干细胞。作者手稿；PMC 2010年7月2日发布。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院211136
人诱导多能干细胞定向分化产生活动性运动神经元
,1,* ,2,三，^* ,5,* ,4 ,5 ,5 ,5 ,三，5 ,6 ,三，7 ,1,^ ,三，4中，8,^和三，5,^
S卡伦巴亚拉姆
1加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院神经病学系
BG诺维奇
2加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院神经生物学系
三加州大学洛杉矶分校博德干细胞中心
M帕特森
5加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系
JA乌姆巴赫
4加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院分子和医学药理学系
里希特
5加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系
林格伦
5加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系
克拉克
三加州大学洛杉矶分校博德干细胞中心
5加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系
SA高盛
6纽约州罗切斯特大学神经病学系转化神经医学中心
K普拉斯
三加州大学洛杉矶分校博德干细胞中心
7加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系
M Wiedau-Pazos先生
1加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院神经病学系
HI Kornblum公司
三加州大学洛杉矶分校广泛干细胞中心
4加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院分子和医学药理学系
8加州大学洛杉矶分校塞梅尔研究所和智障研究中心
WE Lowry公司
三加州大学洛杉矶分校博德干细胞中心
5加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系
1加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院神经病学系
2加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院神经生物学系
三加州大学洛杉矶分校博德干细胞中心
4加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院分子和医学药理学系
5加州大学洛杉矶分校分子、细胞和发育生物学系
6纽约州罗切斯特大学神经病学系转化神经医学中心
7加州大学洛杉矶分校David Geffen医学院生物化学系
8加州大学洛杉矶分校塞梅尔研究所和智障研究中心
*这些作者贡献均等，按字母顺序排列
- 补充资料
图S1。
GUID:82B4A4C8-083F-42BA-911F-B8285C8EF55A
图S2。
GUID:F68DB483-3FF7-41D7-8BDF-B426933BD2A0
图S3。
指南：605A3C46-F413-4037-9224-16B512E5A4DF
摘要
人类诱导多能干细胞定向分化为功能性有丝分裂后神经元表型的潜力尚不清楚。以下方法显示了从人类胚胎干细胞（hESCs）生成运动神经元的有效性，我们发现，一旦指定为神经谱系，人类iPS细胞就可以分化为具有与hESCs相似效率的运动神经元。人类iPS衍生细胞似乎遵循与运动神经元形成相关的正常发育进程，并具有典型的电生理特性。这是首次证明人类iPS衍生细胞能够产生电活动的运动神经元。这些发现证明了将iPS衍生的运动神经元祖细胞和运动神经元用于再生医学应用和在体外运动神经元疾病建模。
介绍
一些研究小组已经证明，在引入产生诱导多能干细胞（iPS细胞）的多能干因子后，将各种类型的人体体细胞重新编程为胚胎状态的可行性[1–4]。iPS技术带来的兴奋是基于利用患者特异性干细胞衍生物治疗疾病或损伤的潜力。从近期来看，它们的价值可能在于有机会模拟人类疾病在体外其病因尚不清楚。运动神经元在许多情况下丢失，包括脊髓损伤、肌萎缩侧索硬化（ALS）和脊髓肌肉萎缩（SMA）。一个主要的治疗目标是开发功能上替代这些细胞的方法，并模拟其疾病状态在体外先前的研究概述了从人类胚胎干细胞（hESCs）中提取功能性运动神经元的方法[5–7]最近的两项研究将类似的方法应用于来自ALS和SMA患者的人类iPS细胞系[8,9]。在人类iPS细胞被用于再生医学或运动神经元疾病建模之前，必须证明这些细胞能够产生具有天然对应物特征的电活性运动神经元。
人类iPS细胞能够产生代表三个胚胎胚层的衍生物在体外类胚体（EB）和体内畸胎瘤检测([1]和图S1). 在这里，我们证明了从小鼠和人类胚胎干细胞中获得运动神经元的两种既定方法也可以用于从人类iPS细胞中产生功能成熟的运动神经元[1]。首先，使用类胚体（EB）分化方案来丰富运动神经元的分化[10,11]。其次，采用贴壁方法对分化细胞的基因表达和电生理特性进行表征[6,7]。对于这两种方法，我们直接比较了不同人类iPS细胞系和HSF1（一种定型的人胚胎干细胞系）产生运动神经元祖细胞和完全分化运动神经元的能力。这项研究的结果将为人类运动神经元疾病的未来研究提供一个平台在体外.
材料和方法
免疫染色
如前所述，对4%多聚甲醛固定、冷冻切片的类胚体和培养细胞进行抗体染色[12]。使用的抗体包括：山羊抗Brn2（sc-6029，Santa Cruz Biotechnology）、山羊抗胆碱乙酰转移酶（ChAT，Millipore）、兔抗Hoxa3和豚鼠抗Hoxa5（由J.Dasen和T.Jessell慷慨提供）[13])、山羊抗Hoxc6（SC-46135，Santa Cruz Biotechnology）、小鼠抗Hoxc 8克隆C952-7E（MMS-266R，Covance）、山羊抗Isl1（AF1837，研发系统）、小鼠抗Isl1克隆39.4D5（发育研究杂交瘤库）、鼠抗Lim3克隆4E12（发育研究杂种瘤库），小鼠抗Nkx6.1克隆F55A10（发育研究杂交瘤库）、兔抗Nkx1（S.Morton和T.Jessell慷慨提供）[14]，豚鼠抗Olig2[13]、小鼠抗Pax6（发育研究杂交瘤库）、小鼠抗Bax7（发育研究杂种瘤库），小鼠抗Nestin（神经组学）、兔抗Sox1、抗Sox2和抗Sox3（均由T.Edlund和J.Muhr慷慨提供）[15]，兔抗β-III微管蛋白（MRB-435P，Covance）。从发育研究杂交瘤库获得的单克隆抗体是在NICHD的赞助下开发的，由爱荷华大学生物科学系维护，爱荷华州爱荷华市，IA 52242。Alexa488-、FITC-、Cy3-和Cy5-结合二级抗体是从Invitrogen或Jackson Immunoresearch获得的。使用配备Apotome光学成像系统的蔡司Axioobserver显微镜或蔡司LSM5励磁机共焦成像系统采集荧光和DIC图像。使用蔡司Axiovision和LSM Excter软件套件以及Adobe Photoshop CS2处理图像。
电生理学
使用标准全细胞电流灯技术在20–23°C下进行电生理学检查。贴片吸管【3–5 uM填充【mM】：140葡萄糖酸钾、10 Na HEPES、1 EGTA、4 ATP-Mg、0.3 GTP、pH 7.2【用KOH调节】。细胞浸泡在[单位：mM]:120 NaCl，1.2 KH中2人事军官4，1.9 KCl，26 NaHCO三，2.2氯化钙2，1.4硫酸镁4，10 D-葡萄糖，7.5 Na HEPES[pH与NaOH达到7.2]与95%O平衡2和5%CO2静息电位维持在约-70mV。分级电流注入的持续时间为0.5msec（步长为100pA）或250msec（步幅为20pA）。使用Digidata 1322A模数转换器以10kHz的频率采样信号，并使用pClamp 6软件采集并存储在计算机硬盘上。使用pClamp 6（Clampfit）离线分析数据。
结果
为了证明人类iPS是否能够分化神经谱系形成运动神经元，我们从人类iPS细胞（hiPS2）和人胚胎干细胞（HSF1）中生成了类胚体（EB），如前所述[1]。EB在缺乏FGF2的人胚胎干细胞培养基中培养一周，然后用维甲酸（RA；1μM）和Sonic Hedgehog通路激动剂（Purmorphamine，1.5μM）再处理一周[16]。众所周知，这种方法可以使EB神经化和腹侧化，这是由腹侧神经祖细胞标志物的表达来定义的[11]。HSF1和人类iPS细胞都遵循一个标准的发育过程，从多能干细胞到神经祖细胞再到完全分化的运动神经元依次分化。由于EB协议以某种随机的方式启动规范，仅HSF1或iPS细胞中的一部分EB被指定为神经性EB，如神经祖细胞标记物Brn2、Sox3和Pax6的免疫染色所示(,图S2).
人胚胎干细胞和人iPS衍生细胞都能产生神经祖细胞HSF1和hiPS2衍生EB在维甲酸（RA）（1μM，Sigma）和Shh途径激动剂紫杉醇（1.5μM，Calbiochem）的存在下生长5-7天，并通过Brn2、Sox3和Pax6免疫染色判断生成的EB中充满神经前体(a-f型). 使用不同的Shh途径激动剂也获得了类似的结果（HhAg1.3，500 nM，Curis，数据未显示）。
我们确实观察到HSF1和hiPS细胞在神经谱系中的表达效率存在显著差异(图S2). 由于多能干细胞系之间分化潜能的明确差异[17]目前尚不清楚这一发现是否反映了胚胎干细胞和诱导多能干细胞之间的内在差异。然而，在那些被指定为神经细胞的EB中，表达神经祖细胞标记物Brn2、Sox3和Pax6的细胞百分比与HSF1或人类iPS细胞来源的EB相似(和数据未显示）。这些发现表明，HSF1和人类iPS衍生细胞都可以定向形成类似的神经祖细胞。
在RA和Shh通路激动剂以及已知可促进运动神经元存活的神经营养因子（CNTF 20 ng/ml、BDNF和GDNF，各10 ng/ml）存在的情况下再过一周，固定、冷冻切片EB，并对其进行Sox3和运动神经元祖细胞标记物Nkx6.1和Olig2的免疫染色。在表达神经祖细胞标记物的EB中，HSF1和人类iPS衍生细胞之间用Nkx6.1和Olig2抗体标记的程度相似()以及Sox3的百分比+表达Olig2的细胞具有可比性（HSF1为59.1%±7.07%，人类iPS衍生细胞为57.6±9.88%）。利用已知对分化运动神经元特异的标记物组合进行进一步分析。在指定神经命运并表达运动神经元祖细胞标记物（Nkx6.1和Olig2）的EB内，观察到少量但显著的Islet1和βIII微管蛋白双阳性神经元(). EB分化方法的物理局限性妨碍了对这些细胞进行详细的功能分析，但这些结果共同提供了证据，证明HSF1和人类iPS细胞都可以被诱导产生分化的运动神经元。
人胚胎干细胞和人iPS衍生细胞的定向分化再现了与运动神经元形成相关的定型进展在RA、Shh途径激动剂和神经营养因子存在的情况下，再经过8-10天，HSF1和人类iPS-衍生EB都含有Sox3+，Nkx6.1型+和Olig2+运动神经元祖细胞(a、 b、d、e). HSF1和人类iPS细胞都能在这些EB内产生分化的Islet1和βIII-管蛋白阳性运动神经元(c（c）和（f）). 比例尺：a–f，100μm。
为了对这些iPS衍生的运动神经元进行生理学表征，我们采用了另一种方法，即利用先前描述的粘附条件进行定向分化[6,7]。通过机械分离HSF1和人iPS1 2和18产生的神经花环，然后在含有RA（1μM）和Shh（200ng/ml）的培养基中将其重新涂覆到层粘连蛋白涂层培养皿上。一周后，添加神经营养因子（BDNF、CNTF和GDNF；各10ng/ml），降低Shh浓度（50ng/ml。HSF1和人iPS衍生细胞都遵循预期的分化过程，从Nestin阳性神经元祖细胞分化而来()，至成熟运动神经元（βIII微管蛋白、胆碱乙酰转移酶（ChAT）和Islet1阳性，). 在HSF1和人iPS衍生的βIII-管蛋白阳性细胞中，检测到类似比例的Islet1-阳性细胞（HSF1为28.2%±5.7%，人iPS2为33.6%±12%）()这再次表明，一旦确定了神经元的命运，人类iPS衍生细胞和HSF1衍生细胞在这些条件下同样有效地生成运动神经元。
来自人类iPS细胞和人胚胎干细胞的神经元表达几种运动神经元损伤因子贴壁培养8-10天后形成的神经玫瑰花结(一和e（电子）). HSF1和hiPS2对玫瑰花结进行机械切割后，Nestin阳性神经前体细胞仍然存在，而分化的神经元表达βIII-管蛋白(b条和（f）). 共焦成像显示运动神经元的明确标记物（包括βIII-管蛋白和Islet1）的双重染色细胞的生成(c（c）和克)，或βIII-管蛋白和ChAT(，天和小时). 将来自的晚期分化神经元瞬时转染Hb9表达（Hb9:：GFP；i-n号). 用识别ChAT的抗体染色证明了报告者对成熟运动神经元的特异性(i、 千米). 与Hoxa5抗体共同训练显示HSF1和hiPS衍生运动神经元的头颈部特征(j、 l、n). 面板i-n中的插图显示了箭头所示Hb9:：GFP阳性细胞中ChAT或Hoxa5的单通道染色。比例尺：a和e:200微米、2b、c、f和g:70微米、2d和h:50微米、i-n:50微米
为了进一步证明这种分化方案能产生脊髓神经元，HSF1和人类iPS细胞的细胞也被脊髓不同区域的标记物和特异性的报告细胞染色血红蛋白9(Mnx1型或血红蛋白9)，编码成熟运动神经元特异表达的转录因子[6]。将Hb9-驱动的GFP报告子转染到HSF1和人iPS衍生细胞中，以识别和靶向运动神经元，其中血红蛋白9转录活跃[6]。该报告者的活性与HSF1和hiPS衍生细胞中头端颈部运动神经元的标志物特征密切相关，如Hoxa5和ChAT()[11,12].
最后，为了确定人类iPS衍生神经元的表型成熟度，我们研究了它们的电生理特性。众所周知，重复动作电位对电流注入的反应是成年脊椎动物运动神经元的典型行为[10]这种重复的放电是随着成熟而发展的[18]。用全细胞膜片钳电流钳模式检测HSF1和人iPS源性运动神经元的兴奋性。在电镀后48至62天记录动作电位。将电流应用于具有Hb9:：GFP活性的人胚胎干细胞或人iPS-衍生神经元后，大约一半的神经元用单动作电位反应，另一半用重复动作电位反应(). 记录完成后，固定神经元并分析Hb9:：GFP表达和ChAT染色，以确认那些对电刺激产生典型运动神经元反应的细胞也具有胆碱能特性(). 来自三个独立的人类iPS细胞系的运动神经元获得了相同的结果，并且与来自HSF1的运动神经元没有区别(图S3). 总之，这些结果证明了从人类iPS细胞中产生电生理活性运动神经元的普遍可行性。
来自人类iPS细胞和人胚胎干细胞的神经元表现出成熟的运动神经元特征Hb9:：GFP表达的人胚胎干细胞和人iPS-衍生神经元的全细胞膜片钳记录显示刺激后重复放电(一和e（电子）). 显示的结果代表了从至少20个来源于人胚胎干细胞和人iPS的细胞上所做的记录。电生理记录后固定的细胞成像显示，这些表达Hb9:：GFP报告子的细胞也含有ChAT(b-d（英国）和f-h（飞行高度）).
讨论
人类胚胎干细胞和人类iPS细胞技术的主要目标是能够产生相关的细胞类型，以修复组织损伤和在体外人类疾病过程的建模。在这里，我们证明了从多个人类iPS细胞系中成功地生成了电活性运动神经元，并提供了证据，证明这些神经元在分子和生理上与来源于人胚胎干细胞的运动神经元没有区别。最近描述了从患有ALS和SMA突变的患者分离出的人类iPS细胞中产生运动神经元的过程，但这些运动神经元的电生理活性尚未评估[8,9]。证明人iPS细胞可以采用功能成熟的这一关键标志，对于人类iPS细胞在运动神经元疾病研究或治疗中的任何未来应用都至关重要。据我们所知，我们的结果首次证明了人类iPS衍生神经元的电活动，并进一步表明了利用这些细胞探索运动神经元活动变化如何导致这些疾病背后的细胞退化的可行性[19,20].
目前尚不清楚为什么这里描述的人类iPS细胞株的潜能在这些实验中表现出比HSF1更低的神经规范化效率。不同类型的人类ES细胞的神经化能力存在显著差异[21]因此，在人类iPS细胞中也可能发现这种差异。更重要的是，这里提供的数据表明，在指定成为神经细胞的细胞中，人类iPS衍生的神经祖细胞被证明与HSF1衍生的细胞一样能够产生运动神经元。这些发现支持了重新编程的体细胞可能被证明是再生医学中胚胎衍生细胞的可行替代品的可能性。最后，由于人类iPS细胞似乎遵循正常的发育进程，发育成成熟的电活动神经元，因此似乎有可能对特定疾病的体细胞进行重新编程并用于建模，最终用于治疗各种人类神经疾病。
致谢
我们感谢J.Dasen、T.Edlund、T.Jessell、S.Morton和J.Muhr慷慨赠送试剂。J.A.U.得到了加州大学洛杉矶分校分子和医学药理学系的支持。B.G.N.得到了March of Dimes基金会、肌肉营养不良协会和NINDS的资助。H.I.K.、S.K.、M.W.P.和S.A.G.得到了Miriam和Sheldon Adelson医学研究基金会以及Adelson神经再生和修复计划的支持。MWP还得到了David Vickter基金会以及Robert和Louise Schwab的支持。W.E.L.获得了CIRM拨款（#RS1-00259-1）和Dimes March of Dimes颁发的Basil O'Connor Starter学者研究奖的支持。
脚注
作者贡献：
Karumbayaram S：概念和设计、数据收集和汇编、数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准；新手B：构思和设计、数据收集和汇编、数据分析和解释、稿件撰写、稿件最终批准、资金支持；Patterson M：数据收集和汇编、数据分析和解释；Umbach J：概念和设计、数据收集和汇编、数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准；Richter L：技术支持，提供学习材料；林格伦A：数据收集和汇编；Conway A：数据收集和汇编；克拉克A：收集和汇编数据，提供财务支持；高盛公司：数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准；Plath K：数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准；Wiedau Pazos M：构思和设计、数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准、资金支持；Kornblum HI：构思和设计、数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准；Lowry WE：构思和设计、数据分析和解释、手稿撰写、手稿最终批准和财务支持。工具书类
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