRNA和复制酶蛋白(17,32).

为了内化，膜质RC必须利用内吞过程。我们在整个研究过程中使用的术语“内化”在这种情况下可能并不完全准确，因为小球可以被视为细胞的内部结构。球体的内部始终通过开放的颈部与细胞质相连，球体的膜与PM及其内吞载体囊泡的限制膜连续（图。​（图8，8，步骤2）。就内吞作用而言，球体可被视为非典型货物。事实上，使用EM，我们的小组和其他人之前已经报道了PM过程中存在的球状物，其形态类似于内化阶段的内吞小泡(15,28). 我们发现，球粒从PM向细胞质的初级转移需要肌动蛋白-肌球蛋白网络的动力学（图。​（图5）5)以及I类PI3K的活性（图。​（图22).

通过改变细胞膜的磷脂酰肌醇组成(34)I类PI3K产生第二信使，在不同的细胞过程中发挥关键的调节作用，包括内吞、细胞生长和分化、凋亡、先天性和适应性免疫反应(20). 病毒已经进化出不同的策略来调节这些酶的活性，从而调节其生命周期中从进入和复制的不同步骤(39,47,53)调节宿主抗病毒反应(7,9). 这项工作是首次报道PI3K活化与病毒RCs定位相关的研究。值得注意的是，由于在感染的最初几个小时内，小球有时间在PM堆积，因此在内化阶段，I类PI3K可能需要由一个尚待表征的特定信号激活。在成纤维细胞中，细胞外配体（如生长因子或病毒）与其受体的结合导致一连串事件，导致PI3K活化和肌动蛋白重构相关蛋白的募集(38,58). 重要的是，这些事件会触发一个遍布整个细胞表面的全局激活信号。我们的结果与肌动蛋白和PI3K参与α病毒RC内吞作用一致。

由此产生的一个问题是，哪组分子触发了PM中球体的内化，以及nsP在这一过程中扮演什么角色。在细胞培养物中表达不同ns多蛋白的研究表明，nsP3至少包含一些将复制酶多蛋白从PM转移到内体表面所需的信息，因为多蛋白P12只存在于PM中，而P123也存在于内体中(49). 推测性解释是，α病毒可能已经进化出一种通过首先在PM积累其RCs来激活PI3K信号通路的方法。我们的进一步研究特别关注PM的分子事件特征和用于球体内化的内吞途径（未发表的数据）。

我们感谢Johan Peränen和Marja Makarow对原稿的批判性阅读，感谢Andres Merits提供质粒pSFV4-ZsG。我们感谢Pekka Lappalainen和Maria Vartiainen好心地提供试剂和建议。我们感谢Mervi Lindman在EM实验中提供的技术援助。

这项工作得到了芬兰科学院（127214笔赠款）和Sigrid Jusélius基金会的支持。P.S.得到了Viikki分子生物科学研究生院的奖学金支持，G.B.得到了Emil Aaltonen基金会的部分资助。