多重调和：从序列比对中检测功能特异性

摘要

简介

许多蛋白质家族包含表现出功能专门化的亚家族，通常涉及配体结合或蛋白质-蛋白质相互作用的差异(1). 因此，越来越多的方法和/或网络应用程序已经可用，它们提供了蛋白质家族中特异性决定残基的功能分析(2–10). 这些方法通常需要使用预先确定的组或系统发育树作为输入的多序列比对（MSA）。SDPpred公司(三)使用相互信息来识别“在特异性组内保存良好但在这些组之间不同”的位置。推进器-II(11)是一种基于用户定义子族的隐马尔可夫分布之间差异的累积相对熵的方法。

其他方法只需要MSA，并使用组间分析等自动将序列分组为子组(6)或系统发育(2,12). Xdet公司(13)使用从对齐中导出的分类，并基于“树行列式”残差的相互行为分析。它也可以通过提供外部（功能）分类来使用和监督。蛋白质键(14)实现组合熵优化以识别特异性决定残基和子族。Georgi的最新方法等。(10)只需要序列并进行子组发现，同时识别功能残基。

鉴定蛋白质中决定特异性的残基是一项艰巨的任务(15)在确定这些地点时，方法的成功率各不相同，但往往适中。因此，Chakrabarti和Panchenko结合了三种不同的方法(15)采用集合方法，并在三维环境中研究预测的位置。

我们在此提出了一种新的交互式web服务器，用于检测蛋白质中的亚型特异性位点。它结合了经验证的序列和谐（SH）的改进版本(5,16)和多重减压（mR）(8)在单个服务器中的方法，多和声.SH以香农熵为基础，确定各组间氨基酸组成的差异程度。mR基于特征加权算法RELIEF识别残差(17). 我们将SH推广到处理多个子组，重新实现了mR，并比较了它们相对于四种方法的性能：SDPpred(三)，蛋白质键(14)，推进器-II(11)和Xdet(13).

在本文中，我们将指导用户完成多和声web应用程序。我们将为Smad蛋白家族的五个子家族寻找亚型特异性位点。发现的亚类型特异性位点是解释功能差异的最佳候选位点。该方法的其他相关应用包括蛋白质-蛋白质相互作用(18)配体特异性和两者的组合(19).

方法

算法

下面，我们简要概述了序列和谐和多浮雕算法。有关SH和mR算法的更多详细信息，请参阅我们早期的工作(5,8,16)以及web服务器上的在线文档。

多序列和声

SH现在已经被推广到处理两个以上的序列组。这种概括分为两个阶段。首先，剩余概率之和()在两组中和，用于原始SH方程(5)，已扩展到分组如下：

哪里是残差类型的概率在组中在位置Shannon的“字母大小”对于氨基酸类型和组中的序列用作对数的基数。其次，平均值概括为：.SH值的范围从完全不重叠残渣组分的零到相同组分的一。下面是一个玩具示例，其中包含一些典型的列和相应的SH值表1。

表1。

三个子家族的假设一致性，以说明SH得分（范围从0到1）和mR权重（范围从-1到1）

	对齐位置								距离矩阵
	1	2	三	4	5	6	7	8	1	2	三	4	1	2	三	1	2	三
第1组
序列1	R（右）	E类	L（左）	A类	A类	K（K）	K（K）	A类	–	2	4	4	6	7	5	7	7	6
序列2	R（右）	E类	L（左）	A类	F类	K（K）	K（K）	我	2	–	4	三	6	7	4	7	6	6
序列3	R（右）	E类	A类	A类	Y（Y）	R（右）	K（K）	L（左）	4	4	–	2	4	5	6	5	6	6
序列4	R（右）	E类	A类	A类	F类	R（右）	K（K）	M（M）	4	三	2	–	5	6	5	6	5	7
第2组
序列1	H（H）	N个	V（V）	A类	Y（Y）	R（右）	K（K）	K（K）	6	6	4	5	–	1	三	4	5	5
序列2	H（H）	N个	V（V）	F类	Y（Y）	R（右）	K（K）	K（K）	7	7	5	6	1	–	4	三	4	4
序列3	H（H）	N个	S公司	A类	F类	K（K）	K（K）	K（K）	5	4	6	5	三	4	–	6	5	5
第3组
序列1	H（H）	S公司	F类	F类	Y（Y）	R（右）	K（K）	问	7	7	5	6	4	三	6	–	三	三
序列2	H（H）	S公司	M（M）	F类	F类	R（右）	K（K）	R（右）	7	6	6	5	5	4	5	三	–	三
序列3	H（H）	S公司	M（M）	F类	Y（Y）	K（K）	K（K）	S公司	6	6	6	7	5	4	5	三	三	–
上海	0.42	0	0	0.57	0.87	0.99	1	0
先生	1	1	0.67	1	−0.42	−0.19	0	0.50

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mR使用距离矩阵来查找每个序列的“最近命中”（组内；粗体斜体）和“最近未命中”（各组之间；粗体）。

多重减压

mR的工作原理是在成对的组上迭代RELIEF，并返回每个位置正权重的平均值，或者如果没有获得该位置的正权重，则返回负权重的平均值(8). 给定两组序列，RELIEF通过加权向量的总和为特征（对齐列）分配权重，加权向量是给定序列与其相对组的最近邻序列之间的位向量差，即“最近未命中”，并从该位向量差中减去同一组中与其最近的邻居的“最近命中”。

mR的采样策略已从随机变为穷尽确定性实现。对序列进行全面对比全部的现在比较“最近命中”和“最近未命中”（参见8）。因此，用户不再需要微调迭代次数，或者在不同的运行中得到不同的结果。此外，mR web输出现在报告支持值。中的玩具示例表1还显示了相应的mR权重。

玩具示例

表1显示了假设路线的示例值。如果各组之间的残留物完全不同(表1或组内完全保守（位置2），SH得分为零。在后一种情况下，mR重量为1。当位置在一个子家族中具有不同的残基时，出现负mR权重，但在子家族之间表现出守恒性（位置5和6）。

统计显著性

现在的输出包括一个以经验形式表示的显著性度量Z轴-SH和mR值得分。这些值是通过排列组标签并重新运行而产生的（=100）次。出于效率原因，对于mR，随机值基于成对组的子抽样。Z轴-分数衡量观察到的SH或mR值与该数据集相应“随机”分数平均值的标准偏差（SD）。完全保守的对齐列在随机分数上的SD为零，从而产生未定义的Z轴-得分。

验证

SH和mR方法依赖于不需要“培训”的排名方案，只有应用于得分值的截止值才能确定所选站点的数量。先前已经对SH进行了验证，并与其他最先进的特异性检测方法进行了比较(5)对于mR(8). mR也进行了基准测试，是五种方法中表现最好的三种方法之一(15).

我们这里包括了SH和mR在7个数据集上的验证结果，详见表2和另一项基准研究的15个数据集(15)（排除了五个重叠家族，即Gprotein、LacI、Smad、RasRal和Rab56）。我们遵循卡普拉和辛格描述的验证协议(21).图1显示了总结不同方法获得的等级分布的方框图，以及SH和mR的平均精度/召回（PR）曲线，以及表3汇总了每个数据集PR曲线下的面积。为了进行比较，还显示了蛋白质键、PROUST-II、SDPpred和Xdet的结果。ProteinKeys在默认设置和对齐过滤关闭的情况下运行。PROUST-II预测显示默认最小值“AA Prob”为0.2，排名为Z轴-得分。Xdet在无监督和有监督的情况下运行，在这种情况下，组以二进制矩阵的形式提供，定义序列对组的隶属度。

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图1。

SH和mR方法的验证结果。蛋白质键、PROUST-II、SDPpred v.2和Xdet用于比较。通过不同方法获得的结果在所有数据集上平均，这些数据集按阳性数加权。(A类)方框图显示阳性位点等级的分布（最小值、下四分位数、中位数、上四分位数和最大值）。越低越好。(B类)精度/召回率（PR）曲线显示了不同覆盖率（召回率）下方法的相对性能。越高越好。

表2。

用于算法基准比较的七个数据集的属性

数据集	类的数量	平均（SD）班级规模	最大、最小班级规模	站点数量	现场信息	PDB参考	“True”站点
全球采购控制报告	77	26.8 (34)	189, 3	214	配体	1千兆	T94、T97、E113、G114、A117、T118、G121、L125、C167、L172、F203、V204、M207、F208、H211、Y268、A269、A272、A292、F293、K296
GPCR-190型	39	4.9 (3.8)	21, 2	如“GPCR”
拉西	15	3.6 (2.5)	12, 2	339	配体和DNA	1个	T5、L6、S16、Y17、Q18、R22、N25、Q26、H29、Q54、A57、S61、L73、A75、P76、I79、N125、P127、D149、S191、S193、W220、N246、Q248、Y273、D274、T276、F293
Ras/Ral公司	2	44.5 (24.5)	69, 20	218	蛋白质	第51页	I24、Q25、D30、E31、D33、I36、E37、Q43、L53、M67、Q70、D92
Rab5/Rab6	2	5.0 (1)	4, 6	163	蛋白质	1R2季度	K42、G43、Q44、H46、E47、F48、Q49、E50、S51、H83、A86、M88、Y90、G92、A93、Q94、E117、L118、Q119、R120、Q121、A122、S123、P124、N125、I126、V127、K183
AQP/GLP公司	2	30.0 (18)	48, 12	430	蛋白质	1FX8层	L21、W48、V52、A65、H66、L67、V71、T137、Y138、P139、N140、P141、L159、I163、I187、G195、P196、L197、G199、F200、A201、M202
斯马德	2	10.0 (2)	12, 8	211	蛋白质	1千赫	L263、Q264、T267、Q284、Q294、P295、L297、T298、S308、E309、A323、V325、M327、I341、F346、P360、Q364、R365、Y366、W368、N381、R427、T430、S460、V461、R462、C463、M466

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数据集包括G蛋白偶联受体（GPCR）和较小版本（GPCR-190）、转录因子的LacI家族、小GTP-酶的Ras超家族（Rab5对Rab6；Rab对Ral）、水通道蛋白对甘油通道蛋白（AQP/GLP）和转录因子的Smad家族[更多详细信息请参阅(5,8)].

表3。

在22个数据集中，SH和mR作为PR曲线下面积（AUC）与黄金标准特异性位点进行特异性位点检测的验证，7个数据集定义如下表2查克拉巴蒂和潘琴科获得的15套(15)

数据集	立方厘米9	cd00美元	cd00美元	cd00美元	cd00美元	cd00美元	cd00美元	cd00美元	中国-	全球采购控制报告	全球采购控制报告	消费税	印尼盾/	拉西	中密度脂蛋白/	AQP公司/	核	拉布	ras（拉斯维加斯）/	蓖麻毒素	丝氨酸	斯马德	Aver公司
		120	264	333	363	365	423	985	myc公司	190			IMDH公司		乳酸脱氢酶	天然气处理厂	循环。一	5/6	拉尔				Wt’d（重量）
#积极因素	7	三	三	12	6	10	4	三	11	21	21	9	14	28	1	23	2	28	12	21	2	29
先生	0.161	0.058	0.006	0.301	0.010	0.055	0.204	0.329	0.037	0.246	0.347	0.156	0.050	0.266	0.063	0.213	0.417	0.540	0.666	0.186	0.078	0.719	0.310
mR Z	0.161	0.058	0.006	0.301	0.010	0.055	0.204	0.329	0.037	0.252	0.347	0.156	0.050	0.282	0.063	0.216	0.417	0.539	0.666	0.186	0.078	0.721	0.312
上海。	0.074	0.054	0.003	0.287	0.008	0.119	0.080	0.198	0.067	0.486	0.489	0.242	0.048	0.124	0.125	0.249	0.413	0.602	0.540	0.194	0.261	0.713	0.330
上海Z	0.074	0.054	0.003	0.287	0.008	0.119	0.080	0.198	0.067	0.517	0.489	0.242	0.048	0.207	0.125	0.268	0.413	0.602	0.540	0.194	0.261	0.703	0.342
蛋白质键	0.049	0.008	0.087	0.203	0.010	0.010	0.002	0.034	0.027	0.377	0.505	0.483	0.065	0.301	0.005	0.119	0.011	0.364	0.092	0.276	0.006	0.748	0.287
推进器-II	0.349	0.079	0.012	0.055	0.011	0.016	0.049	0.058	0.122	0.308	b条	0.446	0.089	0.111	0.015	0.187	0.305	0.455	0.378	0.256	0.750	0.723	0.258
SDPpred v.2版	0.122	0.126	0.017	0.376	0.012	0.126	0.234	0.509	0.162	0.508	0.508	0.615	0.196	0.146	0.250	0.242	0.413	0.416	0.357	0.201	0.542	0.522	0.333
Xdet公司	0.352	0.106	0.080	0.366	0.011	0.103	0.196	0.387	0.086	0.125	b条	0.117	0.100	0.190	0.033	0.169	0.054	0.350	0.398	0.173	0.105	0.688	0.234
Xdet供应c（c）	0.209	0.106	0.019	0.346	0.012	0.189	0.171	0.534	0.101	0.275	b条	0.402	0.129	0.207	0.250	0.208	0.292	0.346	0.545	0.193	0.750	0.677	0.279
平均	0.172	0.072	0.026	0.280	0.010	0.088	0.136	0.286	0.078	0.344	0.448	0.318	0.086	0.204	0.103	0.208	0.304	0.468	0.465	0.206	0.314	0.691	0.298

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^一核苷酸环化酶。

^b条这些方法的GPCR数据集超过了1000个序列的最大值。

^c（c）通过使用子组进行监督。

AUC越高，性能越好。为了进行比较，还显示了ProteinKeys、PROUST-II、SDPpred v.2和Xdet的预测。每个数据集的最佳取芯方法用粗体表示。最后一列列出了每种方法的平均AUC（按正数加权），最后一行列出了每个数据集的平均值。

PR图图1B显示SH优于其他方法，召回率高达20%。除此之外，其性能与其他最先进的方法相当。因此，当人们对少量高度显著的特异性决定位点感兴趣时，SH似乎是一个不错的选择。

结果和讨论

上传MSA和子系列分组后，multi Harmony服务器返回高度动态的结果页面，如所示图2每个对齐位置的结果显示在交互式表格中(图2A） ●●●●。用户可以在任何数字字段（例如SH分数或Z轴-score），可以根据阈值筛选和突出显示站点。

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图2。

多和声输出示例。(A类)主输出表，按SH分数排序并根据SH分数过滤(0.5）和高mR重量(0.8). 只有校准中位置17处的ALA278不是确认的功能残留物。可以对带有箭头的列进行排序。还可以筛选这些列中的大多数，以仅显示满足用户提供的阈值的对齐位置。(B类)Jalview中的输出视图。组在路线中列出，筛选位置（来自输出表）在注释轨道“filtered 1”中标记，工具提示详细说明了过滤器，如“positions passing criteria[score0.5; 重量0.8]表示“。(C类)使用Jmol查看3D上下文，蛋白质由mR重量着色，过滤残留物（来自输出表）标记并突出显示为填充球体。也可以通过SH分数着色。

我们包括Jalview(22)和Jmol小程序(23)与以前只提供静态输出表的SH和mR服务器相比，它们利用Javascript–Java接口增强了交互性。序列组、SH得分和mR权重在Jalview比对中进行了注释。此外，用户可以交互地将注释轨迹添加到Jalview对齐中，以标记通过提供的表过滤器阈值的位置。这样的轨迹如所示图2B.如果提供了PDB结构，则可以在PDB结构（Jmol）上显示结果。整个结构可以根据SH得分或mR权重进行着色。通过过滤器的残留物也可以动态高亮显示，从而在3D环境中提供这些残留物的视图(图2C） ●●●●。最后，用户可以下载分析程序的明文输出。

我们说明了受体调节的SMAD蛋白（R-SMAD）的多和谐性(图2). SMAD是转录因子，通过介导转化生长因子β（TGF-β）信号传导，在发育（细胞生长和分化）和疾病（如癌症）中发挥关键作用(24). SMAD可以分为两大类(图2)SMAD1、SMAD5和SMAD8被激活以响应骨形态发生蛋白信号，而SMAD2和SMAD3被激活以回应TGF-β或激活素信号。大多数与SMAD的相互作用通过Mad同源2（MH2）结构域发生，该结构域负责结合的特异性(25). 输入比对由来自五个R-Smad组的MH2结构域的33个同源脊椎动物序列组成。

输出表可以根据SH或mR值进行过滤。在亚型特异性的情况下，我们感兴趣的是寻找亚家族特有的残基。SH分数范围为0到1，mR权重范围为1到1。A较低SH(和谐)表示更特定的残留物，而更高的mR重量表示更特定于组的残留品。因此，SH得分越低或mR权重越高越好。

如果我们使用严格的mR权重阈值来过滤输出表中的残留物返回0.9、42（共211个）位置。其中包括28个已知功能站点中的24个(表2，参见5）另外八个残基（I277、T289、R337、L350、A371、E389、Q400和R410）的mR权重为1，这意味着这些位置可以在SMAD排列中的至少两个组之间进行最佳区分。例如，位置I277（位置16）是SMAD8组中的保守缬氨酸，而在其他SMAD中是异亮氨酸。

我们还可以根据SH得分和/或SH和mR筛选输出表Z轴-得分。这个Z轴-score提供了筛选SH结果的直观方法：aZ轴-得分−3表示SH得分比100个随机分组的平均得分低三个SD。因为SH得分应该是降低比“随机”平均值负Z-分数是最有趣的。然而，一个非常消极的Z轴-SH得分高也可以获得分数。例如，当对齐列仅显示两个残基时，就会发生这种情况：一个残基在一个小的亚群中保守，另一个在所有其他亚群中，如表1位置1和位置16英寸图2这确实经常与mR重量为1的情况相吻合。

通常，通过更改Z轴-分数，可以调整预期的错误发现率。A典型Z轴-分数阈值将小于−3，或者更严格地说，小于−6。事实上Z轴-小于−12的分数阈值返回经验证的功能位置（SMAD的ARG365，另请参阅图2A） 以及可能在组之间不同但在组内保守的位置。表3说明了Z轴-SH的表现得分。如果Z轴-分数被用作过滤器（小于-9），将SH分数分为两组，然后根据SH分数排名，SH的表现提高了约4%。对于mR，这种过滤在这些数据集上没有明显的优势。最佳阈值取决于数据集，尤其是随着子组数量的增加而显著增加。因此，我们设定了一个适度的Z轴-默认分数阈值为−3。

结论

这个多和谐服务器结合了增强的序列和谐和多救济方法来研究蛋白质中的特异性决定残基。将多组处理添加到SH中可以提高其可用性。与之前的（采样）实现相比，mR的新确定性实现返回可重复的结果。此外，SH和mR的经验显著性估计提高了结果的可靠性。multi Harmony服务器提供表格输出作为交互式环境，以使用Jalview在多重比对上下文中分析所选残基，并使用Jmol在其3D上下文中分析所选残基。

基金

ENFIN，一个由欧盟委员会在其FP6计划中资助的卓越网络，主题领域为“生命科学、基因组学和生物技术促进健康”（LSHG-CT-2005-518254）。牛津大学出版社部分免除了本文的开放存取费用，其余费用由ENFIN支付。

利益冲突声明。未声明。

参考文献