自然选择打开EPAS1系统(HIF2α)与藏族高原人血红蛋白浓度低有关

摘要

中亚高原和安第斯山脉是最后被占领的地区之一智人在过去的10万至20万年里，它遍布全球。就青藏高原而言，早在3万年前就有游客出现，而该高原已经被殖民了1万多年(1,2). 极端海拔导致的低分压氧气对这些殖民者来说是一个可怕的生物挑战。从低海拔人群（欧洲人和汉族）迁移到高海拔生活的人患有许多潜在的致命疾病，特别是与低氧水平有关的疾病(三–5)并努力在这些高度繁殖(6–9). 因此，高原低氧（低压低氧）会产生巨大的进化选择压力。

与长期在高海拔地区居住相关的典型疾病是慢性高原病，或称蒙日病，这是在卡洛斯·蒙格·梅德拉诺（Carlos Monge-Medrano）首次在安第斯高原人中发现这种疾病之后发现的(10). 其主要特征是血液中的含氧色素、血红蛋白浓度极高，这是由红细胞过度生成（过度红细胞增多）引起的。藏族高原人对发展成慢性高原病特别有抵抗力(4,11)随着海拔的增加，血红蛋白浓度几乎没有增加，甚至在4000米（13200英尺(12,13). 通常，与安第斯同类相比，藏族人平均血红蛋白浓度至少低1 g/dL，约3.5 gm/dL（即约10–20%）(14–16)或者是适应环境的低地人，比如迁移到海拔2500米以上的汉族人(4,17–23). 这表明藏族人对高原缺氧产生了迟钝的红细胞生成反应。低氧诱导红细胞增多涉及低氧诱导因子（HIF）家族转录因子，尤其是EPAS1（或HIF2α）(24,25).

三项独立研究是由一些小组进行的，但结果相辅相成，这些小组后来组成了一个联盟，目的是报告研究结果。第一项研究是全基因组等位基因分化扫描，该扫描将居住在3200-3500米的云南藏族人群的SNP频率与HapMap III期汉族样本进行了比较。线粒体、Y染色体和常染色体DNA证据都表明现代藏人起源于北亚或东亚(1,26–28). 因此，汉族是一个低地人口，与藏族人关系密切，但尚未经历高原适应选择。从这项研究中，选择信号接近EPAS1系统在全基因组水平上进行了显著性鉴定。第二项研究包括候选基因分析EPAS1系统在来自青藏高原4200米的藏人的单独样本中，发现了基因型和血红蛋白浓度之间的显著相关性，主要等位基因与较低的血红蛋白水平有关。这些等位基因在汉族人群中出现频率较低。第三项研究在4300米藏族人的独立样本中复制了血红蛋白相关性。

结果

全基因组等位基因分化扫描。

采用全基因组等位基因分化扫描（GWADS）对一组藏族居民进行比较(n个=35）从中国云南省海拔3200-3500米的四个乡镇采样，HapMap III期汉族个体(n个= 84). 我们假设，云南藏族和HapMap汉族人群之间SNP频率的任何显著差异都可能反映出功能变异的不同选择历史，这有助于提高高原生存率。（请参见SI材料和方法详细方法。）在分析中包含的502722个SNP中，有8个SNP具有全基因组意义(P（P）值范围为2.81×10⁻⁷至1.49×10⁻⁹)，均位于2号染色体235 kb内(图1和表S1).

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图1。

一项全基因组等位基因分化扫描，将中国云南省3200-3500米的藏族居民与HapMap汉族样本进行比较。八个SNP相互靠近环境保护1具有全基因组意义。横轴是基因组位置，颜色表示染色体。纵轴是SNP-by-SNP的负对数P（P）云南藏族与HapMap汉族比较得出的值。红线表示使用的全基因组显著性阈值(P（P）= 5 × 10⁻⁷). 使用基因组控制校正背景人群分层后显示值。

在云南样本中，所有8个GWADS显著SNP均处于高配对不平衡状态（0.23<第页²<0.82），在云南藏族样本中形成一个扩展的单倍型，频率为46%，而在汉族样本中仅为2%[使用Haploview软件通过期望最大化算法进行估计(29,30)]. SNP位于环境保护1但是，如我们下面所示，高度联系不平衡的区域延伸到EPAS1系统自身。除了这一全基因组的重大发现外EPAS1系统，也发现了其他选择信号的证据。亚基因组范围重要的区域与HIF途径的其他基因非常接近，为后续研究提供了有趣的靶点（参见SI文本更多详细信息）。

候选基因研究环境保护1.

独立于GWADS研究的候选基因研究（基于连接缺氧、，EPAS1系统和促红细胞生成素）解决了EPAS1系统在中国西藏自治区日喀则州马巷4200米处居住的70名藏族人样本中，通过检测血红蛋白浓度与变异的关系(表S2). 跨EPAS1系统选择基因进行基因分型。其中49个小等位基因频率≥5%，因此可以进行回归分析(材料和方法)发现31个SNP位点与血红蛋白浓度显著相关(图2和表S3). 每个显著SNP的主要（最常见）等位基因与较低的血红蛋白浓度相关。调整性别差异后，主要等位基因纯合子个体的平均血红蛋白浓度为0.8±0.15 g/dL（范围为0.3至1.0 g/dL）低于主要等位基因杂合的个体。条件线性回归分析表明，一旦纳入最显著的SNP（rs4953354），通过添加任何其他SNP进行Bonferroni校正后，拟合度没有显著改善，这与单一因果变量模型一致。许多SNP位点处于高连锁不平衡状态(图2). 在Mag Xiang队列中的70名个体中，有29人获得了8个GWADS显著SNP的基因型，但数量太少，无法显示与血红蛋白浓度的统计关联。然而，所有8个GWADS SNP都高度相关（0.54<第页²≤1）在完整的Mag Xiang队列中与血红蛋白浓度相关的变异(表S4). 因此，全基因组和候选基因分析可以联系起来，后者的研究表明，存在与选择信号相关的表型。

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图2。

性别调整血红蛋白浓度和等位基因变异EPAS1系统中国西藏自治区马巷（4200米）藏族样本中的SNP。主要等位基因纯合子个体的平均值比杂合子个体低0.8 g/dL。(顶部)49个SNP的变异检测结果，次要等位基因频率≥5%，与性别调整血红蛋白浓度的基因型关联。(中部)每个SNP的主要等位基因纯合子和杂合子基因型之间的估计血红蛋白浓度差异（平均±95%置信区间）。实心圆圈表示检测到的SNP与血红蛋白浓度有显著关联，在整个EPAS1系统轨迹。开放钻石代表没有显著关联的SNPs。(底部)成对连锁不平衡被测量为第页²SNP之间。

候选基因研究的复制EPAS1系统.

我们复制了EPAS1系统中国日喀则扎西宗乡4300米处91名藏族人的另一样本中血红蛋白浓度的SNP(表S2). 在49个次要等位基因频率≥5%的Mag Xiang单核苷酸多态性位点中，有48个在扎溪宗乡样本中成功进行了基因分型。其中，45个位点的次要等位基因频率≥5%，32个位点与血红蛋白浓度显著相关。调整性别差异后，主要等位基因纯合子个体的平均血红蛋白浓度为1.0±与主要等位基因杂合的个体相比，低0.14 g/dL（范围为0.5至1.2 g/dL）(图3和表S3). 两个样本中的20个单核苷酸多态性与血红蛋白浓度相关，且作用方向相同。条件线性回归再次发现，在包括最显著的SNP（rs13419896）后，在Bonferroni校正后，没有进一步的SNP显著。如果使用Mag Xiang样本中最显著的SNP（rs4953354）而不是rs13419896，情况也是如此。在扎西宗乡队列中的89个样本中，可获得8个GWADS显著SNP的基因型。其中三个SNP与血红蛋白浓度显著相关(表S4)从而支持表型与从基因组这个区域获得的选择信号的关联。

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图3。

性别调整血红蛋白浓度和等位基因变异EPAS1系统中国西藏自治区扎西宗乡（4300米）藏族样本中的SNP。主要等位基因纯合子个体的平均值比杂合子个体低1.0 g/dL(顶部)在45个SNP中检测变异的结果，次要等位基因频率≥5%，与性别调整血红蛋白浓度的基因型关联。(中部)每个SNP的主要等位基因纯合子和杂合子基因型之间的估计血红蛋白浓度差异（平均±95%置信区间）。实心圆圈表示检测到的SNP与血红蛋白浓度有显著关联，在整个EPAS1系统轨迹。开放钻石代表SNP，没有显著关联。(底部)成对连锁不平衡被测量为第页²SNP之间。

比较两个藏族样本和HapMap汉族样本的等位基因频率，我们注意到最大等位基因的频率差异发生在EPAS1系统与低血红蛋白浓度相关的SNP位点(图4). 与HapMap汉族相比，这26个SNP位点之间的连锁不平衡（LD）在两个藏族队列中也升高(SI文本).

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图4。

内SNP等位基因频率的差异EPAS1系统在HapMap Han、Mag Xiang和Zhasizong Xiang队列之间。根据建筑36.1，水平轴为SNP位置。纵轴是等位基因频率，选择显示的等位基因是马向队列中最常见的一个。平方表示HapMap汉族的数据；圆圈表示马向藏人的数据；三角形表示扎西宗藏族的数据。填充符号表示在马香和扎西宗香队列中与血红蛋白有显著关联的SNP；开放符号表示没有这两种关联的SNP。

讨论

GWADS研究的结果显示，在环境保护1这远远超过全基因组平均水平(图1). 关联研究表明，藏族人群中频率较高的SNP变异体与较低的血红蛋白浓度相关。由于对其他低海拔人群血红蛋白浓度决定因素的大规模全基因组关联研究未能检测到与EPAS1系统(31–34)，我们的结果表明，要么有一个遗传变异对藏族人群非常特异，要么该变异仅在高海拔条件下对调节血红蛋白浓度非常特异。藏族高原人的这种效应特异性与选择压力模型一致EPAS1系统在高原低氧应激下。有趣的是，HapMap汉族和安第斯高地人之间的比较——他们都有强烈的红细胞生成反应(15)-未检测到选择EPAS1系统轨迹(35). 然而，应该指出，安第斯研究(35)考虑到特定技术检测的选择信号的不同性质，应用不同的方法阵列来检测选择和重叠结果不一定是预期的。鉴于已知安第斯和藏族群体之间存在的生理差异，他们对高原缺氧也可能有不同的遗传适应(13).

关联研究表明EPAS1系统在这些人群中血红蛋白浓度的变化中占很大比例。在控制性别后，主要等位基因纯合子和杂合子之间的血红蛋白浓度平均差异是马香样品中一个SD的53%，扎西宗香样品中的50%。就绝对值而言，这些差异比居住在低海拔地区的人群中血红蛋白浓度的任何决定因素都大几倍(31–34). 然而，我们的发现与之前对遗传力（h）的高估计一致²)4850–5450米藏族血红蛋白浓度为0.66(36)在3800–4065米的藏族人中为0.86(15). 这些值估计了加性遗传变异相对于总表型变异的比例。我们的关联和条件线性回归分析的综合结果与一个模型一致，在该模型中EPAS1系统基因座占遗传力的很大比例。在这个模型下，血红蛋白相关SNP应被解释为标记物，并被认为已经分化，因为它们与一个尚未确定的因果变异密切相关。需要进行功能研究，以确定这种变异是如何抑制造血反应的。

我们描述了自然选择的信号EPAS1系统这与减弱对缺氧的正常红细胞生成反应有关。作为EPAS1系统是多效性的，对缺氧的其他反应也可能受到类似的影响。对一些生活在低海拔地区的个人/家庭的研究可能会对这些问题提供一些见解，据报道，这些人在EPAS1系统(37–40). 正如预期的那样，这些患者表现出过度的红细胞增多，但他们也似乎特别容易发生血栓事件和发展为肺动脉高压，尽管报告的病例总数很少。据报道，Chuvash红细胞增多症的特异性稍低的遗传性疾病有更多的病例VHL（甚高频）导致HIF1α和EPAS1/HIF2α水平升高(41). Chuvash红细胞增多症的表型与特异性EPAS1系统功能获得性突变、红细胞增多、年轻时血栓事件风险过高和肺动脉高压(42–45). 在这两种情况下，过度红细胞增多通常通过静脉注射来控制，因为这可能会降低血栓事件的发生率。

这些遗传疾病的表型与慢性高原病之间的临床相似性是惊人的。事实上，这导致一组调查人员观察到EPAS1系统功能突变的获得“增加了多态性变异的可能性HIF2α[EPAS1系统]有助于高海拔地区人类对红细胞增多症、血浆容量减少和肺动脉高压的显著差异易感性”(39). 藏族慢性高原病的发病率低于藏族自治区汉族低地人（1.2%，5.6%）(4,46). 藏族人成年后慢性高原病的发病率一直处于较低水平，但在秘鲁，患病率随着年龄的增长而增加，从20岁至39岁的约13%增加到55岁至69岁的约36%，年龄为4300米(47). 在安第斯山脉，高海拔地区过度的红细胞增多与严重的肺动脉高压有关(48)，中风风险增加(49)以及妊娠不良结局的风险增加（死产、早产或小于出生胎龄）(50). 这些发现提供了对发病率和死亡率升高的一些来源的深入了解，在这些来源上，选择可能会影响EPAS1系统在青藏高原早期殖民者中。

虽然慢性高原病和EPAS1系统低地人的功能表型获得显著，然而，在低地可能还存在其他方面的表型，这些表型在低地无法显示，而只有在高海拔地区才能显示，此时氧气可用性也有限。特别地，EPAS1系统在胎盘和胚胎发育中起着非常重要的作用(51–54)也可能是胎儿生长受限的发病机制(55). 众所周知，在高海拔地区繁殖成功比在低海拔地区更困难，外来人口比本地人更难(6). 例如，汉族人出生前和出生后的死亡率是藏族人的三倍，出生体重也明显较低(56). 这可能在一定程度上与藏族人子宫动脉血流量增加和血红蛋白浓度降低有关(9,57). 因此，自然选择EPAS1系统可能还通过影响产前和产后死亡率的妊娠期效应进行手术。

总之，本研究为藏族高原人特定人类基因位点的自然选择提供了证据。在两个独立样本中的一项证明进一步支持了这一发现，即该位点的遗传变异具有相关的表型。与该基因位点相关的已知生理作用提供了对可能影响人类在青藏高原定居后适应和生存的一些因素的见解。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

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