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国家协议。作者手稿；可在PMC 2010年7月1日获得。
以最终编辑形式发布为：
国家协议。2006; 1(2): 848–858.
数字对象标识：1038/nprot.2006.116年10月10日
预防性维修识别码：PMC2895266型
NIHMSID公司：美国国家卫生研究院207873
PMID：17406317

莫里斯水迷宫：空间和相关学习记忆形式的评估程序

查尔斯·沃希斯和迈克尔·威廉姆斯
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

莫里斯水迷宫（MWM）是一项啮齿动物空间学习测试，它依靠远端线索从开放式游泳场周边的起始位置导航，以定位水下逃生平台。空间学习通过重复试验进行评估，参考记忆由平台缺失时对平台区域的偏好决定。反转和移位试验增强了对空间损伤的检测。实验依赖性学习、潜在学习和辨别学习可以通过修改基本方案进行评估。搜索到平台的区域决定了对空间策略与非空间策略的依赖程度。线索试验确定是否存在与地点学习无关的绩效因素。从水中逃生相对来说不受活动或体重差异的影响，这是许多实验模型的理想选择。MWM已被证明是一项稳健可靠的测试，与海马突触可塑性和NMDA受体功能密切相关。我们提出了执行MWM测试变体的方案，从中可以在6天内从单个动物中获得结果。

简介

许多水迷宫已经开发出来，但被称为“水迷宫”的是理查德·莫里斯（Richard Morris）开发的1迷宫被设计为评估空间或地点学习的方法，并且在本文中将被称为Morris水迷宫（MWM）。莫里斯在1984年描述了基本程序（参考。2)随后增加了评估相关学习和记忆形式的细节和程序三多个特征促成了MWM的普遍使用。这些因素包括缺乏必要的预训练，其在各种坦克配置和测试程序中的高可靠性，其跨物种效用（大鼠、小鼠和人类（在虚拟迷宫中）4))，大量证据表明其作为海马依赖性空间导航和参考记忆测量的有效性5其作为位置学习的一种测量手段的特异性，以及在一系列实验治疗效应中对动机差异的相对免疫力，这些实验治疗效应是次要的任务中心目的（遗传、药理、营养、毒理学和损伤）。尽管后者是所有水迷宫的共同特征6MWM利用了这一优势。例如，大鼠的海马和隔-海马病变确实会诱发多动，但这些动物的MWM表现出缺陷7相反，导致活动减退的治疗可以与MWM中的学习缺陷相分离。例如，研究表明，MWM学习障碍与运动影响无关，因为陆地运动减少不会影响游泳速度。此外，当实验动物在探测试验中出现缺陷时，这进一步将学习与表现分离，因为探测试验中记录的测量值对游泳速度不敏感8。

已经回顾了MWM在评估学习和记忆方面的应用9,10以及MWM的表现与神经递质系统和药物效应之间的关系11MWM的表现与长时程增强（LTP）和NMDA受体功能有关12–15这使得它成为研究海马回路的关键技术。此外，研究表明，内嗅皮层和嗅周皮层以及前额叶皮层、扣带回皮层、新纹状体，甚至小脑的参与程度更为有限10。

尽管MWM得到了广泛使用，但该任务并没有得到最佳使用。其中一些原因是对仪器和测试程序方面的低估，这些方面对于获得最佳数据最为显著。在这里，我们提供了该仪器的描述、其关键特征和协议，这些协议对于检测药物/疾病引起的空间学习和记忆变化是有效和可靠的16–20或因基因操纵而产生的变化21–28我们还提供了基本协议的变体，可用于增强对空间导航的评估和/或相关学习类型（潜在学习、辨别学习和线索学习或工作记忆）的测试。

MWM不是通常意义上的迷宫——也就是说，它不是迷宫；相反，它是一个开放的圆形水池，里面大约装满了一半的水。内部的设计使其尽可能地没有特色。这是一个“迷宫”，从这个意义上说，动物必须搜索，才能找到一个相对较小的目标（一个隐藏的平台），这个目标淹没在水面下，并放置在一个固定的位置。平台可以通过在水中放置不透明材料（通常是蛋彩画或聚丙烯颗粒）、创建几乎不可见的平台与背景颜色匹配或在彩色背景下使用透明平台进行伪装，因此，由于动物在游泳时所看到的与水的视觉纵横比很低，因此它很模糊。

标准做法是指定迷宫的两个主轴，每条线将迷宫垂直平分，以创建一个假想的“+”。每条线的末端划分四个基点：北（N）、南（S）、东（E）和西（W）。这些不是真正的磁罗盘方向，而是指S是实验者的位置，N是相反的点，E是实验器的右侧，W是实验员的左侧。以这种方式划分迷宫会创建四个相等的象限。平台位于其中一个象限的中间。可以在所有试验中将平台保持在一个象限内，也可以在每个象限内用平台测试四分之一的动物。后一种方法抵消了可能的象限效应。甚至可以使用八个不同的平台位置22。平台通常位于中心和墙壁之间的中间位置，与所选的象限无关，尽管有时会使用其他布置29。

测试协议

空间采集

地点或空间学习是最基本的MWM程序。其背后的概念是，当从坦克周围不同的随机位置出发时，动物必须学会使用远端线索导航到隐藏平台的直接路径。如果没有可用的近端线索，则使用远端线索是实现这一点的最有效策略。大多数方案使用四个起始位置：N、S、E和W。动物每天都要进行一系列随机或半随机的起始位置试验。半随机起始位置集是最常见的，例如使用四个位置，限制是每天从四个位置中的每个位置进行一次试验。少数调查员使用八个起始位置30一个关于基本起始位置的担忧是，它们与目标的距离不相等，从而形成了通往目标的长短路径。即使在一个大迷宫中，从E开始，目标位于SE的老鼠也有很短的路径到达目标。这个问题没有完美的解决方案。我们使用的部分解决方案是仅使用远端起始位置18我们的意思是，如果目标是SE，那么可以使用N、W、NE和SW的起始位置。虽然与球门的距离不相等，但这些起始位置比使用与球门相邻的起始位置更接近于长度相等。另一种方法可能是只使用两个起始位置，例如N和Wonly，但必须注意动物可能会记住特定的路线，而不是使用远端线索。第三种方法是使用三个起始位置，每个位置都在包含平台的象限之外的象限中31然而，其中只有两个长度相等。

表1显示了一组用于基本采集训练的半随机选择的远端起始位置，平台位于SW象限。这些设计是为了让动物在每天使用四个起始位置中的每一个位置一次的同时，无法学习右转弯或左转弯的特定顺序来定位平台。如图所示表1学习试验为期5天，每天4次。试验之间的间隔可以从10–15秒到5–15分钟不等。如果动物未能在指定时间内找到平台，通常会将其捡起并放置在平台上约15秒，尽管有证据表明，在学习如何导航到目标的过程中，游泳路径的中间部分似乎是最重要的，但一些人还是倾向于引导动物到达目标32。

表1

莫里斯水迷宫空间（隐藏平台）起始位置。

收购
天试验1试验2试验3试验4
1N个E类SE公司西北
2SE公司N个西北E类
三西北SE公司E类N个
4E类西北N个SE公司
5N个SE公司E类西北
6（探头）氖
倒转
天试验1试验2试验3试验4
1S公司W公司西北SE公司
2西北S公司SE公司W公司
三SE公司西北W公司S公司
4W公司SE公司S公司西北
5S公司西北W公司SE公司
6（探头）软件

使用远端位置的起始位置示例，目标（平台）在采集期间位于西南象限，在反转期间位于东北象限。启动顺序的设计应确保在相同次数的试验中，目标位于动物的右侧或左侧，并且每天从四个启动位置中的每个位置进行一次试验。

为了在学习结束时评估参考记忆，进行了一项探究（转移）试验。最常见的方法是在最后一次采集日后24小时进行一次探针试验。通过一些程序，在最后一次学习试验后立即进行探索试验；然而，这不能区分短期记忆和长期记忆，因为它可能反映了最近一次训练的记忆。如果要独立于上一次培训的记忆来确定参考记忆，那么上一次训练试验和探索试验之间的长时间间隔至关重要。

在学习阶段，有时会进行额外的探索性试验：这些试验通常在当天的第一次学习试验之前进行。这些额外的探测试验可能有助于确定记忆巩固的速度，因为这允许在几天内逐渐出现目标象限偏好。然而，应谨慎行事，不要进行过多的探针试验，因为这些是灭绝试验，可能会减缓学习速度。

空间反转

将平台重新定位到另一个象限（通常是相反的象限）并在另外5天内每天管理另一组四个试验越来越常见，信息量也越来越大(表1). 这通常被称为反向学习，尽管这个术语并不精确，因为游到相反的象限并不像在T型迷宫中那样是初始问题的镜像。MWM中的反向学习揭示了动物是否能够消除对平台位置的初始学习，并获得通往新目标位置的直接路径。跟踪模式通常显示，老鼠先游到以前的位置，然后开始以拱形模式搜索以达到新目标(图1). 即使在多次试验后，小鼠也不会完全放弃最初的学习策略，而是开始向原来的平台位置移动，然后转向并更直接地游向新的目标。另一方面，老鼠会迅速将搜索策略切换到新的目标位置(图2). 事实上，大鼠很快就从原来的目标位置切换到另一个位置，因此在反转第1天的前四个试验中，平均无法看到超过概率（即25%）的对原始平台位置的返回访问，但在反转测试的第一天内，可能会在单个试验中看到。与采集阶段一样，在反转阶段结束时，将在24小时后进行反转探测试验。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms207873f1.jpg

C57BL小鼠每天莫里斯水迷宫测试各象限的时间百分比。在学习逆转阶段，即在平台位于SW象限的采集训练6天后，对未经治疗的C57BL雄性小鼠每天进行四次试验（平均值±标准偏差），得出平均结果。在所示试验期间(一–天)，平台从西南象限移动到东北象限。在“旧”或以前的SW目标象限中可以看到时间百分比的逐渐减少，并逐渐转移到“新”的NW目标位置（坦克直径，122厘米）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为nihms207873f2.jpg

在Sprague–Dawley大鼠中进行测试的每一天，Morris水迷宫性能各象限的时间百分比。在学习逆转阶段，每天对未经治疗的Sprague-Dawley雄性大鼠进行四次试验（平均值±SEM），得出平均结果，如图1在采办培训期间和所示试验期间，平台位于SW象限(一–天)，平台从西南象限移动到东北象限。如图所示，大鼠从“旧”SW位置快速切换到“新”NE平台位置，而不会停留在原始平台象限上（坦克直径，210 cm）。

带有较小平台的空间双反转

许多变化可以添加到基本的MWM程序中，这些变化可以为理解观察到的缺陷添加有价值的信息，甚至可以揭示在习得或反向学习过程中没有看到的更微妙的缺陷。我们手中有效的一个程序是再次移动平台，要么回到最初的目标（双反转），要么回到不同的象限（移位），但有一个额外的改变：使用较小的平台17例如，如果起始平台为10×10 cm，则缩小后的平台可能为5×5 cm。平台尺寸的减小会对动物的空间精度要求造成负担，并揭示了一些药物或剂量的影响，而这些药物或剂量在获取或逆转过程中是看不到的16,20。在本阶段测试结束后24小时，还进行了简化的平台探针测试。

重复学习

另一个程序是连续进行一组反转或移位相位19这样可以检查动物在新学习的多个阶段学习能力的灵活性。数据还显示了将平台移动到不同象限的效果。例如，如果平台移动到相邻象限，新的学习比移动到相反象限更快19。

空间工作记忆

上述程序用于评估独立于试验的学习（即，在给定的测试阶段，目标不会从试验转移到试验）。要评估工作或试验依赖性学习和记忆，需要不同的方法。在这一过程中，也被称为样本匹配，平台每天都要重新定位，动物每天要进行两次（或更多）试验（参见表2). 每天，第一次试验代表一次样本试验。在样品试验期间，动物必须通过反复试验来了解平台的新位置。试验2（或任何连续试验）是测试或匹配试验，其中测量试验1和试验2之间的召回节省。试验2在试验间隔15秒后开始。如果动物回忆起样品试验，它将在第二次试验中游更短的距离到达目标。由于平台每天都在移动，因此前一天对平台位置的学习无法转移到第二天的问题上；因此，试验2中每天的回忆取决于当天的样本试验，只测量临时记忆或工作记忆。

表2

评估依赖于试验（工作）的空间学习和记忆的起始位置和目标位置的顺序。

收购日起点目标
1N个SE公司
2E类氖
三S公司软件
4W公司SE公司
5S公司氖
6N个西北
7W公司氖
8E类SE公司
9W公司西北
10S公司SE公司
11E类软件
12N个软件
13E类西北
14W公司氖
15N个SE公司
16S公司软件
17N个氖
18S公司西北
19E类西北
20W公司软件
21N个SE公司

每天进行两次测试，两次测试使用相同的起始位置和目标位置，如表所示。

歧视学习

MWM也可用于评估视觉辨别学习三。在此过程中，使用了两个彼此不同的可见平台，例如一个为白色，另一个为黑色。一个是标准的固定平台，它被提升到水面上，另一个平台从系绳上漂浮。本课程的任务是学习哪个平台可以用来逃离水面，哪个平台不能。动物在连续试验中选择的准确性是其区分“真”目标与“假”目标刺激信息能力的指标。

潜在学习

在潜意识学习中，这个想法是在每次实验之前而不是之后将动物放在平台上。这将使我们能够确定导航到平台与定位到目标相比，有多少空间学习来源于导航到平台。莫里斯在别处描述过这个过程三。

提示学习

MWM中经常使用的控制条件是测试动物学习游泳的能力，以达到提示目标。在这个过程中，迷宫周围的窗帘被关闭，以减少远端线索的可用性。窗帘会妨碍动物接触可用于空间导航的远端线索。平台与隐藏平台版本中的平台相同，不同之处在于它要么高出水面19或保持在水下，但安装了一个“旗帜”，该旗帜延伸至水面以上约12 cm（参考。33). 虽然这两种方法都有效，但我们发现带旗帜的版本似乎更有效，因为从泳池的另一边可以很容易地辨认出它，而突出的平台可能无法辨认。这种“提示”旨在让动物能够直接看到平台的位置。为了确保动物使用这个近端线索来定位平台，在每次试验中，目标和起点的位置都会移动到新的位置(表3). 这样，受试者就不能使用远端线索来解决问题。唯一可靠地指示平台相对于起点的位置的提示是附着在平台上的提示。莫里斯在最初的测试描述中引入了这一控制程序1不幸的是，这个过程经常被忽略，但它的价值是明确无误的。如果受试者在线索学习中受损，则可能会严重关注是否存在空间缺陷。这是因为线索学习需要与空间任务相同的基本能力（完整的视力、运动能力（游泳）、基本策略（学习从墙上游泳、学习爬上平台）和动机（逃离水面）。因此，如果受试者不能执行线索任务，那么人们就会怀疑其在空间版本中使用远端线索的学习能力。这项任务可以在空间版本之前或之后进行，但之前进行有优势，尤其是对小鼠来说。一些动物找到了平台，但随后跳回水中继续搜索。想必，这反映了人们努力寻找另一条逃生路线。在最初的几次试验中，一些动物在水中被充分激活，当它们第一次找到平台时，并不总是清楚它们认识到平台是一种逃避。因此，首先在线索实验中测试动物，可以消除动物在接受空间形式的任务之前没有获得适当附属技能的问题。

表3

线索学习试验模式。

测试日期试验1试验2试验3试验4
1N–东南E–东北S–软件W–SE公司
2S–东北北-西北W–东北E–SE公司
三W–西北S–SE公司E–软件N–西南
4E–NE公司W–东北N–西南S–软件
5N–东北南-西北东-西北W–软件
6S–东北W–SW（带开关）E–软件N–东北

第一个字母表示起始位置，第二个字母表示目标位置。

控制程序

线索学习基本上是一种控制程序，但它不是唯一可用的程序。例如，Cain34–36已经表明，一些药物会干扰感觉运动功能，这可能会干扰动物识别平台是目标的能力。他提出了几种确定是否存在感觉运动干扰的方法。他建议测量趋化性，或者测量坦克外周长周围紧贴或跟随墙壁的趋势，作为反映动物没有解决问题能力的一个指标。过度的触觉刺激（尤其是在大鼠身上）表明动物没有适当地集中精力完成任务，因为动物首先要学会的一件事是，水箱周围没有逃生通道。学会了这一点后，大多数动物都会从墙上游走，然后通过编织或循环搜索模式，最终找到平台。不学习这种基本方法表明动物可能对周围环境没有足够的意识。感觉运动干扰受损的其他衡量标准是过度跳跃、游泳和/或偏转。到达平台但不爬上或不停留在平台上的老鼠，无法在平台和逃跑之间获得必要的联系。在早期试验中，甚至在对照动物身上也可以看到其中一些行为，但这些行为通常会在一天内消失。然而，如果这种行为在实验组中更为频繁，那么就应该对空间学习是否能得到满意的评估提出问题。

凯恩建议，解决感觉运动干扰问题的一种方法是比较两组实验动物：一组在标准程序中测试，另一组使用“非空间”训练程序进行预训练。预训练组将接受一系列隐藏平台测试，其中每个测试的开始和目标都会随机移动，就像线索学习一样，但这里的帷幕是敞开的，平台是隐藏的。由于随机的开始-目标组合，该任务无法使用空间导航解决，但它教会了受试者基本的任务要求，即只能通过搜索找到逃生路线，目标位于远离墙壁的某处，平台是目标。凯恩34–39、莫里斯15和威士忌40已经证明，“非空间”预训练可以将非空间学习成分与空间学习成分分开，而这反过来又会改变对研究结果的解释。由于非空间或策略性的预训练和线索训练都能教会动物基本的任务要求，并且往往会消除诸如游泳、跳水甚至跳水等行为，因此首先进行线索试验可能会有所帮助。除非数据显示触觉倾向或平台识别行为表明存在感觉运动问题，否则通常不需要进行策略预训练。然而，急性药理研究可能需要非空间预训练，以确保非认知效应不会干扰迷宫性能，而延迟或长期药物效应研究可能不需要这种额外的程序。

另一种确定动物是否存在潜在感觉运动缺陷的方法是评估游泳速度。这通常是在学习测试期间在迷宫中完成的41或者，可以在单独的装置中预先测试动物，例如长而直的游泳道。我们使用一条15×244厘米的充水通道，在一端配有逃生梯或平台33，尽管也使用了较短的通道31。此任务几乎不需要搜索，因此几乎不需要学习。前一两次试验是为了让它们适应游泳，老鼠很快就认识到，只要从一端游到另一端，就可以找到逃跑的方法。在随后的试验中（共有四只是典型的），老鼠会尽可能快地游泳，以从一开始就达到目标。这提供了一种基本游泳能力和逃离水的动机的测量方法，并可用于在MWM试验之前确定动物在运动和动机上是否在各组之间相等。分析这些试验的平均值或使用最快试验可以确保MWM试验能够正确解释。

MWM总结

空间映射与工作记忆假设，以及使用MWM支持每种假设的数据已在其他地方详细审查5,42有许多测试用于评估这些功能，MWM只是其中之一。然而，MWM已经成为一种重要的，甚至占主导地位的方法。与所有方法一样，MWM也有优点和缺点；然而，它的大多数感知弱点都是由于使用了太小的迷宫、没有充分评估学习的协议、没有在训练和探索试验之间提供适当的时间间隔来评估参考记忆，或者缺乏评估非空间因素的控制程序。尽管如此，自25年前推出以来，MWM的使用范围比其前辈（辐射臂迷宫、被动回避、T迷宫及其变体）更广。这种利用率的提高是因为与任何其他学习任务相比，治疗后对MWM性能的影响被更广泛地复制，并且MWM的建立相对简单。毫无疑问，MWM大大提高了我们对NMDA受体、突触可塑性和学习之间关系的理解43，并且它继续被用于评估其他类型学习的新应用中。随着任务的使用不断增加，方法学的变化也越来越多，其中一些已经扩展了其效用。这里描述的协议提供了指导，可以帮助用户避免最常见的陷阱。

MWM主要是测试空间学习和参考记忆，这仍然是其主要优势。详细的分析表明，老鼠可以使用一组最小的线索来完成任务，这些线索包括角度分离和与坦克壁的距离29这些数据表明，如果配置和使用得当，加上适当的控制程序，MWM是评估空间制图的强大技术。对基本协议进行适当修改，使其成为一种灵活的工具，可用于更深入地探索空间学习或评估其他形式的学习和记忆。

材料

动物

  • 大鼠：白化病菌株（如Sprague-Dawley、Wistar、Fischer 344和Lewis）学习良好，尽管眼睛色素沉着减少，色素菌株（如Long-Evans和Listar）也一样。
  • 小鼠：许多实验室报告称，C57BL小鼠在MWM测试中表现最佳44,45; 然而，已经使用了许多其他菌株和杂交种（参见遗传背景）。

如上所述，可以使用大鼠或小鼠。

! 注意安全实验人员必须遵守国家有关动物及其使用的规定。

设备设置

迷宫

莫里斯最初的迷宫直径为130厘米1但他后来引进了一个直径为214厘米的更大迷宫2之后，他提到了一个直径200厘米的迷宫5（另见参考。46). 在这里，我们将描述两种仪器：一种用于老鼠，另一种用于小鼠。两者都是不锈钢圆形储罐。大鼠的直径为210厘米，小鼠的直径为122厘米。两侧都有51厘米高的非反射内表面。对于白化大鼠，大迷宫的内部被涂成黑色，而对于C57BL小鼠，小迷宫的内部则被涂成白色。由于表面面积随半径的平方增加而增加，较大的坦克由于搜索区域与目标的比率大大扩大，因此空间问题更加困难。迷宫通常安装在地板上方，并配有排水管和阀门，以便于清洁。

! 注意安全商用游泳池和水槽通常用作MWM水箱，但应谨慎使用，因为它们通常具有显著的焊缝、波纹表面或其他提供近距离线索的特征，即水箱内的标记。这些线索破坏了任务的目标，因为目的是测试动物使用远端线索导航的能力。有一个专业建造的油箱，注意不显眼的接缝和统一的内部是值得投资的。光滑的内墙还可以减少动物在早期试验中攀爬墙壁的尝试。

平台

目标（平台或目标）可以是方形或圆形，通常为10或11厘米2直径为10–12厘米，通常淹没在水面以下1–2厘米处，但对于小鼠来说，这一深度通常减少到0.5–1厘米。我们发现在某些学习阶段使用较小的平台以增加任务难度是有益的。任务难度是搜索区域与目标大小之比的函数。例如，一个210厘米直径的水箱和一个10厘米2我们使用的平台搜索区域：目标比率为346:1，而直径为122厘米的坦克和10厘米的坦克2平台的比率为117:1。这些比率分别适用于大鼠和小鼠。平台尺寸减小至5 cm2在大罐中将此比率增加到1385:1，在小罐中增加到468:1。我们之前使用346:1（10厘米）的比例对测试动物的潜伏期进行了比较2平台）或1385:1（5厘米2平台）。我们发现，尽管用10厘米训练的动物2平台在大约20次试验中学习到了渐近性能，使用5cm需要更长的时间2平台和性能从未达到10厘米时的水平2平台训练组47因此，从一个小平台开始会使任务变得太困难。在动物学会使用大型平台完成基本任务后，最好将较小的平台保留给测试的后期阶段。关于储罐直径对目标尺寸的影响的研究有限，但该比率显然是一个重要变量48。

平台通常由丙烯酸或PVC制成。有几种类型，最常见的是使用丙烯酸销钉或PVC管作为立柱，平台安装在顶部（通常带有小孔或其他纹理表面以提供牵引力）。底座通常是一块较大的压克力片，放在游泳池底部，其大小足以提供稳定性，以便动物爬上去时不会倾斜，当动物撞到它时，它会抵抗运动。另一种方法是使用一个浸没在水中的压克力片，上面有孔，平台销钉可以插入其中。这样可以防止平台的错误定位，并更容易在测试的不同阶段将平台精确地重新定位到其他位置。也有可以升降的平台（例如，亚特兰蒂斯随需应变平台或其他方式31). 大多数丙烯酸塑料的比重小于1.0，因此这些材料通常需要增加重量。选择高密度丙烯酸树脂可以避免这个问题。

水

一个常见的问题是水温。最初有人建议，大鼠需要比大多数实验室（19-22°C）的典型环境空气温度更高的水，但这一点尚未得到广泛证实。在19–22°C的环境温度下平衡的水中测试的大鼠表现良好，在典型测试年龄段没有明显疲劳或体温过低的迹象49然而，小鼠的情况可能不同（见下文）。

房间配置

迷宫应放置在周围有足够视觉线索的房间内。这些远端提示可以是有意的，也可以是房间内生的；然而，重要的是在测试过程中不要移动提示，因为这些是动物定位目标的导航参考点，与起始位置无关。线索与迷宫外墙的距离也很重要（参见参考文献。29). 因为一些实验室相对贫瘠，当有疑问时，谨慎地添加线索；没有证据表明线索太多是一个问题，但可能太少。在迷宫周围挂上窗帘很有用。如果需要测试线索旋转的效果，这些可用于定位有意线索，但使用帘幕的主要原因是在线索学习试验期间模糊远端线索（见上文）。

实验人员

MWM中的实验效果主要涉及动物操作和实验人员能见度的影响。处理问题与评估行为的任何实验相同，此处不再讨论。实验者的位置可以通过几种方式处理：实验者可以：（a）在测试期间离开房间；（b） 站在视觉障碍物后面；或（c）在固定位置保持静止。后者是最常见的，但不应忘记，实验者随后会成为远端线索之一。在不同象限进行测试的动物，特别是在迷宫的远端和近端，有时会显示不同的潜伏期，这取决于它们是朝着实验者游还是远离实验者50。这种效果并不会使测试无效，但应该意识到这一点，结果不应该因为让实验者在等待动物执行任务时四处走动而受到干扰。

照明

房间照明应为间接照明，尤其是使用摄像机、计算机和跟踪软件记录表演时。跟踪软件对水面的光反射很敏感，通过间接照明可以将其最小化。

跟踪系统

有许多商业供应商提供可用于MWM的跟踪系统。一个不完整的列表包括HVS Image、San Diego Instruments、Accuscan、View Point、Clever Systems、Noldus、Columbus Instruments、Watermaze Software、Coulbourn Instrument斯等。与任何软件系统一样，应在选择之前进行现场测试。

程序

空间采集

  • 1|将动物放在迷宫中所需的起始位置，面向水箱壁。动物被释放到水面上（未跌落）。动物一被释放，计时器或计算机跟踪程序就会启动。
  • 2|当动物到达（接触）平台时，停止计时器（大多数动物会立即爬上平台，但也有例外36). 标准的每次试验限制为1或2分钟；一般情况下，大鼠2min，小鼠1min。在此时限内未找到平台的动物要么被放在平台上，要么被引导到平台上。
  • 3|在试验间隔（ITI）期间，将动物放在平台上。曾经使用过30或60秒的试验间隔，但15秒已变得司空见惯，并产生良好的学习效果。然而，小鼠通常使用较长的ITI，尤其是在第一次测试期间，这可以提高学习能力25这可能是因为小鼠更容易受到低温诱导的性能影响51。将动物留在平台上的目的是让它定向到其在空间中的位置，并记住目标相对于周围线索的位置。然而，这可能不是必需的，因为动物在导航到平台时可能会学到他们需要的东西52后一项研究表明，当老鼠留在平台上时，如果ITI期间灯亮着或关着，它们也能很好地学习任务。
  • 4|将动物放在迷宫中一个新的开始位置，重复试验（步骤1-3），直到动物完成当天所需的试验次数。动物通常每天进行多次试验。最常见的数字是4。由于有四个主要的起始位置，这使得每天的起始位置保持平衡。每天进行四次试验，第一天每只动物需要5-10分钟，之后每天每只动物的时间逐渐减少。已使用的其他试验编号为1（参考。23)，2（参考。53)，3（参考。54)，5（参考。55)，6（参考。27,56,57)，8（参考。52,58)，10（参考。59)和12（参考文献。60,61)每天进行试验。这些试验数据中的任何一个都没有在大鼠身上得到令人信服的证明。另一种方法是让动物在平台上停留15秒，然后将其移到笼子中，在试验1中测试第二只动物，并重复此旋转，直到所有动物完成试验1，然后重复此过程以进行后续试验。后一种方法提高了小鼠的学习能力51，但没有大鼠的可比数据。很少有证据表明，随着每日试验次数的增加，敏感性存在较大差异，但有什么证据表明，每天试验次数越少，学习效果越好50然而，这一问题尚未得到充分探讨，无法提出明确的建议，试验数量的测试通常涉及较小的坦克，可能无法推广到较大的迷宫。
  • 5|在接下来的几天里，重复试验。重复测试的天数取决于学习曲线。每天进行四次试验，5-6天（20-24次试验）对于大鼠来说，在210厘米的迷宫中或对于小鼠来说，在122厘米的迷宫里，通常足以达到渐进性能；然而，如前所述，如果任务变得更加困难，那么动物可能需要更多天的测试才能达到渐进性能。相比之下，122厘米迷宫中的大鼠在第2天或第3天可能会接近渐近性能（参考文献。41).

参考存储器：探针试验

  • 6|拆下平台。
  • 7|将动物放在迷宫中一个新的开始位置，面对水箱壁-例如，与原始平台位置成180°。在探测试验期间，我们使用了一个新的起始位置，以确保其空间偏好反映了目标位置的记忆，而不是特定的游泳路径（参见表1).
  • 8|在固定的时间间隔（通常为30或60秒）后将动物移走。有证据表明，象限偏好在前30秒后降低（参考文献。41)，因此建议30秒。探针试验的目的是确定动物是否记得平台的位置。这种记忆的指标包括平台侧交叉点的数量、与其他象限相比在目标象限中花费的时间和距离、目标周围大于目标本身的预定义环形空间中的时间、到目标位置的平均距离、到目标地点的角度（方位）、，第一次目标位置交叉的延迟，以及平均搜索差异和平均区域差异得分（参见参考文献。62有关后一措施的描述）。目标象限中的时间百分比或距离百分比使用得最频繁。

    ▲ 关键步骤不应在最后一次学习试验后不久进行旨在评估参考记忆的探索试验，因为这是衡量近期回忆而非长期回忆。如果立即进行探测试验，则不应替代至少24小时后进行的试验。

空间反转

  • 9个|如果需要进行空间反转测试，请将平台重新定位到另一个象限（通常是相反的象限），并在5天内每天进行另一组四次测试（如步骤1-4所述）。
  • 10|在反转阶段结束时，按照步骤6–8所述进行反转探针试验。

● 计时

每次试验在大鼠中限制为2分钟，在小鼠中限制为1分钟，ITI为15秒，每天四次试验。因此，完成一次学习不需要超过9分钟。随着动物的学习，每天的时间逐渐减少。最后一天的探索试验只有30秒。对于任何测试阶段，6天都是常见的：5个学习日和1个探索日。第一阶段通常是提示，然后是采集、反转、双反转、工作记忆（与样本匹配）或其他程序。

? 故障排除

最常见的问题是使用不正确的储罐与平台尺寸组合。许多坦克太小，或者处于评估空间学习的最佳任务的下限。较小的水箱可以让动物使用其他策略（例如从墙上游固定距离）来完成任务，同时尽量少使用远端线索。不幸的是，如果水箱太小，动物会学习，而实验者不会意识到动物正在使用非远端线索来寻找平台，不会出现任何问题。因此，从一开始就选择合适的水箱尺寸是获得有效空间学习的最佳方法。

使用未经治疗的成年雄性Long–Evans大鼠，可以在图3小水箱直径为122厘米，大水箱直径为210厘米。两组的水温相同，平台尺寸（10 cm2). 两组在同一个房间的同一天，以相同的顺序和相同的目标位置接受相同数量的试验（每天四次）。水箱的构造和油漆都是一样的，唯一的区别是直径。对于小型坦克试验，较小的周长被放置在较大的周长内。可以看出，小型坦克小组很好地完成了任务；事实上，他们学得很快，几乎没有学习曲线。基本上，小型坦克组在第二天达到了渐近性能。相比之下，大型坦克组在第4天之前的学习表现出稳定的改善，并在第5天达到了渐近性能。很明显，哪种曲线更适合评估学习；因此，不建议大鼠使用122厘米的水箱。

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未经治疗的成年Long–Evans大鼠的Morris水迷宫获取表现。每天给大鼠进行四次试验，数据表示四次试验区块的平均值±标准偏差。数据是使用相同的起始位置序列达到目标的延迟。小水箱直径为122厘米，大水箱直径为210厘米。两组的所有测试条件和试验均相同。小坦克周边被放置在大坦克内，以便所有线索都是相同的。n个=每组10只（雄性）。

另一方面，122厘米的水箱是老鼠最常用的尺寸。转基因、敲除和敲入小鼠在MWM中进行空间学习的常规评估。有充分的数据表明，在小鼠身上，使用直径122厘米的水箱可以获得良好的学习曲线。这可能是因为这个尺寸的水箱比老鼠的体型更大，或者是因为老鼠发现空间任务比老鼠更困难，因此，较小的搜索区域是有益的。

在MWM测试期间，不同鼠种的表现差异很大。一种表现良好的菌株是C57BL（参考。57). 不管是哪家供应商，C57BL小鼠都是相当优秀的游泳运动员，在放入水中时会有适当的游泳搜索反应。一些应变漂浮或旋转，无法使用。

遗传背景

在大鼠身上，斯普拉格-道利（Sprague-Dawley）、维斯塔（Wistar）、龙-埃文斯（Long-Evans）、菲舍尔344（Fischer 344）、ACI（ACI）、达克·阿古蒂（Dark Agouti）和刘易斯（Lewis）在MWM中进行测试时都显示出。

在小鼠中，C57BL在MWM中学习的结果是一致的，但实验室对其他菌株的报告有所不同。例如，经常进行基因靶向的129S菌株，其浮动和不稳定表现的发生率增加，但这可能是子串的功能，因为据报道129S2/SvlmJ小鼠在MWM中表现令人满意45据报道，BALB小鼠表现良好45在MWM中，其他人表现不佳44。

一项因子分析旨在定位多个小鼠品系和大量小鼠（~1500只）MWM学习的集群决定因素，该分析表明，三个因素占MWM表现的大部分差异63,64小鼠体内最大的因子（48%）被称为趋化性因子，表示游泳或漂浮在池壁附近的倾向；第二大因素被称为被动性（20%），代表缓慢或不抽血；第三个因素是记忆或目标导向行为（13%）。这种分析的结果是所测量因素的函数，因此不同的测量将产生不同的因素分析。然而，该分析包括了MWM表现的许多重要变量，表明表现的大部分差异是由于与小鼠学习和记忆无关的因素造成的，因此在小鼠研究中，使用适当的控制对正确解释结果尤为重要。

非执行者

在大鼠中很少见到非表现型，但在小鼠中也能见到。在C57BL小鼠中，与大多数其他菌株相比，MWM中的非表现型不太常见。然而，一些基因修饰可能会导致突变动物无法完成这项任务。这些情况相对明显。然而，由于混合遗传背景或研究中的基因操作，有一部分小鼠不寻找目标，这种情况会有一定的发生频率。在这种情况下，问题变成了如何处理这种情况。最常见的问题是，一些老鼠漂浮在水面上，似乎没有动机逃跑。已经尝试了不同的方法来诱导无表现者游泳，但这些方法通常涉及实验者的干预，例如用巨大的噪音惊吓老鼠，用物体戳它，或预先弄湿毛发以降低浮力。老鼠之所以有浮力，是因为它们的皮毛含有防水油，可以一次漂浮几分钟。在20–22°C的水中测试小鼠通常会降低漂浮的频率。尽管如此，在允许实验者干预时应该谨慎。问题是，干预措施难以统一实施，可能会无意中引入偏见。如果实验组的浮动频率较高或较低，或者治疗与惊吓或其他因素相互作用，结果可能会令人困惑。更好的方法是使用不涉及干预的标准规则。我们的方法是，如果一只老鼠漂浮在水面上，它可以在试验的极限内停留在水中。如果这只动物游不动，就把它移走，然后测试下一只动物。当训练中的其他动物完成后，浮子将进行第二次试验。如果它游泳，它将收到完整的试验序列，第一次试验将从数据中排除。如果它在第二次试验中漂浮，它将返回笼子并在第二天再次进行试验。如果它现在游泳，它就会继续进行测试，落后于它的同伴一天。如果它不能游泳，它将从测试顺序中去掉，就像第一天一样，直到测试其他动物，然后进行最后一次测试。如果它在第四次尝试中游泳失败，它将被从实验中移除。在实验结束时，对每组浮子的频率进行统计比较，以确定实验操作与野生型相比是否显著改变了非表现者的频率。如果确实如此，那么必须根据选择偏差的可能性，谨慎解释游泳运动员的MWM数据。

预期结果

学习试验

MWM中学习测试的相关性能度量从延迟开始（从开始到目标的时间）。可以使用或不使用跟踪软件获得延迟。路径长度也被广泛使用，并且具有对游泳速度免疫的优点。虽然路径长度的测定是在不使用跟踪程序的情况下进行的，但这些方法需要耗费大量的劳动力，并且使用跟踪程序更容易捕获此类数据。另一个有用的指标是与平台的累积距离；大多数跟踪程序都会生成这种测量值，即每秒或几毫秒测量一次与平台的距离。累积距离被认为是衡量空间学习能力的较好指标之一54.第一个方向性和/或平均方向性相似但不相同，测量动物在试验开始时相对于从开始到目标的直线的游泳角度。角度测量似乎对许多类型的实验处理都很敏感。根据我们的经验，潜伏期、路径长度和累积距离高度相关，而第一个方位与前三个测量值的相关性较低(表4). 这是合乎逻辑的，因为前三项指标都反映了整个试验期间表现的各个方面，而第一次分娩是试验期间（开始时）动物在某一特定点的表现。其他措施是目标环空中的时间或距离（两个同心圆之间的空间，由分别接触平台内外边缘的线定义，不要与Morris使用的术语“环交叉”混淆，Morris指的是平台周围区域的交叉点）与内环或外环相比（后者是指趋近度），直接游泳次数（从起点到目标的预设走廊内的路径数）或圆周游泳次数（近似于从起点到隐藏平台的圆周半径逐渐减小的弧线，且圆周小于360°的游泳轨迹），跳跃、偏转、游泳等。这些其他措施可能很重要，尤其是在测试最近服用过干扰感觉运动功能的药物的动物时36,37。

表4

莫里斯水迷宫中四个计算机跟踪采集性能指标的相关系数矩阵。

变量延迟路径长度累计距离第一个轴承
延迟10.9510.9300.409
路径长度10.9710.418
累计距离10.568
第一个轴承1

该结果来自于对四个治疗组的大鼠进行的实验，其中一个治疗组在Morris迷宫测试期间学习和记忆明显受损（参考文献。33).

一个变量占另一个变量的方差百分比是每个变量的平方第页-价值(R（右）2); 因此，路径长度和累积距离等变量之间的方差很高(R（右）2=0.943），但在其他变量（如第一个方向角）之间较低，R（右）2= 0.323).

探针试验

作为记忆指标的站点交叉有一个局限性，即它是可变的，并且通常发生的频率很低，特别是当目标尺寸减小或储罐直径较大时。此外，根据跟踪软件的不同，可能会发生交叉计算不足的情况。我们发现，到目标地点的平均距离、目标象限中的时间或距离以及第一个方位角提供了比准确穿越地点更可靠的记忆测量。其他人则报告了目标环空交叉点的成功，其中环空是一个环绕且大于平台本身的圆形区域。

数据分析

采集试验通常以四个区块为单位进行平均，并绘制为区块平均值（±s.e.m.），或者，如果使用的试验数量较多，则每天可能绘制两个或多个区块的试验。然而，实验者也应该通过试验来检查数据，以确保在每天的测试中都有学习。除非发现异常模式，否则绘制每日四个试块中的数据通常可以准确地表示学习过程。当绘制每日试验图时，通常在第1天的试验1和试验2期间出现长潜伏期，在试验3和试验4期间有所改善。第二天，性能将从第1次测试比前一天的第4次测试长开始，然后性能将提高到超过第1天的第四次测试的性能。这种锯切模式在测试的每一天都会重复，在几天内表现为整体缩短或向下阶梯模式。通过试验块绘制数据可以平滑学习曲线，这条线是最广泛使用的空间学习指数，尽管也使用了其他指数（例如，参考文献。54).

数据汇总和分析

每个因变量的组平均值应按试验和试验块计算。应检查测试第1天的测试1和测试2，以确保各组不会以不同的性能水平开始测试。应使用高检测能力的测试来比较前一个或两个试验的数据，例如吨-如果有两个以上的组，则进行方差分析（ANOVA）。如果各组在早期试验中存在显著差异，则这是一个警告，即各组在进行试验时存在先前存在的差异，可能会妨碍或损害对空间学习和参考记忆方面的学习曲线或记忆保留试验的解释。如果各组具有可比性，则通常在试验块中绘制和分析数据，以稳定平均值。数据通常通过方差分析进行分析。这些因素通常是基因型或治疗组和测试日。一些实验将包括其他因素，如性别。在ANOVA模型中，组通常是一个“中间”主题因素和一个“内”主题因素，尽管在使用分列设计的发展研究中，组、日和性别的因素可能都是内/匹配因素。使用SAS等统计程序，可以使用Proc-GLM（一般线性模型）或Proc-Mixed分析MWM数据。GLM分块模型可以容纳一个或多个“介于”和一个或更多“内部”因子；然而，在对重复测量（“内部”）变量使用GLM模型时必须谨慎。如果只有两个级别的“内部”因素，GLM ANOVA解决方案是精确的，但在MWM中通常需要两天以上的测试。在重复测量因子超过两个水平的情况下，“内部”和“之间”的重要性x个“因子内”F-比率可能会失真。这是因为GLM要求数据满足复合对称假设，即重复因子的方差-方差矩阵内的相关性，例如天，在测量之间的所有距离上都完全相同。例如，第1天与第2天之间的相关性必须与第1天和第3天或第2天与第3天之间的相关相同。学习数据几乎永远不会满足这一假设，因为随着学习的进行，方差会随着时间的推移而变化。随着动物学习这项任务，它们的表现变得不那么多变，因此日内的差异会减少，相关性也会改变。对于复合对称性没有精确的测试，但对于球度有更严格的测试。如果使用GLM，建议使用球度协方差矩阵测试。如果数据明显非球形，则可以使用调整后的F比率来至少部分纠正F检验，以便显著性水平不太可能被高估。调节F比率的两种最常见方法是温室盖瑟法和惠恩费尔德法。

另一种方法是使用过程混合方差分析模型（SAS）。Proc Mixed ANOVA模型提供了一种更精确的方法来处理协方差矩阵的非对称性问题，但Proc Mixid有限，因为它不能处理模型中的两个以上“内部”维度。然而，Proc Mixed有一些显著的优点，值得一试。Proc Mixed提供了一组不同的协方差模型，这些模型可以拟合到数据中。这些不同的模型可以根据数据进行测试，并使用Proc Mixed提供的最佳统计数据进行比较。根据我们的经验，AR（1）（自回归（1））协方差模型通常最适合MWM学习变量，例如延迟、路径长度和累积距离。无论哪种协方差模型最适合数据，都可以选择最适合的模型，并对数据进行分析，以获得比Proc-GLM更精确的F检验。探针数据通常没有重复测量成分，因此不需要过程混合。过程混合还提供了一个“切片”方差分析选项，这样，如果在组因素和日因素之间获得交互作用，切片方差分析将提供每天的组效应测试，以便确定哪些天显示组差异。由此得出，个体组比较(事后（post-hoc）试验）可在选定的日期在治疗组之间进行；显著的交互作用或群体主效应需要考虑控制多重比较的典型因素。在SAS中，Proc Multtest提供了针对I型错误提供不同级别保护的组比较测试。Bonferonni下台是我们常用的测试之一。

致谢

作者感谢美国国立卫生研究院拨款DA006733、DA021394、DA014269和ES007051的支持。

脚注

竞争利益声明作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

重印和权限信息可在线获取，网址为http://npg.nature.com/reprintsandpermissions

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