Pref-1（也称为Dlk1）被合成为一种表皮生长因子（EGF）重复包含的跨膜蛋白，ADAM17/肿瘤坏死因子α转换酶（TACE）介导的裂解产生与其胞外结构域相对应的可溶性形式的Pref-1(34). Pref-1在前脂肪细胞中高度表达，但在分化为脂肪细胞的过程中其表达被消除。Pref-1在脂肪生成中的抑制作用已被充分证明在体外(15,17,18,25,28,30). 前脂肪细胞中Pref-1的过度表达或用可溶性Pref-1治疗会抑制脂肪细胞的分化(25,27,29,30). 相反，通过转染Pref-1反义序列降低Pref-1水平可大大增强脂肪细胞分化(26). 我们还发现，只有大可溶性形式的Pref-1，而不是膜形式，抑制脂肪细胞分化(17). 在这方面，从母体和胎儿循环中鉴定出人类Pref-1的可溶性形式，称为胎儿抗原1（FA1）(10). Pref-1在脂肪生成中的功能也已被证实体内小鼠Pref-1基因的缺失导致肥胖增加，脂肪细胞分化程度更高，脂肪细胞标记物表达增加(18). 相反，在脂肪组织或肝脏中过表达可溶性Pref-1的转基因小鼠显示出肥胖显著减少，脂肪生成和脂肪细胞标志物表达减少(15,33).
虽然Pref-1在脂肪细胞分化中的抑制作用已经得到了很好的证实，但直到最近，Pref-1的信号通路还没有被阐明。通过使用来自Pref-1缺失胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中的可溶性Pref-1，我们发现Pref-1激活MEK/ERK通路以抑制脂肪细胞分化(12). 我们还证明，在抑制脂肪细胞分化的过程中，Pref-1激活MEK/ERK上调Sox9，Sox9是一种已知参与软骨形成和骨形成的高迁移率组（HMG）盒DNA结合转录因子(35). 我们确定Sox9直接结合C/EBPβ和C/EBPδ的启动子区来抑制它们的转录，从而抑制脂肪细胞分化。其他人将Notch牵涉到Pref-1功能中，或对抗或增强Notch(三,13). 然而，这些关于Notch可能参与Pref-1功能的相互矛盾的表型观察并没有在分子或生化相互作用研究中进行。无论如何，除了脂肪生成(25,27,30)，Pref-1可能影响许多组织的分化过程，包括软骨生成、骨生成(32,35)和神经内分泌分化。与成年人不同，Pref-1主要在前脂肪细胞和某些神经内分泌细胞类型中表达，Pref-1在胚胎发育期间存在于多个组织中。事实上，我们已经证明，Pref-1引导间充质细胞进入软骨生成谱系，但抑制分化为成熟软骨细胞和成骨细胞的分化(35). 在这方面，Pref-1由位于小鼠12号染色体印迹区的父系表达基因编码。Pref-1缺失和Pref-1过度表达转基因小鼠的缺陷分别与小鼠中的母系单亲二体12（UPD12）和父系UPD12以及人类中的一些共有母系和父系的UPD14综合征相似。已知印迹基因的作用，预测Pref-1在胚胎生长发育过程中至关重要。
纤维结合蛋白是细胞外基质（ECM）的主要成分。纤维结合蛋白通过C末端二硫键形成二聚体，也可以进行纤维生成。纤维连接蛋白包含三种类型的重复模块，即类型1、2和3。纤维连接蛋白可以通过与各种N末端结合域的相互作用，结合其他ECM成分，如胶原蛋白、纤维蛋白原和核心蛋白(36). 因此，纤维连接蛋白被认为是ECM生物发生的主要组织者。纤维连接蛋白与细胞表面受体整合素相互作用，整合素介导内外信号，组织细胞骨架和转导信号，以响应ECM的附着。不同类型的整合素作为纤维连接蛋白和其他ECM成分（如层粘连蛋白）的受体发挥作用。经典纤维连接蛋白受体α5β1整合素的激活导致许多激酶的酪氨酸磷酸化，包括级联早期的FAK/Src以及Rho-GTPases的激活和下游的MAPK，从而影响细胞形状、迁移、生长和分化(9,24,38). 纤维连接蛋白除了通过与整合素的相互作用来传递信号外，还通过结合特定的生长因子将其呈现给细胞并与其同源的生长因子受体整合信号，在生长因子信号传递中发挥重要作用。在3T3-L1细胞分化为脂肪细胞的过程中，纤维连接蛋白水平降低，而层粘连蛋白水平升高(1,24). 整合素类型的表达也存在转换，从纤维连接蛋白结合α5β1整合素到层粘连蛋白结合α6β1整合素(16). 在这方面，在纤维连接蛋白涂层的培养皿上保持前脂肪细胞已被证明可以防止脂肪细胞分化，而添加截短的纤维连连接蛋白片段可以增强脂肪细胞分化(11). 小鼠体内纤维连接蛋白的消融导致严重的中胚层、血管和神经管缺陷，导致胚胎发育早期死亡，并对脂肪生成产生影响体内或在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中在体外脂肪细胞分化无法研究(6). 因此，调控脂肪细胞分化的纤维连接蛋白-整合素信号传导尚未得到很好的研究。
在这里，我们确定纤维连接蛋白是一种Pref-1相互作用蛋白。我们表明，Pref-1的抑制作用至少部分是通过Pref-1与纤维连接蛋白的C末端区域结合，后者反过来激活整合素信号，从而导致MEK/ERK激活和脂肪细胞分化的抑制。
材料和方法
质粒构建和蛋白质纯化。
通过将Pref-1近膜结构域（氨基酸[aa]246至311）亚克隆到Gal4 DNA结合结构域下游酵母pAS2载体（Clontech）的NdeI和BamHI位点，产生pAS2-Pref-1JM构建物，生成酵母双杂交筛选的诱饵质粒，没有显示报告基因的自身激活lacZ公司或他的3在酵母L40菌株转化后。Pref-1EC、Pref-1EC-HA、Pref-1-hFc和Pref-1JM-HA的表达载体是通过将与血凝素（HA）或人Fc（hFc）融合的Pref-1胞外结构域和Pref-1近膜结构域亚克隆到pcDNA3.1中而产生的。分泌型52-kDa Fn片段（52Fn）是通过将Fn片段的序列插入带有Myc-tagged pSecTag2载体（Invitrogen）N端信号序列的框架中的HindIII和DraIII位点而生成的。将FnI和FnII亚克隆到pSecTag2载体的HindIII和DraIII位点，其中分别含有52Fn的N末端一半到II型重复序列15末端和52Fn C末端一半。Notch以及Jagged1和Dll 1的表达质粒来自Raphael Kopan（华盛顿大学医学院）和Gerry Weinmaster（加州大学洛杉矶分校）。显性阴性Rac的表达质粒来自Addgen。Pref-1-hFc的哺乳动物表达和纯化已在前面描述过(12).
酵母双杂交筛选。
利用pGSD10载体（Stratagene）中11天龄小鼠胚胎cDNA文库进行酵母双杂交筛选。酵母菌株L14依次用pAS2-Pref-1JM转化，然后用来自小鼠胚胎cDNA文库的2μg DNA转化。通过在含有3氨基-1,24-三唑（3-AT）的合适酵母最小培养基SD/Trp/Leu/His平板上生长和通过过滤提升试验检测β-半乳糖苷酶活性来选择双转化子。诱饵和猎物结构通过电穿孔引入大肠杆菌生长在LB-氨苄青霉素平板上。对质粒DNA进行测序以进行验证。
体外转录-翻译和在体外结合。
通过将片段亚克隆到pcDNA3.1（+）中，构建了HA标记的Pref-1JM（Pref-1JS-HA）和52Fn猎物表达质粒。这些构造用于在体外在场的转录和翻译[35S] 使用T7-TnT快速耦合系统（Promega）的蛋氨酸和半胱氨酸（>1000μCi/nmol）（Amersham）。对于在体外结合实验，10μl35S标记的52Fn蛋白和Pref-1JM-HA在4°C下与Pref-1JS-HA在含有20 mM Tris-HCl、pH 8.0、150 mM NaCl和0.1%吐温20的缓冲液中孵育过夜。将预先装配有抗-HA抗体的蛋白G珠添加到额外的孵育中2 h。珠在同一缓冲液中清洗四次，然后在2×SDS样品缓冲液中再次悬浮。经增强剂（Amersham）处理后，通过SDS-PAGE分离的上清液中的蛋白质通过荧光成像进行可视化。
远西分析。
人225-kDa-Fn（225Fn）（Sigma）、110-kDa Fn（110Fn）和40-kDaFn（40Fn）片段在7%SDS-PAGE上进行解析，并转移到硝化纤维素膜上。在室温下用含1%牛血清白蛋白（BSA）的Tris-buffered saline-Tween 20（TBST）封闭膜1小时。将细胞膜与从COS-7细胞中收集的无血清条件培养基孵育，该培养基转染了Pref-1JM-AP（在插入AP-4载体的C末端融合到人胎盘碱性磷酸酶的Pref-1旁膜结构域）或Pref-1EC（Pref-1胞外结构域），在室温下孵育2小时。用TBST清洗三次，每次5分钟后，在室温下用Pref-1多克隆抗体（1:5000）培养1小时，然后用TBST冲洗三次，然后用辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG或HRP结合的抗AP抗体培养。信号由增强化学发光检测系统（Perkin-Elmer）检测。
表达质粒和siRNA的转染。
使用Lipofectamine 2000瞬时转染70%至80%融合细胞。转染72小时后，收集条件培养基或细胞。通过转染单个质粒并用200μg/ml G418处理转染细胞10天，产生稳定表达显性阴性Rac与绿色荧光蛋白（GFP）和对照GFP融合的3T3-L1细胞。转染剂池用于实验。将纤维结合蛋白小干扰RNA（siRNA）、Notch1 siRNA或20μM的对照siRNA在siRNA转染培养基（Santa Cruz）中转染90%融合的3T3-L1细胞。转染细胞在转染后6小时保存在含有10%胎牛血清（FBS）的新鲜培养基中。
免疫沉淀和蛋白质印迹。
将100μl纯化Pref-1EC-HA（0.5μg）等分样品与0.3或1.0μg纤维连接蛋白或其他纤维连接到蛋白片段在4°C的20 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl、0.5%Triton X-100和10μM苯甲基磺酰氟（PMSF）中孵育3 h。在用正常兔IgG和蛋白G珠预处理后，用兔Pref-1多克隆抗体和蛋白G加珠免疫沉淀可溶性Pref-1EC-HA蛋白。然后用相同的缓冲液洗涤珠子三次，并将其重悬于2×SDS样品缓冲液中。煮沸5分钟后，将上清液分离到7%SDS-PAGE上，并转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）上。用牛奶封闭后，用兔多克隆Fn抗体（Santa Cruz）或抗HA抗体（Covance）孵育细胞膜2小时。用TBS和TBST冲洗细胞膜，然后用二级抗体、山羊抗兔抗体或与HRP结合的抗鼠IgG孵育。通过增强化学发光检测信号。
3T3-L1细胞培养和脂肪细胞分化。
将融合后的3T3-L1细胞在含有10%FBS的Dulbecco改良基本培养基（DMEM）中用1μM地塞米松（Dex）、0.5 mM甲基异丁基黄烷（MIX）和5μg/ml胰岛素处理3天。该培养基含有75%的条件培养基，从转染了所示表达载体的COS-7细胞中收集。3天后，在拍照或采集RNA提取用于脂肪细胞标记物表达分析之前，将细胞在不含药物的相同培养基中再保存3天。油红O染色及其定量已在前面描述过(12).
RT-PCR和RT-qPCR。
使用TRIzol试剂（Gibco-BRL）分离总RNA。用1μg总RNA进行反转录（RT），通过半定量PCR扩增Pref-1、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPARγ2）、脂肪酸合成酶（FAS）、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白（aP2/FABP4）、Sox9、，以及脂肪细胞特异性分泌因子（ADSF）/抵抗素。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为对照。RT-PCR中使用的引物对如前所述。产品在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭染色进行可视化。采用ABI PRISM 7900序列检测系统（PE Applied Biosystems）进行RT-qPCR，以GAPDH为内对照，定量分析各基因的相对mRNA水平。使用TaqMan基因表达分析扩增了各种基因的cDNA，该分析由预先制备的未标记PCR引物和标记有6-羧基荧光素（FAM）染料（PE Applied Biosystems）的TaqMan-MGB探针组成。前面描述了各种引物和探针(35). qPCR的统计分析使用2−ΔΔ计算机断层扫描方法，该方法计算了归一化为内源性参考物（GAPDH）的靶基因表达的相对变化，以及相对于作为对照组的校准物的相对变化。
统计分析。
数据表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。平均值的统计差异由Student’st吨测试。所有实验至少进行了两次，并显示了具有代表性的数据。所有扫描图像均通过NIH图像软件进行量化。
结果
Pref-1既不与Notch相互作用，也不需要Notch来发送信号。
从结构上看，Pref-1的EGF-like重复序列不包含EGF受体结合所需的保守氨基酸残基，但与涉及细胞信号传递和细胞命运决定及分化的类EGF-like-repeat-containing蛋白质的Notch/Delta/Serrate（Jagged）家族有相似之处。然而，Pref-1缺乏DSL（Delta Serrate Lin12）结构域，该结构域在所有Notch配体中都是保守的，用于受体与相互作用(14). 然而，Pref-1与Notch信号联系在一起，其作用是相互矛盾的：据报道Pref-1可以增强或对抗Notch信号黑腹果蝇或秀丽假丝酵母分别为(三,13). 此外，Notch也被报道在脂肪细胞分化中介导Pref-1功能(2). 为了了解Notch是否参与Pref-1功能，我们首先测试了可能的Pref-1-Notch交互在体外我们将Notch1的表达载体与HA-标记的Delta1（Dll-HA）作为阳性对照，将不相关的HA-标记去胡桃苷（去胡桃素-HA）用作阴性对照，或生物活性的HA-标签Pref-1胞外结构域（Pref-1EC-HA）共转染（图。，左）。用HA-agarose进行免疫沉淀，然后用抗Notch抗体进行免疫印迹，清楚地检测到Notch和Dll之间的强烈相互作用。相反，与非亲缘蛋白去胡桃素类似，Pref-1与Notch的共转染并未显示出相互作用（图。，右侧）。
Pref-1不与Notch相互作用，也不需要Notch进行信号传导。（A） 将COS-7细胞与Notch、Dll-HA、去胡桃素-HA和Pref-1 EC-HA共转染。细胞裂解物用对照IgG或抗-HA琼脂糖珠进行免疫沉淀（IP），然后用抗Notch抗体进行Western印迹。（B） 用1μMγ-分泌酶抑制剂L-685458（Tocris Bioscience）处理3T3-L1细胞24小时，血清饥饿4小时，然后用50 nM hFc或Pref-1-hFc处理15分钟。使用抗磷酸化ERK1/2进行Western blotting，显示总ERK1/2抗体。用对照或Notch siRNA转染3T3-L1细胞。转染48小时后，用hFc或Pref-1-hFc处理细胞。使用抗Notch、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体进行蛋白质印迹。（C） 3T3-L1细胞在1μMγ-分泌酶抑制剂L-685458存在下或在Notch siRNA转染后Pref-1-hFc存在下接受脂肪细胞分化。显示油红O染色（上部）、脂质染色定量（左下方）和RT-qPCR脂肪细胞标记物表达水平（右下方）。
接下来，我们测试了Pref-1信令是否需要Notch。我们使用了γ-分泌酶抑制剂L-685458，它通过阻止Notch的膜内蛋白水解从而抑制Notch细胞内结构域的释放来抑制Notch信号。正如预期的那样，用50 nM的可溶性Pref-1处理3T3-L1细胞有效地激活了ERK（图。，左）。即使用L-685458预处理3T3-L1细胞24小时，Pref-1介导的ERK激活也没有减少，这清楚地表明Notch激活对Pref-1信号不需要。接下来，我们进行了siRNA介导的Notch敲除。Notch siRNA转染使Notch蛋白水平降低75%。在这些Notch敲除细胞中，与控制siRNA转染细胞类似，在添加可溶性Pref-1后，可以清楚地观察到ERK1/2的时间依赖性磷酸化（图。，右侧）。这些结果表明，Pref-1介导的ERK/MAPK激活与Notch无关。为了进一步研究Notch在Pref-1功能中的潜在参与，在通过L-685458治疗或Notch siRNA转染阻断Notch信号后，我们测试了Pref-1对脂肪细胞分化的影响。如图所示，充满脂肪的圆形脂肪细胞形态。，大约50%的对照3T3-L1细胞在用成脂剂Dex/MIX/胰岛素治疗后分化为脂肪细胞。正如我们之前报道的那样，用可溶性Pref-1处理的细胞中只有不到20%分化为脂肪细胞。另一方面，与对照细胞相比，L-685458处理或Notch siRNA转染可分别将脂肪细胞分化提高到90%和85%。在这些细胞中，Pref-1仍然抑制55%的脂肪细胞分化。通过油红O染色和测量脂肪生成转录因子C/EBPα和PPARγ的表达水平来量化脂质积累，反映了脂肪细胞分化程度的类似变化。这些结果表明，Pref-1对脂肪细胞分化的抑制作用独立于Notch信号。
Pref-1与纤维连接蛋白相互作用。
由于上述结果表明Notch不参与Pref-1信号传导，因此细胞外或质膜室中应存在一个由已知的Pref-1伙伴或受体，该伙伴或受体通过可溶性Pref-1介导信号传导。为了确定Pref-1的相互作用伙伴，我们进行了酵母双杂交筛选。作为诱饵，我们使用了Pref-1并列膜结构域（aa 246至311），与全长Pref-1EC不同，该结构域不显示非特异性结合。我们总共筛选了4.5×10611天小鼠胚胎cDNA文库的色氨酸和亮氨酸营养缺陷型转化子。一个相互作用的克隆（1106A）被鉴定为诱饵特异性克隆。如图所示。左，用候选猎物克隆1106A和诱饵Pref-1JM在最小培养皿上进行双重转化的酵母显示出强大的β-半乳糖苷酶活性。相反，用空载体和诱饵Pref-1JM双重转化的酵母没有显示β-半乳糖苷酶活性。该猎物克隆包含纤维连接蛋白的部分序列，对应于III型重复序列14、相邻的III型连接片段（IIICS）、III型重复片段15和I型重复序列1至3（图。，右侧）。这个52-kDa纤维粘连蛋白（Fn）片段被指定为52Fn。
Pref-1与纤连蛋白相互作用。（A） 在酵母双杂交试验中，Pref-1JM与C末端纤维连接蛋白相互作用（左）。用指示质粒双重转化酵母平板的过滤复制品的β-半乳糖苷酶活性染色。1106A，阳性克隆；Pas2，空向量。所用纤维连接蛋白结构和纤维连连接蛋白片段的示意图（右侧面板）。（B） COS-7细胞与Pref-1-HA和52Fn-Myc共转染，裂解产物进行IP，然后进行Western blotting。（C） 通过Pref-1-HA珠下拉52Fn-Myc。将转染52Fn-Myc的COS-7细胞的裂解液用于Pref-1-HA珠的下拉，并通过Western blotting（IB）进行检测。星号代表IgG带。（D）35在SDS-PAGE和放射自显影之前，先培养S标记的Pref-1JM-HA和52Fn，然后用HA抗体进行IP。（E） 纯化的Pref-1EC在IP前与纯化的纤维连接蛋白片段一起孵育，然后使用抗Pref-1抗体或正常IgG，随后使用抗纤维连连接蛋白抗体进行Western印迹。（F） 通过SDS-PAGE分离的纤连蛋白片段在与Pref-1EC或Pref-1JM-AP孵育之前转移到硝化纤维素上。（G） 将Myc-tagged FnI或FnII转染到COS-7细胞中，并用裂解产物与Pref-1EC-HA珠进行下拉试验。星号代表IgG带。
首先，我们测试了通过酵母双杂交筛选鉴定的诱饵Pref-1EC-HA和猎物52Fn是否可以在哺乳动物细胞中相互作用。我们将52Fn-Myc和Pref-1EC-HA哺乳动物表达质粒共转染到COS-7细胞中。分别用Myc或HA珠进行共免疫沉淀，然后用HA或Myc抗体进行Western印迹，显示Pref-1-EC和52Fn之间存在明显的相互作用（图。)在哺乳动物细胞中。接下来，我们使用来自过度表达Myc-tagged 52Fn的COS-7细胞的裂解物，通过蛋白G琼脂糖珠上预组装的Pref-1EC-HA进行下拉分析。一种不相关的蛋白质，去胡桃素，被用作与Pref-1相互作用的52Fn的对照。与52Fn的相互作用仅在预组装到抗-HA珠的Pref-1EC-HA孵育时检测到（但在与无关蛋白去胡桃素孵育后检测不到），而与涂有无关蛋白AdPLA-HA的珠未检测到（图。). 为了检查Pref-1JM是否与52Fn直接交互，我们执行了一个在体外结合分析使用在体外-转录和翻译的产品标有[35S] 蛋氨酸和半胱氨酸。标记的52Fn与Pref-1JM-HA孵育，并与抗-HA抗体免疫沉淀。只有在免疫沉淀过程中存在Pref-1JM-HA时，才检测到52Fn（图。，左）。使用抗Pref-1抗体进行免疫沉淀产生了相同的结果（数据未显示）。我们接下来测试在体外使用纯化的Pref-1EC和纯化的全长225-kDa纤维连接蛋白（225Fn）以及较短的110-kDa-纤维连连接蛋白片段（110Fn）进行相互作用，该片段对应于包含RGD基序但缺少C末端区域的细胞结合域的第三型重复1至11个中心域。Pref-1EC与225Fn或110Fn孵育。Pref-1抗体免疫沉淀和Western blotting显示，尽管所有样品中都存在Pref-1EC，但沉淀中只检测到225Fn，而没有检测到110Fn。这些结果不仅表明Pref-1EC与全长纤维连接蛋白的相互作用，而且还表明纤维连连接蛋白C末端区域需要与Pref-1相互作用（图。). 对于远西部分析，我们使用225Fn、110Fn和40Fn，这对应于III型重复序列12-15和IIICS的较短C末端区域，因此与52Fn重叠。用SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上的纤维结合蛋白及其片段与含有碱性磷酸酶（AP）标记的Pref-1JM孵育。使用抗Pref-1抗体，我们检测到Pref-1JM-AP与225Fn和40Fn的剂量依赖性结合，但不与110Fn结合（图。，左）。当我们使用纯化的Pref-1EC时，也得到了类似的结果（图。（右），清楚地显示了生物活性Pref-1EC与纤维连接蛋白C末端结构域的相互作用。为了进一步定义与Pref-1相互作用的纤连蛋白结构域，我们产生并使用了两种表达构建体：FnI，包含与40Fn重叠的部分III型重复14至部分IIICS，以及FnII，包含52Fn的其余C末端区域。在共转染和共免疫沉淀后，我们检测到Pref-1EC与FnI的相互作用，但与FnII没有相互作用（图。). 综上所述，这些结果表明，Pref-1通过其膜旁区域，通过对应于III型重复序列14到部分IIICS区域的C末端结构域与纤维连接蛋白特异性相互作用。
纤维连接蛋白是Pref-1抑制脂肪细胞分化所必需的。
我们比较了3T3-L1细胞分化为脂肪细胞过程中Pref-1与纤维连接蛋白和整合素的表达模式。正如预测的那样，FAS、脂联素、脂肪转录因子C/EBPα和PPARγ的表达在分化过程中显著增加。另一方面，Pref-1及其下游靶点Sox9被显著下调，并且在分化时不存在。纤连蛋白的表达也在分化过程中降低，尽管在分化时可以在非常低的水平检测到（图。，左）。在脂肪细胞分化过程中，α5整合素亚基的表达降低到无法检测的水平。相反，在分化过程中，α6整合素亚基的表达增加，而β1整合素子基没有显著变化。Pref-1、Sox9、纤维连接蛋白和α5整合素亚基的蛋白质印迹显示，在分化过程中，蛋白质水平与mRNA水平的变化相似（图。，右侧）。3T3-L1细胞中Pref-1和纤维连接蛋白的免疫染色表明这两种蛋白在细胞外室中共定位（图。). 总的来说，在脂肪细胞分化过程中，纤维连接蛋白和α5整合素亚基的表达在Pref-1表达之后发生变化。
Pref-1与纤维连接蛋白在脂肪细胞分化调控中的关系。（A） 3T3-L1脂肪细胞分化过程中不同基因和蛋白质的半定量RT-PCR和Western blotting。（B） Pref-1和纤维连接蛋白定位的免疫荧光显微照片。以山羊抗Pref-1抗体作为第一抗体对3T3-L1细胞进行免疫染色，并用抗山羊IgG-Alexa荧光488（绿色）标记。这些细胞还用小鼠抗纤维结合蛋白抗体染色，并用抗小鼠IgG-Alexa荧光594（红色）标记。DAPI染色（蓝色）也显示出来。（C） 将Pref-1EC和52Fn-Myc转染到COS-7细胞（左）中，并在分化过程中将收集的条件培养基添加到3T3-L1细胞中。油红O染色（右上面板）及其定量（右下左面板）如图所示。结果为平均值±SEM。对照细胞分化后的强度定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。显示脂肪细胞基因表达的半定量RT-PCR。
为了开始测试Pref-1与纤维连接蛋白相互作用对脂肪细胞分化的影响，我们使用来自转染52Fn或Pref-1EC细胞的条件培养基对3T3-L1细胞进行脂肪细胞分化（图。，左）。与对照细胞相比，仅用52Fn处理的细胞分化为脂肪细胞的程度稍高（约35%），这是通过油红O染色的定量判断的（图。). 另一方面，Pref-1EC处理的细胞显示出分化抑制，分化比对照细胞低60%。相比之下，Pref-1EC和52Fn处理的细胞比对照细胞的分化率高35%，与52Fn单独处理的细胞相似。脂肪生成转录因子C/EBPα和PPARγ以及其他脂肪细胞标记物瘦素和FAS的表达也表明脂肪细胞分化存在类似差异。与对照细胞相比，用Pref-1EC处理的细胞中的脂肪细胞标记物水平较低，但在单独用52Fn处理的细胞或用52Fn和Pref-1EC处理的细胞中稍高。这些结果表明，52Fn的存在减弱了可溶性Pref-1对脂肪细胞分化的抑制作用。含有纤维连接蛋白二聚体结构域和Pref-1相互作用结构域的52Fn过量可增强脂肪细胞分化，更重要的是，可能通过以显性负向方式发挥作用，阻止Pref-1的抑制功能。
为了进一步研究Pref-1和纤维连接蛋白之间的功能关系，我们在3T3-L1细胞中进行了siRNA介导的纤维连接到蛋白的敲除。纤连蛋白siRNA转染后48小时，纤连蛋白表达水平下降约75%（图。，中间）。通过脂质染色及其定量判断，经过成脂过程的纤维结合蛋白siRNA-转染细胞分化为脂肪细胞的水平比对照siRNA转染细胞高45%。Pref-1-hFc处理使对照siRNA-转染细胞的分化抑制50%。相反，Pref-1-hFc治疗对纤维连接蛋白敲除细胞中的脂肪细胞分化没有显著影响（图。，中间）。脂肪细胞标记物的表达水平在分化方面与油红O染色判断的差异相似。与对照细胞相比，纤维连接蛋白敲除细胞中脂联素、瘦素、ADSF、aP2和FAS以及脂肪生成转录因子C/EBPα和PPARγ的表达水平显著增加（图。，底部）。Pref-1治疗导致对照细胞中脂肪细胞标记物表达降低，但在纤维连接蛋白敲除细胞中没有。相反，在分化为脂肪细胞的对照细胞中，内源性Pref-1和Pref-1靶基因Sox9的表达水平较低，但在添加可溶性Pref-1后显著增加，表明脂肪细胞分化受到抑制。与对照细胞相比，经过脂肪细胞分化的纤连蛋白敲除细胞显示出较低的Pref-1和Sox9水平，并且在分化过程中用可溶性Pref-1处理不会导致其表达水平的任何增加。3T3-F442A细胞也获得了类似的结果。总之，这些结果表明，纤维连接蛋白的敲除阻断了Pref-1对脂肪细胞分化的抑制作用，这表明纤维连连接蛋白对Pref-1功能的需求。
纤维连接蛋白是Pref-1抑制脂肪细胞分化所必需的。（A） 转染纤维连接蛋白或对照siRNA的3T3-L1细胞在hFc或Pref-1-hFc存在下接受脂肪细胞分化。显微镜形态（上部）、油红O染色和脂质积聚定量（中部）显示。RT-qPCR和半定量RT-PCR也显示在底部。分化后用hFc处理的对照siRNA-转染细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。（B） 用对照或纤维连接蛋白siRNA转染Pref-1空MEF，并用Pref-1-hFc处理。用抗纤维结合蛋白、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体进行蛋白质印迹（左）。对照细胞或纤维连接蛋白siRNA-转染细胞经hFc或Pref-1-hFc处理8小时，然后通过Western blotting检测Sox9蛋白水平（右）。（C） 用纤维连接蛋白siRNA和1.0 kb C/EBPβ启动子-荧光素酶构建物（左）或2.0 kb C/EBPδ-启动子-萤光素酶构造物（右）转染3T3-L1细胞。48 h后，用对照hFc或Pref-1-hFc处理细胞额外16 h。使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）测量荧光素素酶活性。内部控制采用pRL-SV40。结果为平均值±SEM。**，P（P）< 0.01. 无显著差异。
之前，我们已经证明Pref-1通过激活ERK1/2上调Sox9表达，从而抑制脂肪细胞分化。因此，我们在这些纤维连接蛋白siRNA-转染的前脂肪细胞中检测了Pref-1信号、ERK1/2磷酸化和Sox9表达的即时效应。正如预测的那样，在转染对照siRNA的细胞中，Pref-1在5分钟内迅速增加了ERK1/2磷酸化，ERK1/2活化在15分钟内保持较高水平。相比之下，在转导纤维连接蛋白siRNA细胞中，ERK1/2磷酸化的基础水平低于对照细胞。更重要的是，ERK1/2激活的增加在纤维连接蛋白敲除细胞中并不显著，并且在添加可溶性Pref-1后的5或15分钟内几乎无法检测到（图。，左）。此外，我们检测到，与对照siRNA转染细胞相比，纤维连接蛋白敲除细胞中的Sox9水平降低了50%。此外，Pref-1治疗上调了对照细胞中Sox9的表达，但未上调纤维连接蛋白敲除细胞中的Sox9表达（图。，右侧）。这些结果清楚地显示了纤维连接蛋白对Pref-1下游信号的需求，以及通过Pref-1和纤维连接蛋白之间的直接相互作用抑制脂肪细胞分化。此前我们报道，通过诱导Sox9，Pref-1抑制C/EBPβ和C/EBPδ的启动子活性，这两种转录因子在脂肪细胞分化的早期被诱导并起关键作用。因此，我们研究了Pref-1与纤维连接蛋白的相互作用是否影响Pref-1介导的C/EBPβ和C/EBPδ启动子活性的抑制。如图所示。转染纤维连接蛋白siRNA的细胞中C/EBPβ和C/EBPδ的启动子活性高于对照siRNA转染细胞。然而，在纤连蛋白敲除细胞中不再检测到Pref-1对C/EBPβ和C/EBPδ启动子活性的抑制。这些结果表明，纤维连接蛋白对C/EBPβ或C/EBPδ启动子活性有其自身的抑制作用，但更重要的是，Pref-1对C/EBP-β或C/EBPδ的启动子活性的抑制依赖于其与纤维连接到蛋白的相互作用。
Pref-1信号通路和脂肪细胞分化中的功能是通过纤维连接蛋白-整合素信号通路实现的。
由于我们发现Pref-1与纤维连接蛋白的相互作用是Pref-1抑制脂肪细胞分化所必需的，并且纤维连连接蛋白受体α5β1整合素被检测为前脂肪细胞中的主要整合素，因此我们接下来检查整合素是否参与脂肪细胞分化过程中的Pref-1功能。为了破坏纤维连接蛋白-整合素的相互作用，我们使用了与纤维连连接蛋白的细胞结合序列相对应的RGD肽。当我们在3T3-L1细胞中测试不同浓度的RGD肽（0.10至1.00μM）时，大于0.25μM的RGD肽类在脂肪细胞分化过程中导致细胞分离（现在显示的数据）。因此，我们使用0.25μM的RGD肽来检测Pref-1对脂肪细胞分化的影响对纤维连接蛋白-整合素相互作用的需求。经分化剂处理后，50%的hFc和DGR肽处理的对照细胞分化为脂肪细胞。通过显微镜形态学和脂质积聚判断，用RGD肽处理的细胞显示出85%的分化增强（图。). 在用DGR肽处理的对照细胞中，Pref-1-hFc处理使分化程度降低到20%-25%。在RGD肽处理的细胞中，Pref-1对分化的抑制作用被阻断，细胞显示80%的分化。脂肪细胞标记物的表达水平同样反映了脂肪细胞分化的变化。用RGD肽处理的细胞中脂联素、瘦素、ADSF/抵抗素、aP2/FABP4、FAS、C/EBPα和PPARγ的水平较高，而用DGR肽处理的对照细胞中内源性Pref-1水平较低。更重要的是，在RGD肽处理细胞中，通过可溶性Pref-1在对照DGR处理细胞中观察到内源性Pref-1水平的增加（图。). 这些数据表明，能够竞争性结合整合素受体的细胞结合域的RGD肽可以阻止Pref-1抑制脂肪细胞分化。接下来，我们将α5整合素亚单位siRNA转染到3T3-L1细胞中，发现α5整合素表达水平降低了80%。这些细胞在可溶性Pref-1的存在下发生分化。与对照siRNA转染细胞相比，转染α5整合素亚单位siRNA的细胞显示出更大的脂滴积聚，伴随着更高水平的C/EBPα和PPARγ表达（图。). Pref-1治疗并未阻止α5整合素亚基siRNA-转染细胞脂肪细胞分化的增加。这些结果表明，在缺乏整合素的情况下，Pref-1不能抑制脂肪细胞分化，这进一步证明了整合素对Pref-1功能的需求。
α5整合素是Pref-1抑制脂肪细胞分化所必需的。（A） 3T3-L1细胞在对照DGR或RGD肽和hFc或Pref-1-hFc的存在下分化。通过RT-qPCR和RT-PCR显示了形态学和脂肪细胞标记物的表达水平。分化后用DGR肽和hFc处理的细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。（B） RT-PCR证实了3T3-L1细胞中α5整合素的敲除（左）。用对照或α5整合素siRNA转染的细胞在hFc或Pref-1-hFc的存在下进行脂肪细胞分化。显微镜形态、油红O染色（中间）和RT-qPCR表达水平（右侧）如图所示。**，P（P）与对照细胞相比<0.01。
整合素通过配体结合后，激活各种下游信号事件，包括焦粘着激酶（FAK）和Src的磷酸化，以及Rho-like GTPase家族蛋白质的激活，包括Rac、RhoA和Cdc42，这些蛋白质在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环。当我们检查Pref-1对整合素下游信号传导的影响时，我们发现在Pref-1处理后FAK的磷酸化增加了2.5倍，而Src磷酸化没有显示出显著变化（图。，左）。通过使用Rhotekin和p21活化蛋白激酶（Pak1）琼脂糖珠，分别从细胞裂解物中分离出GTP结合的Rac1以及RhoA和Cdc42。Western blotting显示，经Pref-1处理后，Rac1的活性形式增加了约2倍，而RhoA的活性形式几乎检测不到，Cdc42的活性形式没有显著变化（图。，右侧）。由于已知Rac在FAK下游被激活，我们接下来测试Rac在Pref-1介导的MEK/ERK激活中的功能。用与GFP融合的显性阴性Rac稳定转染3T3-L1细胞。使用GFP抗体通过Western blotting检测显性阴性Rac的高水平表达。正如预期的那样，Pref-1处理在对照细胞中引起了ERK1/2的强烈的时间依赖性激活，而Pref-1在稳定表达显性负Rac的细胞中没有引起ERK1/2磷酸化的变化，这清楚地表明了Pref-1作用的减弱（图。，左）。我们还观察到，在siRNA-介导的Rac基因敲除后，ERK1/2激活显著降低（图。，左）。此外，根据油红O染色和C/EBPα和PPARγ的表达水平判断，转染显性阴性Rac-GFP或Rac-siRNA的细胞脂肪细胞分化增强。更重要的是，Pref-1不再阻止这些细胞的脂肪细胞分化（图。，右），证明了在Pref-1抑制脂肪细胞分化中Rac的需求。总的来说，这些结果表明，涉及FAK-Rac的整合素信号通路介导ERK1/2的Pref-1激活和随后的脂肪细胞分化抑制。
参与Pref-1激活ERK的下游信号通路。（A） 用hFc或Pref-1-hFc处理3T3-L1细胞1小时。显示蛋白质印迹。（B） 用Pref-1-hFc处理稳定表达对照GFP或显性阴性Rac（RacDN-GFP）的细胞。用抗GFP、磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体进行Western blotting（左）。显示了油红O染色和RT-qPCR测定的脂肪细胞标记物表达水平。首次用对照GFP载体转染的细胞或分化后用对照hFc处理的细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比，<0.01（**）。（C） 使用所示抗体对转染对照或Rac siRNA、用hFc或Pref-1-hFc处理的3T3-L1细胞的裂解物进行Western blotting。通过RT-qPCR显示油红O染色和脂肪细胞标记物表达水平。用对照siRNA转染的细胞或分化后用对照hFc处理的细胞的值定义为1。P（P）<0.05（*）和P（P）与对照细胞相比<0.01（**）。
讨论
我们之前报道过，只有可溶性Pref-1而非跨膜形式在抑制脂肪细胞分化方面具有生物活性(17). 我们的预测是，可溶性Pref-1必须与细胞外或跨膜蛋白相互作用。在这里，使用酵母双杂交系统，我们将纤维连接蛋白鉴定为Pref-1相互作用蛋白。在这方面，其他生长因子，如肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）和转化生长因子β（TGF-β），也结合纤维连接蛋白的各个区域。这些生长因子通过形成包含整合素和同源生长因子受体的复合物来传递信号而发挥作用(8). 我们在这里显示，Pref-1JM和Pref-1EC直接与纤维连接蛋白的C末端区域相互作用。我们进一步将纤维连接蛋白的Pref-1相互作用域定义为FnI，对应于包含部分FnIII14和IIICS的区域，并发现与纤维连蛋白的相互作用对于Pref-1抑制脂肪细胞分化是必要的。以前有报道称，当前脂肪细胞生长在涂有纤维连接蛋白的培养皿上或当纤维连连接蛋白作为可溶性形式添加到培养基中时，脂肪细胞分化受到抑制(4,31). 纤维连接蛋白通过阻止前脂肪细胞成为脂肪细胞所需的细胞骨架和形态变化来抑制分化。虽然在我们目前的研究中也检测到了纤维连接蛋白，但我们并没有探讨纤维连连接蛋白在脂肪细胞分化中的作用就其本身而言相反，作为Pref-1相互作用蛋白，我们正在研究纤维连接蛋白在Pref-1抑制脂肪细胞分化中的作用。在我们目前的研究中，我们发现添加含有二聚化和Pref-1相互作用结构域的纤维连接蛋白片段或敲除纤维连接到蛋白可增强脂肪细胞分化。更重要的是，添加此纤维连接蛋白片段或敲除纤维连连接蛋白可阻止Pref-1对分化的抑制以及MEK/ERK和Sox9诱导的Pref-1激活，这表明纤维连接到蛋白对Pref-1功能的需求。
此前，其他人报道了Pref-1通过Notch影响脂肪细胞分化，尽管全长Pref-1和Notch的相互作用从未报道过(2,14). 在果蝇属据报道，Pref-1的翅发育（仅膜形式，而非可溶性形式）对抗Notch(三). 相反，据报道，Pref-1与Notch配体协同激活Notch in秀丽线虫(13). 关于Notch对脂肪细胞分化的影响，还有其他相互矛盾的报道。在Notch配体Jagged1存在的情况下，Notch信号被激活，导致脂肪细胞分化受到抑制。与Notch对脂肪细胞分化的抑制作用相反，Notch下游分子Hes-1的敲除并没有增强，而是抑制了脂肪细胞的分化(22). 据报道，脂肪细胞分化也需要Notch(5). 然而，Notch1敲除细胞可以有效地分化为脂肪细胞，这表明Notch在脂肪细胞分化中发挥着不可替代的作用(19). 我们还发现，在目前的研究中，Notch不是必需的，但实际上它抑制脂肪细胞分化。更重要的是，我们在这里已经表明，Pref-1不与Notch交互，也不需要Pref-1信令和功能。我们的结果还排除了Pref-1与经典DSL域含Notch配体相互作用影响Notch信号的可能性。这与Notch本身不影响MEK/ERK的事实相一致，尽管Notch可以根据上下文增强或拮抗生长因子介导的MEK/ER激活。由于在Pref-1和Notch之间观察到的其他表型关系没有得到我们在这里进行的生物化学相互作用研究的支持，我们得出结论，表型联系充其量是间接的。
众所周知，纤维连接蛋白结合整合素影响细胞增殖、细胞粘附和分化(23). 此外，许多生长因子可以与纤维连接蛋白的不同区域结合。这些生长因子通过形成包含纤维连接蛋白受体、整合素和相应同源生长因子受体的复合物来传递信号而发挥作用(8). 例如，血管内皮生长因子（VEGF）通过Fn的C末端结构域（III型重复序列13和14）结合纤维连接蛋白，结合整合素和VEGF受体，并列两个受体，诱导细胞反应，包括ERK/MAPK激活，促进内皮细胞增殖和迁移(37). 纤维连接蛋白还可以结合肝细胞生长因子（HGF），与HGF受体Met和α5β1或αVβ3整合素形成复合物，激活ERK或磷脂酰肌醇3（PI3）激酶，分别促进增殖和迁移(21). TGF-β通过与其他蛋白质形成复合物与纤维连接蛋白结合，其并入ECM是后续TGF-(8). Pref-1与纤维连接蛋白的结合如何激活ERK/MEK的下游信号传导以抑制脂肪细胞分化？α5β1整合素是前脂肪细胞中纤维连接蛋白结合的主要整合素。我们发现用RGD肽处理3T3-L1细胞或α5整合素亚基的敲除可促进脂肪细胞分化，表明纤维连接蛋白与含有α5整合素的α5相互作用对脂肪细胞分化具有抑制作用。我们还发现，与FnII14和IIICS的C末端区域相对应的52Fn促进脂肪细胞分化。该观察结果与之前的报告一致，即FnIII14肽刺激ST-13细胞的脂肪细胞分化(11). 含有C-末端二聚结构域的过量52Fn的添加可能阻止内源性纤维连接蛋白的二聚化和组装，从而阻止与整合素的相互作用。更重要的是，我们发现，通过RGD肽或α5整合素的敲除阻断纤维连接蛋白与整合素结合，可以阻止Pref-1对脂肪细胞分化的抑制作用，这表明纤维连连接蛋白-整合素相互作用对Pref-1功能的需求。我们还发现，添加52Fn可以阻止Pref-1介导的脂肪细胞分化抑制。由于52Fn含有Pref-1相互作用域，Pref-1抑制分化的缺失必须通过阻止Pref-1与内源性纤维连接蛋白的结合来实现。总的来说，我们的结果表明Pref-1抑制脂肪细胞分化需要Pref-1纤维连接蛋白-整合素相互作用。
纤维连接蛋白-整合素的细胞内信号传导已经得到了很好的研究。纤维连接蛋白整合素结合激活FAK/Src复合物和Rho-like GTPase家族成员，包括Rac、RhoA和Cdc42，它们可以激活ERK/MAPK途径(7). 因此，纤维连接蛋白激活ERK/MAPK通路可以被抗α4和抗α5整合素抗体或RGD肽阻断。在本研究中，我们发现用可溶性Pref-1处理3T3-L1前脂肪细胞可激活FAK和Rac。在这方面，脂肪细胞分化过程中，不仅α5整合素亚基表达减少，Rac活化也减少。此外，据报道，α5整合素亚基的过度表达可增加Rac的活化，而组成活性Rac可抑制脂肪细胞的分化(16)，显示了α5整合素和Rac对脂肪细胞分化的抑制作用。更重要的是，我们在这里已经表明，在纤维连接蛋白被击倒的细胞中，Pref-1对MEK/ERK的激活被钝化。此外，MEK/ERK的Pref-1激活被Rac的敲除或在强制表达显性负Rac的细胞中减弱，这清楚地将整合素和Rac下游整合素的激活联系到Pref-1功能。我们的发现与这样一种观点一致，即通过直接与纤连蛋白结合，Pref-1激活前脂肪细胞中的主要整合素α5β1及其下游信号通路，包括Rac，以维持前脂肪细胞处于未分化状态。纤维连接蛋白和ERK/MAPK激活之间可能存在正反馈环。纤维连接蛋白可以激活ERK/MAPK，从而影响细胞增殖、粘附和分化。相反，纤维连接蛋白mRNA和蛋白水平依赖于ERK/MAPK，在ERK激活抑制剂或ERK敲除的治疗中，纤维连接蛋白蛋白和表达水平以及纤维连连接蛋白组装降低(20). 因此，Pref-1对MEK/ERK的激活可能会增加纤连蛋白水平。总之，我们目前的研究清楚地表明，Pref-1直接结合纤维连接蛋白并激活整合素下游信号，以抑制脂肪细胞分化。然而，该复合物是否也包含一个由前至后确定的Pref-1同源跨膜受体，还有待确定，一些结合纤维连接蛋白的生长因子也是如此。需要进一步研究以确定该实体的存在和性质。
