细胞周期。作者手稿；PMC 2010年7月2日发布。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理2895810
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院211888
这个let-7microRNA靶基因，Mlin41/Trim71型是小鼠胚胎存活和神经管闭合所必需的
分子、细胞和发育生物学系；耶鲁大学；美国康涅狄格州纽黑文
*通信对象：Frank J.Slack；耶鲁大学；MCDB；惠特尼大道266号；美国康涅狄格州纽黑文市，邮编：06520；电话：203.4323492；传真：203.4326161；ude.elay@kcals.knarf †当前地址：动物基因组服务；比较医学科；耶鲁大学医学院；美国康涅狄格州纽黑文
‡现住址：遗传系；耶鲁大学医学院；美国康涅狄格州纽黑文
- 补充资料
补充图1。
GUID:1F1BB648-9E9B-4F7F-A742-4E683274B96D
补充图2。
GUID:27236642-B1D9-4F6A-9E2F-202477A8B4A1
补充图3。
GUID:50BA3A09-F45B-4ECE-B27B-27A3C569C7D2
补充图4。
指南：D6E60347-D010-49F6-A8DE-2569bb5eb4
补充图5。
GUID:B74FA764-4927-491D-8128-183EB938A19C
补充图6。
GUID:8466E284-85C2-4D23-BDBD-55D005E784F8
补充图形图例。
GUID:4CEC8634-313B-4047-8BA5-3B7E710B58AA
摘要
在线虫中秀丽隐杆线虫，的let-7microRNA（miRNA）通过直接调节，部分控制关键发育事件和终末分化的时间林-41。秀丽线虫lin-41突变体表现为表皮细胞的早熟细胞周期退出和终末分化。林-41在包括小鼠和人类在内的更复杂的生物体中发现了同源基因，但其作用尚不清楚。我们生成了姆林41确定小鼠突变体的功能作用姆林41.功能严重丧失姆林41基因捕捉突变体在发育和胚胎致死过程中表现出显著的神经管闭合缺陷。喜欢秀丽线虫林-41，林41似乎也受到let-7和mir-125型miRNA。自姆林41是神经管闭合和生存所必需的，它指向人类林-41(HLIN41/TRIM71)作为一种潜在的人类发育和疾病基因。
关键词：microRNA，let-7，mir-125，mlin41，lin-41，小鼠，敲除，发育，细胞周期
引言
组织形态发生在发育过程中需要严格的空间和时间线索。虽然空间模式化的过程已经有了很好的特征，但只有少数与时间模式化有关的基因，即异慢性基因，已经被确定。异慢性基因已被证明能特异性调节细胞命运决定的时间秀丽线虫。1例如，临41控制缝细胞分化的时间秀丽线虫幼虫到成虫的转变。2 秀丽线虫lin-41突变体表现出成年seam细胞命运的早熟表达，并且也矮胖、不协调和不育，2证明了这一点林-41是生育、神经或肌肉功能以及缝细胞发育所必需的。此外，LIN-41在受影响的组织中表达，即缝细胞、神经元、肌肉和体性腺，2这表明它能自主地发挥细胞功能。
最近的工作表明，包括编码microRNAs（miRNAs）的基因在内的多个异慢性途径成员，三在人类和小鼠中通过序列保守。2,4——7此外，这些基因是通过northern blot或原位杂交确定的时间表达。2——10虽然尚不清楚这些异慢性同源物是否能够调节特定发育事件的时间，但它们的时间表达模式表明，在小鼠早期发育过程中，这一途径具有功能性作用。5,7,8,11具体来说，我们有兴趣确定林-41在鼠标中。
鼠标(Mlin41/Trim71型)和人类(HLIN41/TRIM71)林-41同系物包含相同的RBCC和C末端NHL结构域秀丽线虫lin-41。2,7,8不仅是姆林41和HLIN41/TRIM71高度同源，7,8但它们在3’UTR中也具有高度同源性。7自秀丽线虫lin-41受let-7miRNA与林-413’UTR，12,13我们提出哺乳动物同源物也以3'UTR依赖的方式受miRNAs调控。7假定第7列小鼠和人类中的互补位点（LCS）和miR-125互补位点（MCS）林41已确定3'UTR。7最近的工作表明HLIN41/TRIM71和斑马鱼林41受let-7。14在这里，我们提供证据表明哺乳动物的调节林41也通过miR-125与3'UTR中互补序列的结合介导。
为了确定姆林41在哺乳动物的发育过程中，我们分析了从基因标签插入到姆林41基因座（BayGenomics）。损失姆林41导致胚胎死亡和神经管闭合缺陷。这些研究表明姆林41是哺乳动物发育过程中的一个必需基因，是正确闭合前神经管所必需的。
结果
的特征姆林41基因捕捉线
当姆林41,8映射到相应的基因组序列，我们发现姆林41该位点由4个外显子组成，分布在51 Kb的序列上(). 在姆林41该位点来自BayGenomics（BayGenomecs，CA）。我们确定姆林41XA144型发生在姆林41基因()位于外显子1末端后865 bp（见方法）。预计此插入会截断姆林41外显子1后的蛋白质在N端只剩下271个氨基酸()并删除NHL域和3'UTR。这个姆林41XA144型据预测，截断会导致功能严重丧失，可能对应于零突变。我们产生了纯合子姆林41XA144型小鼠（见方法）并设计PCR引物以进行基因型分析姆林41XA144型动物(,补充图2). 符合严重程度姆林41等位基因，我们检测到姆林41RNA定量RT-PCR姆林41XA144型胚胎().
示意图姆林41XA144型基因陷阱插入姆林41基因组位点（不按比例）。（A） 内含子1中的XA144插入（37 Kb）。（B） XA144基因陷阱插入区扩大。XA144 5’RACE产物在外显子1上突出显示。外显子2为167 bp，而非1676 bp。该行的基因陷阱插入向量是pGT0pfs。基因分型引物显示为MI 23F、MI 18R和MI 26R。（C） 产生XA144基因标记插入转录本。（D） 纯合子和杂合子的RT-PCR分析姆林41XA144型动物。来自相同动物的B-肌动蛋白的RT-PCR显示为对照。
第二个基因陷阱插入姆林41，XD089()，生成了一条鼠标线，称为姆林41XD089型，类似于所描述的姆林41XA144型根据逆转录聚合酶链反应结果，这种插入发生在一个已知的卵裂和多腺苷酸化信号之后姆林41基因(&补充图1). 然而，根据RACE-PCR结果(补充图1)XD089基因陷阱插入产生的转录物预计会生成比预测的内源性Mlin41蛋白短24个氨基酸的蛋白质产物，并且mRNA不包含天然3'UTR。我们预测，这种突变可能导致比姆林41XA144型突变。
姆林41基因捕捉突变系的表达模式
为了识别由姆林41启动子姆林41XA144型和姆林41XD089型老鼠，我们利用了拉奇基因捕捉载体中的报告人，检测胚胎中β-半乳糖苷酶的活性。正如预期的那样，所有野生型胚胎都没有染上蓝色，而杂合子和纯合子都显示出蓝色lacZ公司表达。而lacZ公司纯合子和杂合子突变体的表达模式基本相同，纯合子胚胎()比杂合子染色更浓()可能是由于存在两个基因陷阱载体副本。这个姆林41这里给出的表达模式分析是基于拉奇杂合子胚胎中检测到的模式，因为纯合子动物具有如下所述的形态改变。
这个lacZ公司表达式模式来自姆林41XA144型杂合子。鼻突（NP）、鳃弓（BA）、前肢（FL）、后肢（HL）、中脑/后脑边界（MB/HB）。胚胎没有鳞片。（A） 图9.0：。（B） E10.5。（C） 图11.5。（D） 图12.5。（E）姆林41表达式模式依据就地使用探针pBRM1进行杂交。7
（A）姆林41XA144型纯合胚胎。箭头标记神经管闭合缺陷的位置。胚胎没有鳞片。（B）姆林41XA144型纯合子胚胎与杂合子同卵双胞胎进行比较。第一行是E13.5阶段胚胎。胚胎3第个从左边看是一个腹侧视图。第二行显示E14.5阶段胚胎。
原位杂交研究姆林41神经上皮、鳃弓、面部突起、尾芽、背根神经节和眼睛的瞬时表达以及前肢芽和后肢芽的动态表达模式().7,8世俗的lacZ公司在中观察到表达姆林41XA144型杂合子胚胎(). 在E9.0，lacZ公司表达显得强烈而普遍()，反映了姆林41在此阶段通过northern杂交和原位杂交检测到了先前报道的结果。7按E10.5计算，当总计姆林41mRNA水平下降，7受限制的lacZ公司在这些杂合子胚胎中可以检测到表达模式，中脑/后脑边界和肢芽内有强烈的染色，鳃弓、面部突起、眼睛、尾芽和背根神经节也有染色().lacZ公司在E11.5和E12.5，仍能在大脑、背根神经节、面部突起、眼睛和四肢中检测到表达。在E11.5的前肢芽中，表达较早期更为远，而在后肢芽中表达广泛，但在远端表达强烈(). 通过E12.5，前肢芽中的表达不再被检测到，后肢芽的表达定位于远端(). 这个姆林41XA144型 lacZ公司在胚胎发育过程中，发育中肢体的表达模式是动态的，与原位杂交分析所观察到的相似。7,8在第二个姆林41基因陷阱线，姆林41XD089型(补充图5). 基于动态表达式姆林41，我们预测姆林41在这些组织的发育过程中起重要作用。
姆林41XA144型突变体表现出胚胎致死性
杂合的姆林41XA144型对小鼠进行交配，并在发育阶段E8.5至E16.5收集胚胎进行分析。基因型分析显示，当胚胎在E8.5或更早的时候被处死时，可以观察到孟德尔比率(n个=44个胚胎）。E8.5后，胚胎基因型没有按照预期的孟德尔比率进行分离。纯合突变胚胎显著减少，这意味着E8.5后的一段时间内发生胚胎致死。具体来说，在E9.0和E9.5之间仅回收了15.6%的纯合突变胚胎(n个=135个胚胎）。对收集到的纯合子突变、杂合子和野生型胚胎进行孟德尔比率检验的齐方分析表明，纯合子突变体胚胎的百分比明显低于预期的25%（p值≤0.05）。之后纯合突变胚胎的百分比急剧下降，到E16.5时达到0%(n个=145个胚胎（E14.5–E16.5）。在寿命足以长出肢芽的少数−/−动物中未检测到明显的早期肢体缺陷()但少数存活的E13.5天胚胎出现异常血池(). 两个罕见的E14.5胚胎看起来异常，与野生型相比，都较小且呈白色，可能正在经历吸收过程().
姆林41XA144型突变体显示神经管异常闭合
纯合子姆林41XA144型突变胚胎显示前神经管闭合缺陷导致前脑突出（100%，n个= 76). 开放性神经皱襞外翻、扩大，无法融合15脑组织被暴露(). 然而，在胚胎脊髓后部，神经管的闭合是正确完成的。E14.5采集的胚胎暴露了脑组织，看起来比野生型同窝婴儿小(). 在姆林41XD089型等位基因(补充图6，如下所述）。
为了更密切地评估开放性神经管缺损和其他解剖结构的潜在异常，在野生型和姆林41XA144型收集并比较了杂合子胚胎发生(). 在−/−胚胎中，可以清楚地看到开放的神经管(和补充图3)结果，大脑结构似乎发生了改变。大脑心室和其他结构似乎与+/-胚胎的心室位置不同。在E11.5处，打开的神经管()与+/-室友相比，暴露的脑组织也被清楚地检测到，脑室的位置不正确(). 在E11.5时，包括心脏、肝脏、肺和其他器官在内的躯干区域的其他解剖结构在大小、结构和位置上在纯合突变体和杂合同窝出生的配偶之间似乎相似。通过E12.5，开放的神经管()与杂合子同窝婴儿相比，暴露的脑组织仍然可以检测到，脑室也很难检测到(). 我们分析了面部和躯干区域的其他结构，发现大多数面部结构都正常，包括舌头。然而，也观察到面部突起的可能裂开缺陷和鼻突（未来鼻子的位置）的异常(箭头）。
神经管闭合缺陷姆林41突变体。姆林41XA144型矢状切面（A）E11.5纯合子突变（−/−）。（B） E11.5杂合子胚胎（+/-）每个14µm，（C）E12.5−/−[箭头]界定了异常鼻突。（D） E12.5+/-，[*]划分开放神经管（A和C）、鼻突（NP），3第个心室（第三V），4第个心室（第四V）、侧心室（LV）、中脑（MB）、心脏（H）、肝脏（L）、肺（Lu）、舌（T）、下颌（LJ）。胚胎没有鳞片。
通过横切面分析突变E12.5胚胎，以更密切地观察大脑异常(补充图4A–H). 同样，与野生型室友相比，开放的神经管很明显，裸露的脑组织在头部周围展开。侧脑室(突变体中未检测到LV in+/+），很可能是由于开放性神经管缺陷导致周围组织无法闭合。
姆林41XD089型纯合胚胎，类似于姆林41XA144型胚胎，表现为开放性神经管缺陷导致出头，但在低外显率下，56%的纯合胚胎(n个=23）(补充图6). LacZ表达模式也类似于为姆林41XA144型线路(补充图5). 这些结果支持了我们的说法姆林41功能促进适当的神经管闭合。
这个姆林413'UTR传授let-7和miR-125介导的对报告基因的抑制
秀丽线虫lin-41受let-7和线-4miRNAs到3'UTR。人类和老鼠林-41直系亲属，HLIN41号机组和姆林41，都包含多重保守let-7和mir-125型（该线-4直系）3'UTR中的互补位点。7要测试姆林413'UTR提供监管信息姆林41将3'UTR融合在pGL3-控制载体（Promega）中荧光素酶报告基因的后面，生成pGL3-姆林41将该构建物转染到人类HeLa细胞中，已知HeLa可以表达let-7和miR-125家族的miRNAs。16与对照3’UTR相比姆林413'UTR对报告基因施加2到3倍的抑制(). 这个姆林413'UTR的作用几乎与已建立的let-7靶基因，克拉斯().16这表明姆林413'UTR促进基因抑制。
（A） 姆林41与pGL3对照中的对照SV40 3'UTR相比，3'UTRs足以抑制HeLa细胞中荧光素酶报告基因的表达（每个数据点n=3）。误差线表示标准偏差。（B） 由姆林413'UTR取决于let-7和mir-125型HeLa细胞转染抗miRslet-7b（B） 和mir-125b型（C） 与对照抗miR相比，测量荧光素酶表达的相对水平。两者都是反-let-7b（n=3，p<0.05）和抗-mir-125b型（n=6，p<0.05）导致报告基因表达显著降低，具有统计学意义。误差线表示标准偏差。
基于let-73'UTR和miR-125位点姆林41,7我们测试了这些miRNAs的结合是否负责抑制姆林413英尺UTR。人HeLa细胞与pGL3共转染-姆林41质粒和任一对照，let-7或miR-125抗miRs。抗miRs是由2'O-甲基化RNA寡核苷酸组成的抑制剂，与miRNA互补。17这些抗miRs被证明可以阻断内源性let-7或miR-125功能。16将使用这些抗miRs所观察到的表达与使用由与第7列或miR-125。我们发现荧光素酶的表达在let-7或mir-125型抗miR()证明了姆林413'UTR取决于let-7和miR-125。
讨论
我们对脊椎动物发育基因的许多知识都大量借鉴了最初在无脊椎动物中的发现。通过继续研究无脊椎动物发育基因的脊椎动物同源基因的功能，我们希望能更好地了解哺乳动物的发育。基于林-41在期间秀丽线虫发展，除了表达姆林41通过原位杂交和northern blot分析检测，7我们假设姆林41参与控制小鼠胚胎发生的事件。为了描述姆林41在小鼠发育过程中，我们产生了两条基因陷阱插入线，姆林41XA144型和姆林41XD089型，并分析了他们的突变后代。XA144基因陷阱插入内含子1的5'区，预计会导致Mlin41蛋白的N端截短，而XD089插入预计会导致短的C端截短。这两个等位基因都会导致渗透性神经管闭合缺陷和胚胎致死。尽管姆林41XA144型突变体在胚胎发生过程中死亡，胚胎死亡不太可能是由其神经管缺陷引起的。有一些特征明确的突变体表明神经管闭合缺陷会导致前脑畸形，但这些突变体能够存活到胚胎发育后期甚至出生。15
我们之前报道过内源性姆林41在E9.5左右的某个时候，发育中的小鼠胚胎中的表达下调，对应于第7列和密尔-125miRNA。7在姆林413'UTR用于let-7，miR-125，7也许还有其他的miRNAs。最近的研究表明，当鸡林41(格林41)或姆林413'UTR被转染到let-7表达HeLa细胞，荧光素酶报告活性受到抑制8我们已经确认并扩展了这个结果(). Kanamoto等人对LCS进行了进一步的实验格林41表明压制记者活动需要LCS格林413英尺UTR。我们扩展此分析以表明let-7miR-125也调节姆林41.使用姆林41荧光素酶报告子下游的3'UTR和第7列或miR-125抗-miR共转染HeLa细胞，显示与阴性对照相比，报告基因表达增加。这表明姆林413'UTR可能介导let-7体内miR-125阻遏。这些实验是已知的let-7以及miR-125与哺乳动物lin-41直接相互作用。因此，类似于秀丽线虫lin-41通过let-7,12,13我们的结果表明姆林41该基因受miR-125 miRNAs与姆林413英尺UTR。
我们检测到非常相似的表达模式姆林41在比较lacZ公司的表达模式姆林41XA144型胚胎的原位杂交模式姆林41探查。7中脑/后脑边界可能被证明是一个区别性的表达区域姆林41监管。稳健姆林41原位杂交几乎无法检测到中脑/后脑交界处基因捕捉线的表达(). 为了理解这种表达上的差异，我们指出姆林41XA144型基因陷阱插入发生在的内含子1中姆林41并截断基因的信使核糖核酸(). 因此，编码序列和3'UTR的剩余mRNA在姆林41XA144型基因标记的动物，因此它可能不会受到mRNA稳定性的3'负面影响，例如通过miRNA调节。这个姆林41原位杂交探针杂交到全长姆林41mRNA，因此，与基因陷阱插入线相反，检测姆林41mRNA是稳定表达的，而不仅仅是在启动子有活性的地方。我们推测lacZ公司记者进入姆林41xa144型不受miRNAs对姆林41mRNA，因为它缺乏正常的3'UTR，导致异位lacZ公司在这个大脑区域的表达。我们假设miRNA-介导的姆林41通过其3'UTR对正常运行至关重要姆林41表达和功能。
为了支持这一假设，最近的研究表明，miR-125在E9.5小鼠胚胎大脑中中脑/后脑边界正前方和重叠的区域表达9因此正好位于姆林41XA144型lacZ公司表达域。细胞中的相邻表达域和miR-125结合位点的存在姆林413'UTR及其对姆林41通过HeLa细胞中的miR-125，我们推测它也可能下调姆林41大脑中的表达。还表明let-7可通过原位杂交在E9.5小鼠胚胎的大脑中检测到，其模式类似于miR-125。18因此，有可能let-7和miR-125调节姆林41通过3'UTR表达，中脑/后脑边界的这种下调对正常发育和神经管闭合至关重要。
这个lacZ公司我们在中脑/后脑边界观察到的姆林41XA144型杂合子合并开放性神经管缺陷姆林41XA144型纯合子是强有力的证据姆林41在脊椎动物神经管闭合中起作用。应该注意的是，未能关闭中脑/后脑区域任何地方的神经管都会导致前脑出血。15中的突变姆林41可能会改变中脑/后脑边界处神经管的起始或正确闭合，从而导致出头。我们推测在正常情况下姆林41在神经上皮区早期广泛表达，可能阻断抑制神经管闭合或神经管闭合时间的基因功能。然后，在神经管闭合之前和期间，我们建议姆林41可能是因为let-7或miR-125，以及对神经管完全闭合重要的下游基因能够发挥作用。然而，姆林41-被驱动的lacZ公司杂合子胚胎的中脑/后脑边界仍然可以检测到其表达，因为它不能通过其3'UTR进行调节，尽管存在足够的野生型Mlin41以进行适当的神经管闭合。
我们表明姆林41导致神经管闭合缺陷，但驱动这一缺陷的分子相互作用尚不清楚。与Mlin41、Mei-P26和Dappled同源的两种果蝇RBCC-NHL蛋白与Argonaute蛋白和miRNAs相互作用，具体而言，Dappled受let-7。19,20有趣的是，另一种哺乳动物异时基因同源物Ago2(alg-2型在里面秀丽线虫)已证明可导致小鼠胚胎的胚胎死亡和神经管闭合缺陷。5进一步的研究将阐明如何姆林41脊椎动物发育过程中的功能，特别是在神经管中。这将有助于更好地了解神经管闭合和脊椎动物异慢性基因同源物的作用。
材料和方法
基因陷阱插入线
这个姆林41序列被用于探测BayGenomics数据库(www.baygenomics.com)基因陷阱插入的潜在ES克隆林41位点，显示XA144（pGT0pfs矢量）和XD089（pGT1Lxf矢量）插入(补充图1). 基因陷阱插入载体包含一个强剪接受体位点和一个lacZ公司磁带，和通常被发现插入一个内含子。使用载体特异性引物通过5'RACE检测受影响的基因(,补充图1).
从BayGenomics获得的ES细胞系由129P2（129Ola）小鼠产生，并由耶鲁动物基因组服务公司注射到C57BL/6J囊胚中，然后植入野生型CD-1假孕雌性小鼠。将嵌合体后代与C57BL/6J小鼠交配，筛选F1代是否存在基因陷阱插入载体，以确定创始人().
姆林41XA144型基因分型
XA144基因陷阱插入位于姆林41根据5'RACE（BayGenomics数据库，补充图1). XA144在内含子1中的准确位置是使用基因陷阱载体（pGT0pfs）特有的引物66R和内含子引物MI 1发现的。这通过测序和使用引物MI 13F和MI 12R的巢式PCR进行验证。一旦XA144基因陷阱插入的精确位置确定()，使用基因陷阱插入载体（MI 18R）内的引物和XA144插入两侧基因组小鼠序列的正向（MI 23F）和反向（MI 26R）引物实施多重PCR基因分型策略。PCR产物如下：野生型后代——一条350 bp的单带（MI 23F和MI 26R）；纯合的姆林-41XA144型-一条230 bp的单条带，代表PCR与MI 23F和MI 18R的产物；杂合的姆林-41XA144型动物-350 bp和230 bp带(补充图2). 基因分型和PCR引物序列：MI 18R（5'-GTG GAG GGT GGT GTG GGA AAG CCT TC-3’）、MI 23F AGC TTA TGC TAC CC-3’）和MI 12R（5'-GAA AGA CCT GAC TTG GGT CCC CGGG-3'）。
姆林41XD089型基因分型
根据BayGenomics报道的5’RACE反应，XD089插入位于姆林41(补充图1). 要确定其插入到姆林41基因座，采用反向PCR。XD089 ES细胞DNA用消息传递程序一、 提纯并连接回自身。该连接产物被用作PCR模板，带有基因陷阱插入载体pGT1Lxf、66R和80F的特异性引物。巢式PCR使用引物66R和79F获得了相同的产物，并对该产物进行了测序。这表明插入发生在已知末端下游2.7 Kb处姆林413'UTR，按之前未预测为林-41cDNA(). 采用多重PCR策略对XD089基因陷阱系的胚胎组织进行基因分型。PCR产物可包含野生型570 bp的单一条带（OFSEST 24和OFSEST 25）；605 bp的带代表XD089插入（80R和OFSEST 24）；或杂合动物中的两条带。基因分型和PCR引物序列：OFSEST 24（5’-GGC GTG CCC TTT TAG TGG GAA CTC-3’）、OFSEST 25（5’-CAT TAA AAG GGG TCT AAG ACC AAT GC-3’）、80R（5’-ATT CAG GCT GCG CTG GG-3’），66R（5‘-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3’TACT-3’）。
lacZ公司侦查
行XA144和XD089中的基因陷阱插入包含一个lacZ公司允许对姆林41轨迹。获取不同发育阶段的胚胎进行β-半乳糖苷酶检测。将胚胎从PBS中的卵黄囊中分离出来，并将其固定在组织固定剂（专用培养基）中40至90分钟。处理卵黄囊并进行基因分型。固定后，胚胎在室温下在组织冲洗溶液A（特殊培养基）中洗涤2次，在组织冲洗溶液B（特殊培养基）中洗涤2次。通过在37°C下加热组织染色基溶液（专用培养基）并在1:40稀释度下添加X-gal储备溶液（专用介质），制备X-gal检测溶液。将X-gal染色液涂在胚胎上，并将其置于37°C下1小时直至过夜。随后拍摄染成蓝色的胚胎。
RNA提取和RT-PCR
对第8.5天的小鼠胚胎进行显微分离，以用作RT-PCR的模板。在使用杵电机（Kontes）均质样品颗粒后，按照制造商的指示，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从胚胎中提取总RNA。根据制造商的协议，使用Iscript cDNA合成试剂盒（加利福尼亚州Hercules市Bio-Red）从总RNA中提取cDNA，并使用从MLin41号机组外显子3和4。底漆1（5'-GAA GGT GGT CCA GTC TGA GGTC-3'），底漆2（5'-CTG ACA AAG CCA ATA GAC TTG AGG-3'）。
小鼠B肌动蛋白对照引物如下：F（5'-GTG-GGC-CGC-TCT-AGG-CAC-CAA-3'），R（5'-CTC TTT-GAT GTC-ACG-CAC-GAT-TTC-3'）。PCR条件为95℃，3分钟；94°C，30秒；60°C，1分钟；72°C，使用GoTaq Flexi DNA聚合酶（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）进行29个周期，1分钟。
胚胎切片和H&E染色
将小鼠胚胎在4°C的4%多聚甲醛中固定过夜。处理卵黄囊并进行基因分型。然后将胚胎储存在4°C的0.5 M蔗糖中，直至冷冻。胚胎被放置在塑料模具中的OCT培养基中，并在液氮中快速冷冻。这些块在−80°C下储存。使用低温恒温器（由Wiemin Zhong实验室慷慨共享的徕卡3050S）将胚胎切片至Superfrost/Plus载玻片（Fisher）上，并用苏木精和伊红（Polysiciences）进行组织学分析。
荧光素酶报告分析
构建pGL3-姆林41质粒姆林41以小鼠基因组DNA为模板，通过PCR扩增3'UTR，用Xba公司一、 并连接到用相同酶消化的pGL3-对照（Promega）。引物序列为：mLin41S:（5'-TCA TCT AGA TTG TGT CTT CTG-3'），mLin41AS:（5'-TCA TCT-AGA CAT ATA CTG TG-3’）。
HeLa S3细胞生长于37°C和5%CO条件下添加10%胎牛血清（Invitrogen）的DMEM中2在24孔板中联合转染0.25 ng/孔pGL3-姆林41或pGL3和0.1 ng/孔的pRL-TK（Promega），以及最终浓度为200 nM的抗miRs（Ambion），根据制造商提供的方案使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）。24小时培养后，按照制造商的指示，使用双荧光素酶检测试剂盒（Promega）采集细胞并进行检测。萤火虫荧光素酶活性的值比雷尼拉荧光素素酶的值标准化。
致谢
基因陷阱ES细胞由加利福尼亚州BayGenomics慷慨提供。ES细胞由耶鲁动物基因组服务公司与Tim Notolli博士一起注射到小鼠体内。特别感谢Imran Babar、Michelle Boehm和Aurora Esquela-Kerscher帮助准备这份手稿，冷冻切片是在Wiemin Zhong实验室提供的低温恒温器上切割的。这项工作得到了耶鲁肌肉骨骼疾病核心中心的资助，以及NIH的资助（GM 62594和GM 64701）。
工具书类
1Ambros V，Horvitz HR.线虫的异慢性突变体秀丽隐杆线虫。科学。1984;226:409–416.[公共医学][谷歌学者] 2Slack FJ、Basson M、Liu Z、Ambros V、Horvitz HR、Ruvkun G。lin-41 RBCC基因在秀丽线虫let-7调节RNA和LIN-29转录因子之间的异慢性途径。分子细胞。2000;5:659–669.[公共医学][谷歌学者] 三。Lim LP、Lau NC、Weinstein EG、Abdelhakim A、Yekta S、Rhoades MW等秀丽隐杆线虫。基因发育。2003;17:991–1008. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Lagos-Quintana M，Rauhut R，Yalcin A，Meyer J，Lendecel W，Tuschl T.小鼠组织特异性微RNA的鉴定。当前生物量。2002;12:735–739.[公共医学][谷歌学者] 5Liu J、Carmell MA、Rivas FV、Marsden CG、Thomson JM、Song JJ等。Argonaute2是哺乳动物RNAi的催化引擎。科学。2004;305:1437–1441.[公共医学][谷歌学者] 6Moss EG，Tang L.异慢性调节因子Lin-28的保存、其发育表达和microRNA互补位点。开发生物学。2003;258:432–442.[公共医学][谷歌学者] 7Schulman BR，Esquela-Kerscher A，Slack FJ。小鼠胚胎发生过程中lin-41和microRNAs let-7和mir-125的相互表达。开发动态。2005;234:1046–1054. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Kanamoto T，Terada K，Yoshikawa H，Furukawa T。林-41脊椎动物同源物的克隆和调控秀丽隐杆线虫。开发动态。2006;235:1142–1149.[公共医学][谷歌学者] 9Kloosterman WP、Wienhold E、de Bruijn E、Kauppinen S、Plasterk RH。使用LNA修饰的寡核苷酸探针原位检测动物胚胎中的miRNAs。自然方法。2006;三：27–29。[公共医学][谷歌学者] 10Mansfield JH、Harfe BD、Nissen R、Oberauer J、Srineel J、Chaudhuri A等。MicroRNA-responsive‘sensor’转基因揭示了脊椎动物MicroRNA表达的Hox-like和其他发育调控模式。自然遗传学。2004;36:1079–1083.[公共医学][谷歌学者] 11Lancman JJ、Caruccio NC、Harfe BD、Pasquinelli AE、Schageman JJ、Pertsemlidis A等。鸡和小鼠肢体发育过程中lin-41调控的分析。开发动态。2005;234:948–960.[公共医学][谷歌学者] 12Vella MC、Choi EY、Lin SY、Reinert K、Slack FJ秀丽线虫microRNA let-7与lin-41 3'UTR中不完善的let-7互补位点结合。基因发育。2004;18:132–137. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13Vella MC，Reinert K，Slack FJ。一种经验证的微小核糖核酸靶标相互作用的结构。化学生物。2004;11：1619年至1623年。[公共医学][谷歌学者] 14Lin YC、Hsieh LC、Kuo MW、Yu J、Kuo HH、Lo WL等。人类TRIM71及其线虫同源物是let-7 microRNA的靶点，斑马鱼同源物对发育至关重要。分子生物学进化。2007;24:2525–2534.[公共医学][谷歌学者] 15警察AJ、Greene ND、Murdoch JN。哺乳动物神经发育的遗传基础。Nat Rev基因。2003;4:784–793.[公共医学][谷歌学者] 16Johnson SM、Grosshans H、Shingara J、Byrom M、Jarvis R、Cheng A等。RAS受let-7 microRNA家族调控。细胞。2005;120:635–647.[公共医学][谷歌学者] 17Hutvagner G，Simard MJ，Mello CC，Zamore PD。小RNA功能的序列特异性抑制。《公共科学图书馆·生物学》。2004;2:98. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Wulczyn FG、Smirnova L、Rybak A、Brandt C、Kwidzinski E、Ninnemann O等。神经细胞规范期间let-7 microRNA的转录后调控。法赛布·J。2006[公共医学][谷歌学者] 19Neumuler RA、Betschinger J、Fischer A、Bushati N、Poernbacher I、Mechtler K等。Mei-P26调节果蝇卵巢干细胞系中的微RNA和细胞生长。自然。2008;454:241–245. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20O'Farrell F、Esfahani SS、Engstrom Y、Kylsten P。let-7对果蝇lin-41同源物的调控揭示了lin-41亚叶内调控机制的保守性。开发动态。2008;237:196–208.[公共医学][谷歌学者] 
