穿透性小动脉的主动扩张恢复局灶性卒中后半影新皮质的红细胞流量

双光子显微镜

使用局部设计的双光子激光扫描显微镜收集图像(Tsai等人，2003年;Tsai等人，2002年)由MPScope软件控制(Nguyen等人，2006年). 用0.3 mL的2 MDa荧光素-dextran（FD2000S；Sigma）在盐水中制备，浓度为5%（w/v），并通过股动脉导管输送，根据需要添加0.1 mL补充剂，标记血清(Schaffer等人，2006年). 使用0.3倍数字孔径（NA）、10倍放大的浸水物镜（Zeiss）收集大规模地图，以帮助导航通过皮层血管系统，而使用0.8-NA、40倍放大的水洗物镜（Olympus）获得高分辨率线扫描和平面数据。以1.6 kHz/线的扫描速度，沿着每根血管的中心线，在70个像素的长度范围内收集线扫描，范围从7μm到76μm。使用基于奇异值分解的方法从线扫描条纹的斜率确定红细胞速度(Kleinfeld等人，1998年). 对于每艘船，我们报告了1.5 s周期内的平均速度。采集256×256像素的平面图像堆栈，以确定血管的直径。由于技术限制，我们的分析仅限于直径小于60μm的小动脉。另一个限制是，只有当血管的一部分在垂直潜水之前与皮质表面平行时，才能测量穿透小动脉。在一项对11只大鼠154条穿透小动脉的调查中，由于这种限制，17%的小动脉无法测量。

在分析表面小动脉的过程中，使用23μm的断点将血管分为小直径和大直径两类。这个数字对应于基线时穿透小动脉的标准直方图（n=215）和表面小动脉的直径（n=271）之间的交点，最大似然是划分数据的自然点。此外，23μm是测量的表面小动脉的中位直径。

通量量化

假设血管内的流动是层流的，从单个血管收集的红细胞速度和管腔直径可用于定义平均体积流量，$\stackrel{<trans\; data-src="⃗">⃗</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="F">如果</trans>}}$，签署人：

其中〈$\stackrel{<trans\; data-src="⃗">⃗</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="v">v（v）</trans>}}$〉是平均红细胞速度，A类是血管管腔的横截面积，$\stackrel{<trans\; data-src="⃗">⃗</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="v">v（v）</trans>}}$（0）是沿血管中心轴的红细胞速度，d是管腔直径。相反，恒定通量条件意味着直径Δd的变化，这是抵消速度变化所需的，即, Δ$\stackrel{<trans\; data-src="⃗">⃗</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="v">v（v）</trans>}}$（0），由给出

减少$\stackrel{<trans\; data-src="⃗">⃗</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="v">v（v）</trans>}}$(0),即, Δ$\stackrel{<trans\; data-src="⃗">⃗</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="v">v（v）</trans>}}$（0）<0，d增加，即，Δd>0。

血管铸型

荧光琼脂糖凝胶由0.42%（w/v）2 MDa荧光素葡聚糖和1%（w/v）低胶凝温度琼脂糖（A4018；Sigma）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中配制，在60°C下混合，并在使用前保持在该温度(蔡2004). 5%一氧化碳使脑血管扩张₂和95%O₂用2%异氟醚通过鼻锥15分钟，以促进凝胶的灌注。通过左心室经心灌注动物100 mL PBS、100 mL 4%多聚甲醛和50 mL PBS，以清除残留的固定剂。然后用注射器以每秒约2 mL的速度将50 mL凝胶稳定地注入心室。凝胶迅速凝固就地把动物放在冰浴中。大脑被小心地取出以避免对软脑膜血管造成损伤。在宽视野荧光显微镜（Axioplan 2；Zeiss）下，将缺血半球的皮层从两片相隔3 mm的玻璃片中取出并压平。小动脉网络，包括成像区域体内是通过使用0.5至10倍放大倍数的空气物镜（蔡司）拍摄的重叠图像进行追踪的。

匹莫达唑免疫组织化学

盐酸哌咪唑（Hypoxyprobe™；Hypoxyprobe.com网站)是一种敏感的方法，用于检测即使是小体积的组织缺氧，即，<10 mm Hg组织氧，而在常压条件下约为30 mm Hg(Nishimura等人，2006年;Takasawa等人，2008年). 通过股动脉导管以每公斤体重60毫克的浓度注射匹莫达唑。对于免疫染色，用3%（v/v）H处理50μm冷冻切片10分钟₂O（运行）₂，并在稀释10的抗Hypoxyprobe™抗体中培养72小时^三-在含有10%（v/v）正常山羊血清（Vector Laboratories）、2%（v/v）triton X-100（Sigma）和0.2%（v/v/）叠氮化钠（Sigma-）的PBS中培养2次。用Vectastain ABC试剂盒和二氨基苯扎定过氧化物酶底物试剂盒（均来自Vector Laboratories）观察结合抗体，并用MacroView显微镜（MVX10；Zeiss）拍摄脑切片。通过首先确定缺血（同侧）和非缺血（对侧）皮质染色的标准化强度直方图，对来自Bregma-3.0 mm前后侧的脑切片中的匹莫达唑染色进行量化。然后使用一个阈值（设置为包括非缺血侧最大90%的像素值）来分离缺血侧的染色区域，以占总皮层面积的百分比表示。

激光多普勒流量计

使用MoorLab装置（Moor仪器；λ_o个=780 nm和f_切=15 kHz低通滤波，以提供λ的最大可测量速度_o个（f）_切/2=6 mm/s），配备MP1-V2探头头，通过定制适配器固定在颅骨窗口或变薄的颅骨上。LDF“通量”输出是平均红细胞速度乘以反射信号强度的测量值，使用WinEDR软件以40 Hz的采样率采集(http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm)，平均间隔60秒。

tMCAo对皮亚小动脉血管动力学的反应

我们使用椎管内纤维模型暂时阻断MCA起源90分钟，然后再灌注90分钟(小泉等人，1986年). 我们首先考虑在软脑膜网络内中风引起的红细胞流向变化，然后定量测量红细胞速度和管腔直径。然后，我们结合这些参数来评估红细胞流量。在整个成像过程中，包括血气、血压和核心温度在内的生理参数都在正常范围内(补充表1). 所有测量血管动力学参数的非标准化值见补充图1.

MCA闭塞导致表面小动脉中红细胞流动逆转，但不穿透小动脉

在闭塞期间，12%的表面微动脉中观察到红细胞的流动方向逆转或运动停滞。这些变化通常发生在三种网络模式中：(我)小的表面小动脉环，直径～500μm²皮质表面积的百分比（占总表面小动脉的7%）(图2A); (ii（ii）)MCA和大脑前动脉（ACA）灌注源之间的直接小动脉连接（3%）(图2B)(Schaffer等人，2006年); 和(三)平衡MCA主要分支之间血流的“连接血管”（2%）(图2C). 我们使用荧光血管铸型的尸检分析来进一步评估成像区域以外血管的连通性(图1A). 一般来说，72%的检查表面小动脉位于ACA的环内或直接连接到ACA的侧支。再灌注几乎解决了表面网络中的所有逆转和停滞。与表面小动脉的情况相反，在闭塞期间，穿透小动脉中的血流既没有逆转也没有停滞，而是对整体血流减少作出了均匀反应。作为一个指导性假设，这表明，在闭塞期间，表面网络中的流动不规则性可维持穿透小动脉的不间断流动。

在单独的窗口中打开

图2

tMCAo期间表面微动脉网络中红细胞流型的改变

箭头表示微动脉网络中的血流方向。由MCA遮挡引起的反向流动（红色箭头）和暂停（红色虚线）将高亮显示。（A）小动脉环内流动逆转的典型例子。（B）在ACA和MCA区域之间形成吻合的大小动脉中的流动逆转。（C）连接两个主要MCA分支之间灌注的小动脉中的血流停滞。

tMCAo期间红细胞速度和管腔直径的变化

tMCAo的“小泉”方法包括永久结扎同侧CCA，如LDF检测到的，这会导致再灌注期间血流不完全恢复(图3A) (小泉等人，1986年). 我们利用模型的这一特征来确定小动脉反应性是否保持完整，是否能够补偿不完全再灌注。

在单独的窗口中打开

图3

tMCAo期间红细胞速度和管腔直径的变化

（A）tMCAo“Koizumi”模型中头窗LDF信号的相对变化(小泉等人，1986年). LDF数据表示n=8只动物的平均值±SEM。从迹线中省略了灯丝插入期间约10 min的时间。（B）由小表面小动脉和穿透小动脉组成的网络中强健的中风诱导的血管扩张。这些图像是100μm深度图像堆栈的最大投影，具有5μm步长。tMCAo各阶段显示了表面小动脉（填充箭头）、穿透小动脉（充满箭头）和微静脉（开放箭头）的流明直径，单位为μm。（C）在闭塞和再灌注期间，红细胞速度的变化被绘制为基线直径的函数。方形数据点表示相对于基线具有反向或停滞流动的小动脉。（D）阻塞和再灌注期间管腔直径的变化绘制为基线直径的函数。对于C和D，覆盖运行平均值±SEM（40血管窗口）。插入条形图显示了三种血管类型的平均值±SEM。***p<10^-3，与基线显著不同。

总的来说，在闭塞期间，每类小动脉的红细胞速度降低至基线水平的～30%(图3C，左侧面板）；这种缺血程度属于被定义为半影流的范围(利普顿1999). 闭塞90分钟后，收缩纤维以开始再灌注。在13个实验中的11个实验中，再灌注伴随着红细胞速度向基线值的实质性恢复(图3C，右侧面板）。尽管如此，所有小动脉的速度仅恢复至基线水平的～70%，与LDF测量值相似(图3A)（数据包括11只动物的65条大表面小动脉、56条小表面小动脉和75条穿透小动脉）。

在两例tMCAo患者中，血流值足够低，可归类为卒中核心，即流量下降至基线水平的17%和13%。这些病例的红细胞速度恢复较差，再灌注后仅恢复到基线水平的35%和38%，而主要的tMCAo病例群恢复到约70%。由于这些严重缺血病例只占全部动物的一小部分，因此在随后的数据分析中，将其作为异常值删除。

小表面小动脉和穿透小动脉的管腔直径比基线水平平均增加了约20%(图3B、左侧和中间面板，以及​和3D，三维，左侧面板）。这种血管扩张持续到再灌注期(图3B、右侧面板和​和3D，三维（右面板），并在离断后90分钟观察到，表明缺血后血流延长（数据未显示）。相反，大表面小动脉的直径表现为扩张和收缩，但平均而言，在tMCAo期间的任何阶段，与基线相比均无明显变化(图3D). 然而，由于高碳酸血症，大的表面小动脉均匀扩张，这证明这些血管并没有因颅窗的形成而最大限度扩张(补充材料).

血管舒张追踪红细胞速度以保存缺血后的流量

上述结果表明，在闭塞和再灌注期间，小表面小动脉和穿透小动脉的直径净增加，同时红细胞速度净减少。直径的变化是否补偿了速度的降低以保持RBC流量(等式2)? 在闭塞期间，扩张不足以维持穿透小动脉的红细胞流量的基线水平，平均变化对应着流量的显著净下降（p<0.001）(图4A; 红盒，平均值±2 SEM，远离保守通量的理论线）。相反，当再灌注开始时，平均小动脉直径保持扩张，即使红细胞速度恢复不完全，仍能达到基线流量水平。这一中心结果表明，再灌注期间持续的血管舒张是小动脉流量完全恢复到基线水平的有利因素(图4B; 红盒，平均值±2 SEM，位于保守通量的理论线之上）。

在单独的窗口中打开

图4

血管舒张追踪红细胞速度以在再灌注期间保持流量

（A和B）在闭塞和再灌注期间，管腔直径的变化分别与红细胞速度的变化有关。红细胞通量守恒的界面，基于等式2，以红色显示。曲线上的所有点表示通量的基线水平保持不变；曲线左侧的流量低于标准，而右侧的流量增加。红框，平均值±2 SEM，是所有血管的平均响应。在遮挡（A）期间，平均响应与守恒通量线上的最近点显著不同；p<0.001（双侧单样本t检验）。相反，再灌注期间的平均反应（B）与守恒流量线无显著差异；p>0.05（双侧单样本t检验）。数据代表了11 tMCAo实验中合并的131个表面小动脉（三角形）和穿透小动脉（圆形）。本分析中未包括大的表面小动脉。（C和D）Window对照组的血管动力学变化，即无血管操作的颅窗在第二或第三成像期与保守通量线无显著差异；p>0.05（双侧单样本t检验）。对于对照组，每个成像周期与tMCAo实验组保持相同的时间跨度，即，90分钟。数据代表113个表面小动脉和穿透小动脉，这些小动脉来自6个窗口控制实验。

为了控制生成颅窗的效果，我们还对一个window控制组进行了成像，即无血管操作的颅窗。该组在两轮成像中没有显示出直径或速度的显著变化，这与tMCAo组的闭塞和再灌注时间安排相同，因此平均反应没有观察到与保守通量的显著偏差(图4C和4D) (补充图3). Window对照组还发现，随着时间的推移，单个血管的测量参数存在固有的可变性。尽管在许多动物身上收集的血管群的平均反应表明与保守流量线有明显的关联，但在单个血管水平上，血管动力学变化并不一定符合这一理论。

为了进一步检查红细胞流量和血管直径之间的关系，并验证我们测量的准确性，我们计算了tMCAo实验中所有血管的流量(等式1). 当将归一化通量绘制为管腔直径的函数时(图5A)在再灌注期间，与大的表面小动脉相比，表面小动脉和穿透小动脉明显优先恢复。这与图中显示的小直径小动脉的特异性扩张相一致图3D.

在单独的窗口中打开

图5

tMCAo期间红细胞体积流量的变化

（A）红细胞流量在闭塞和再灌注期间的变化绘制为基线直径的函数。方形数据点表示相对于基线具有反向或停滞流动的小动脉。覆盖运行平均值±SEM（40血管窗口）。插入条形图显示了三种容器类型中每种类型的通量±SEM的平均变化。***p<10^-3，与基线显著不同。（B和C）在两个单独的实验中，测量了进入和离开小动脉网络的累积流量。每个成像周期都会显示带有流量值（nL/s）的动脉轨迹。条形图总结了每个时期小动脉网络的净输入（IN）和输出（OUT）。图中还显示了仅通过穿透小动脉（PA）流出的流量。

我们的主张取决于在测定红细胞流量时没有系统误差。作为对照，我们检查了小网络的测量输入是否等于其输出。只有在所有输入/输出血管都有一个平行于焦平面的线段的网络中，这种测量才是可能的；这一要求在2个网络中实现(图5B和5C). 在这些情况下，我们确认在所有三个成像周期内，通量基本上保持不变，误差范围为5%（n=6）。如随机抽样数据(图5A在再灌注期间，穿透小动脉的积分流量恢复到基线水平，而从大的表面小动脉输入到网络的总流量减少。

tMCAo后再灌注缓解半影皮质缺氧

为了检查穿透小动脉的红细胞流量恢复是否与组织再氧合一致，我们使用吡莫硝唑累积作为缺氧探针，检查了成像区域的缺氧组织(Takasawa等人，2008年). 与之前的工作一致，在闭塞期间注射吡莫硝唑导致MCA供应区域内缺氧细胞的异质性染色(图6A至6D，左栏）(Noto等人，2006年). 有趣的是，血管和血管周围的直接神经膜在皮层中基本上没有标记(图6C，箭头）。与闭塞相反，当在再灌注开始后立即注射吡莫尼唑时，背侧皮层基本上没有染色，这表明缺血后组织的均匀再氧化(图6A至6D，右栏）；我们注意到只有神经元形态的单个细胞的稀疏标记(图6C，右侧面板插图）。重要的是，即使在再灌注后，外侧皮质内的区域也经常保持标记(图6B，右面板），这证实了该方法能够检测到再灌注不良的区域。LDF用于确保闭塞注射组和再灌注注射组之间的血流量减少相似，并确保后者成功实现再灌注（数据未显示）。这一结果表明，与穿透小动脉的完全再灌注相一致，在成像区域的表面和亚表面水平上没有不良再灌注区。

在单独的窗口中打开

图6

再灌注期间皮层半暗带缺氧组织缺失

（A）动脉内注射吡莫硝唑（缺氧标志物）的实验时间表。两组之间的探头循环时间相等，即，90分钟。（B）闭塞或再灌注期间注射的动物的吡莫硝唑标记的代表性冠状图像。同侧（黑色，缺血侧）和对侧（蓝色）皮质被划分为背部和侧面。（C）背皮层放大图像（虚线矩形），染色细胞的进一步放大视图（黄色方形）。箭头表示穿透容器周围相对未着色的区域。（D）平均标记面积±SEM表示为背侧或外侧皮质总面积的百分比。散点图中的黑点表示图中所示的动物。插图直方图显示了用于区分同侧皮层阳性染色与背景的阈值设置，定义为对侧强度直方图的下90%（另请参见材料和方法）。***p<0.001，与闭塞注射组有显著差异（未配对t检验）。

pial网络中的流型变化

先前的研究描述了MCA闭塞时整个小动脉网络的血流模式变化(Schaffer等人，2006年)以及近场去极化(Pinard等人，2002年). 在本研究中，通过使用血管铸型来定义通过成像窗口观察到的小动脉连通性之外的小动脉连接，将这些流动不规则性映射到特定的小动脉网络(图1A和​和2）。2). 我们的研究结果表明，血流逆转和停滞有助于血液的重新分布，以确保在低流量条件下穿透性小动脉的均匀供应。与此设计一致，在局灶性卒中期间，穿透性小动脉在任何时候都不会逆转或停滞。在所有测量的表面小动脉中，72%位于环结构内或与ACA侧支直接相连。尽管这一比例很大，但只有12%的血管出现了血流逆转或停滞。这表明，血流移位的发生不受小动脉连通性的限制，在缺血期间，维持通过穿透小动脉的均匀血流所需的移位相对较少。

软脑膜小动脉红细胞流量的测定

红细胞流量的测定是对体内仅根据血管直径评估血流的研究。特别是，仅测量一个参数可能会产生误导，因为RBC的速度和血管的直径可能独立变化，特别是在血流紊乱期间。Kontos明确指出了这一困难(Kontos 1989年)研究表明，中风诱导的软脑膜小动脉扩张单独是下游流向组织的不良指标(Pinard等人，2002年;Tasdemiroglu等人，1992年). 我们的结果证实，仅仅依靠单一的血流指标就无法完整地描述血管对中风的反应。在“Koizumu”tMCAo范式中，仅红细胞速度表明再灌注期间血流不完全恢复(图3A和3C)而直径测量单独考虑支持持续的血管舒张，从而增加流量(图3B和3D). 根据这些参数计算通量(等式1)然而，研究表明，在再灌注期间，血流实际上恢复到了基线水平(图5A).

我们方法的一个潜在警告是，血清流量没有测量。事实上，在缺血状态下，除了其他营养来源外，血清还提供葡萄糖和氧气。通过测量荧光染料Rovainen的动静脉转运时间等。发现血清流速平均比红细胞流速快3倍(Rovainen等人，1993年). 即使红细胞停滞，血流量也可能持续，在缺血期间可能仍然是重要的氧气来源(Villringer等人，1994年).

我们感谢Agnieszka Prechtl在免疫组织化学方面提供的帮助，感谢Chris Rafie在荧光血管铸型方面提供的协助，感谢Anna Devor提供的手术建议，感谢Jonathan Driscoll和Pablo Blinder对原稿的评论。

基金：这项工作由加拿大卫生研究院、国立卫生研究院（NCRR、NIA、NIBIB和NINDS）、国家科学基金会和退伍军人医学研究基金会资助。