免疫学杂志。作者手稿；PMC 2010年6月28日发布。
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NIHMSID公司：美国国立卫生研究院177670
抑制精氨酸酶活性增强过敏性气道疾病小鼠的炎症反应，并与蛋白质增加相关S公司-硝化和酪氨酸硝化1
，* ，* ，* ，* ，† ，† ，† ，† ，*和2,*
卡琳娜·克鲁斯
*弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学病理学系，邮编：05405
安妮克·兰伯特
*弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学病理学系，邮编：05405
杰西卡·赖斯
*弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学病理学系，邮编：05405
大卫·卡萨哈拉
*佛蒙特大学病理学系，佛蒙特州伯灵顿，邮编05405
马修·波因特
†弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学系，邮编：05405
查尔斯·欧文
†弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学系，邮编：05405
伦纳德·K·A·伦德布拉德
†弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学系，邮编：05405
瑞安·诺顿
†弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学系，邮编：05405
阿尔伯特·范德弗利特
*弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学病理学系，邮编：05405
伊冯·M·W·詹森-海宁格
*弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学病理学系，邮编：05405
*弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学病理学系，邮编：05405
†弗吉尼亚州伯灵顿佛蒙特大学医学系，邮编：05405
摘要
哮喘中的肺部炎症由NF的活性调节-κB.NO和NO合酶（NOS）活性是炎症的重要调节因子。NOS基质的可用性，我-精氨酸，是控制NOS活性的机制之一。精氨酸酶还使用我-精氨酸作为底物，精氨酸酶-1的表达在哮喘小鼠模型中高度诱导。因为我们之前已经描述过精氨酸酶影响NOx含量并干扰NF的激活-κ本研究的目的是研究精氨酸酶抑制对NO生物利用度的影响以及对NF的影响-κ过敏性呼吸道疾病小鼠模型中的B激活和炎症。精氨酸酶抑制剂BEC的给药(S公司-（2-硼乙基）-我-半胱氨酸）降低精氨酸酶活性并导致NO稳态改变，这反映在S公司-炎症小鼠肺部的亚硝化和硝化蛋白质。与我们的预期相反，BEC增强了血管周围和细支气管周围的肺部炎症、粘液化生、NF-κB DNA结合和NF的mRNA表达-κB驱动的趋化因子基因CCL20和KC，并导致气道高反应性的进一步增加。这些结果表明，对精氨酸酶活性的抑制可能通过改变NO稳态，增强了与过敏性气道疾病相关的各种参数。
呼吸道的慢性疾病，如哮喘，与炎症细胞的浸润有关，炎症细胞至少在一定程度上负责增强NO的局部生成。据推测，诱导型NO合酶（iNOS）的诱导，三一氧化氮合酶（NOS）的高输出形式，负责呼气中NO及其氧化产物水平的增加(1，2). 虽然NO对大多数生物分子相对不起作用，但它与其他自由基物种反应非常迅速，例如，这可能导致更有害的NO氧化形式，过氧亚硝酸盐（ONOO−)，在炎症部位(三，4). 这些活性氮物种（RNS）、过氧亚硝酸盐或二氧化氮的生成导致3-硝基酪氨酸残基的形成，这是伴随哮喘和其他呼吸道炎症疾病发生的标志性事件(5). 相反，在生理条件下，NO可以部分通过以下途径发挥其生物功能S公司-亚硝化，代表NO部分与氨基酸半胱氨酸巯基的氧化还原依赖性共价结合(6).S公司-硝基硫醇是天然存在的支气管扩张剂，其减少与哮喘的病理生理学有关(7).
转录因子NF-κB、 是炎症的关键调节器(8)因此与哮喘的病理生理学有关(9——11). NF公司-κB是一种氧化还原敏感转录因子，其活性受活性氧物种和RNS的影响(12，13). 例如，过亚硝酸盐或过亚硝酸钠发生器SIN-1(N个-吗啉糖苷胺盐酸盐），诱导NF-κ不同类型细胞中的B激活(14，15). 相反，NO本身被认为通过S公司-NF组分的亚硝化和失活-κB通路。我们的实验室和其他实验室已经证明NO抑制NF-κB由S公司-I的亚硝化κB激酶β(16)和NF-κB p50亚单位(17，18). 事实上，大量研究表明S公司-亚硝化通过在生理和病理条件下改变几种蛋白质的性质和功能，在信号转导中起着重要作用（综述见参考文献。19，20).
NO的浓度既受其在化学反应中的消耗调节，也受其在细胞微环境中的产生调节。NO的产生主要是由于NOS的活性，NOS是高度调节的。假设所需基质的可用性，我-精氨酸是控制NOS活性的机制之一。我-精氨酸不仅是NOS的底物，而且是水解精氨酸酶的底物我-精氨酸到我-鸟氨酸和尿素(21). 精氨酸酶，通常被称为肝脏尿素循环中的一种酶，也存在于许多其他细胞和组织中，包括肺(22). 哺乳动物精氨酸酶的两种不同亚型，精氨酸蛋白酶I和精氨酸酶II(23)，在气道中表达(24，25). 精氨酸酶最近被认为是哮喘的一个新的潜在关键因素。在过敏性气道疾病小鼠模型和哮喘患者中诱导精氨酸酶的表达和活性(22). 已经表明我-精氨酸可用性由精氨酸酶激活引起，可能导致NO生物活性的丧失(26，27).
我们最近描述了精氨酸酶的活性影响NOx含量（在我们的研究中定义为一氧化氮及其代谢物）并干扰NF-κ小鼠肺上皮细胞中的B(18). 本研究的主要目的是在精氨酸酶增加的条件下，研究精氨酸蛋白酶抑制对先前存在的过敏性炎症的影响，确定精氨酸酶类的抑制如何影响NOx的化学，并探讨NF活性的影响-κB、 从而引发炎症。为此，我们使用了变应性气道疾病的OVA模型和抑制精氨酸酶的药理方法。
材料和方法
过敏性气道疾病小鼠模型
6至8周龄的雌性BALB/c小鼠（杰克逊实验室）被安置在佛蒙特大学（弗吉尼亚州伯灵顿）的美国实验动物护理认证协会认可的动物设施内。小鼠腹腔注射20μ在第0天和第7天，使用2.25 mg Imject Alum（Pierce）的OVA（V级；Sigma-Aldrich），或仅使用2.25毫克Imject Alum进行模拟增敏。在第14-16天，所有小鼠在PBS中用1%OVA雾化激发30分钟。最后一次OVA激发两小时后，用异氟醚麻醉小鼠，并进行BEC口咽部抽吸(S公司-（2-硼乙基）-我-半胱氨酸，0.30 mmol/L；Calbiochem）或PBS，体积为40μl.在最后一次OVA激发48小时后（第18天），通过静脉注射致死剂量的戊巴比妥对小鼠实施安乐死。根据我们实验室先前的观察结果，我们选择了OVA给药方案，结果表明，在三次激发48小时后，炎症反应最大，NF激活-κ呼吸道上皮中的B很容易显现(28). BEC的给药时间是根据先前的一份报告选择的，该报告表明精氨酸酶I的增加发生在OVA激发的2到4天之间(29). 机构动物护理和使用委员会批准了所有研究。
支气管肺泡灌洗（BAL）
通过滴注和恢复800次，立即从安乐死小鼠中收集BAL液μ1升0.9%生理盐水通过气管插管。离心BAL液，收集上清液，使用NO分析仪（离子仪器）分析NO及其代谢物。将颗粒细胞重新悬浮在PBS中，并用血细胞仪计数。对于细胞自旋，2×104将细胞以800rpm离心到载玻片上5分钟。使用Hema3试剂盒（Biochemical Sciences）对细胞自旋进行染色，并对500个细胞进行差异细胞计数。
生物-Plex分析
根据制造商的BAL液分析说明，使用Bio-Plex（Bio-Rad）小鼠细胞因子23-Plex试剂盒。使用冻干复合细胞因子建立标准曲线。
血浆采集和Ig分析
安乐死后，通过心脏穿刺收集血液，转移至血浆分离管，离心，血浆在-80°C下冷冻。为了通过捕获ELISA测定卵巢特异性血清IgE，平板上涂有2μg/ml单克隆抗鼠IgE Ab（克隆R35-72；BD Pharmingen）在PBS中室温放置1小时。洗涤平板，将血清样品一式两份，在PBS/1%BSA中稀释1/2–1/250，在室温下持续1小时。在室温下，用1/2500稀释的地高辛偶联OVA（Roche）在PBS/1%BSA中清洗并孵育平板1小时。用1/2000稀释的抗地高辛Fab片段与PBS/1%BSA中的过氧化物酶（罗氏）偶联，清洗培养板，培养30分钟。用研发系统的试剂冲洗培养板，用1 N H停止2SO公司4，使用Bio-Tek Instruments PowerWave读取ODX（X）在450nm处，背景减影在570nm处。数据以OD值（±SEM）报告，OD值来自读数线性范围内的相同稀释度（1/10）。
肺匀浆的制备
在安乐死和收集BAL后，右肺叶在液氮中快速冷冻。使用研钵和杵将冷冻肺在液氮中粉碎，并在含有0.4 mM EDTA、0.04 mM新铜试剂、1%Triton、蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾液2（Sigma-Aldrich）的25 mM HEPES缓冲液中均质。均质后，将样品置于4°C的轨道摇摆台中20分钟，然后在14000 rpm、4°C下离心5分钟。上清液用于分析NO代谢物和Western blotting。
EMSA分析
对于EMSA，将粉碎的肺（100 mg）与500μl缓冲液A（20 mM HEPES（pH 7.8）、20 mM KCl、4 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、1 mM DTT、蛋白酶和磷酸酶抑制剂；Sigma-Aldrich），并在冰上培养15分钟。添加50微升缓冲液B（1%Nonide P-40），涡流30秒，在6000×克.颗粒于200年重新悬浮μl缓冲液C（100 mM HEPES（pH 7.8）、100 mM KCl、600 mM NaCl、0.2 mM EDTA、20%甘油、1 mM DTT、蛋白酶和磷酸酶抑制剂），在4°C的摇床上培养30分钟，然后在4°C的14000 rpm下离心15分钟μ根据先前公布的程序，向EMSA提交了g核蛋白(30).
化学发光法测量NOx和亚硝酸盐/硝酸盐含量（NO代谢物）
亚硝酸盐和亚硝基/亚硝基团（RSNO，S公司-硝基硫醇；注册号，N个-亚硝基加合物，包括N个-亚硝胺；全肺匀浆或BAL中的金属亚硝基（NO-heme除外）通过碘碘的基团特异性还原脱氮作用进行测定，随后检测气相臭氧化学发光释放的NO(31，32)，使用NO分析仪（离子）。25人-μ将l个样品注入含有5 ml 45 mM KI和10 mM I的净化容器中2在60°C的冰醋酸中，用氮气持续净化(33). 为了清楚起见，我们将在本研究中将这些测量称为NOx含量。从样品中释放的NO的量基于S公司-亚硝基谷胱甘肽（GSNO；Calbiochem）。肺部匀浆的结果表示为每微克蛋白质的微克数，而BAL的结果则表示为纳米摩尔浓度。要分析BAL液中的亚硝酸盐/硝酸盐，10μ将1 l样品注入含有1 N HCl中氯化钒饱和溶液的吹扫容器中，温度为90°C，用氮气连续吹扫。根据硝酸盐标准曲线计算样品中亚硝酸盐/硝酸盐的含量(33).
精氨酸酶活性
如前所述，在从BAL获得的炎性细胞或从原代小鼠气管上皮细胞获得的裂解物中评估精氨酸酶活性(34). 为了证明BEC抑制精氨酸酶活性，建立并繁殖了原代小鼠气管上皮细胞的培养物(35)，并用0.5或1 mM BEC（钙生物化学）处理24小时。用不同浓度的底物进行精氨酸酶分析，我-精氨酸，如图所示。使用尿素生成的标准曲线，在540 nm处用分光光度法测定精氨酸酶产生的尿素。结果表示为每种蛋白质的尿素浓度（毫微克）。
蛋白质印迹
将肺匀浆或核提取物与2×Laemmli样品缓冲液混合，煮沸5 min，然后装入聚丙烯酰胺凝胶。将蛋白质转移到硝化纤维素中，对硝基酪氨酸、iNOS和负荷控制进行Western blottingβ-肌动蛋白是使用各自的初级Abs（Upstate Biotechnology）进行的。
定量聚合酶链反应
根据制造商的说明（Life Technologies），使用TRIzol（生命科技）从肺部分离的总RNA经过DNA酶处理，并使用带有SuperScript II逆转录酶的随机六聚体进行逆转录。使用Bio-Read SYBR Green 2×缓冲液和为小鼠钙激活氯通道3（Clca3）或IL-13设计并验证的内含子跨越引物进行实时定量RT-PCR，作为粘液细胞化生和粘液生成的指标(36，37)、炎症细胞因子CCL20（MIP-3α，巨噬细胞炎性蛋白3α)和KC（α炎症和免疫调节细胞因子的趋化因子（CXC）家族）和看家基因β-肌动蛋白。在Bio-Read Chromo4热循环和检测系统上进行40个PCR循环，使用以下循环条件：在95°C下变性30 s，在55°C下退火30 s，72°C下延伸30 s，然后生成熔融曲线。基因表达水平标准化为β-肌动蛋白水平和相对mRNA水平根据比较循环阈值法（ABI Prism 7700序列检测系统，用户公报第2期；应用生物系统）测定。
组织病理学和免疫组织化学
安乐死和BAL后，在PBS中向左肺叶滴入4%的多聚甲醛，并在4°C下放置于4%多聚甲醛中过夜，然后包埋在石蜡中。第7个-μ玻璃显微镜载玻片上的m个切片用二甲苯脱蜡，通过一系列乙醇进行再水化，并用H&E或周期性酸性Schiff染色，这表明产生了粘液。用光学显微镜检查载玻片（40倍物镜）。由两名独立、盲法观察者使用0至3的评分标准对大气道和细支气管的周期性酸性Schiff阳性气道上皮细胞（洋红）进行评分。然后根据治疗组对每只小鼠的累积得分进行平均。支气管周围和血管周围炎症采用1-4分制评分（1，气道或血管周围无浸润；2，少量气道或血管附近有小浸润；3，仅部分气道或血管周边有大浸润；4，大多数气道或血管四周有大浸润）根据之前公布的程序，至少由两名独立的、盲目的观察者进行(38). 然后根据治疗组对每只小鼠的累积得分进行平均。或者，将制备用于免疫染色的载玻片在90°C的10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0；Sigma-Aldrich）中加热30分钟，以进行Ag脱皮，并在室温下用10%山羊血清封闭1小时。将载玻片与各自的初级抗体在4°C下孵育过夜，然后在室温下与Alexa Fluor-conjugated（Molecular Probes）次级抗体孵育1h。核酸用Sytox Green（0.625μM；分子探针）在室温下保持10分钟。免疫荧光用Olympus BX50立式显微镜进行可视化，显微镜配置为Bio-Rad MRX 1000共焦扫描激光显微镜系统。作为试剂对照，在孵育过程中省略了主要抗体，这导致没有检测到免疫反应性（数据未显示），如之前公布的那样(28).
生物素衍生和共聚焦显微镜分析评价肺组织中S-亚硝基化
脱蜡后，在含有0.4 mM EDTA和0.04 mM新铜试剂的PBS中清洗肺切片，并用40 mM阻断巯基N个-PBS中含有0.4 mM EDTA、0.04 mM新铜试剂和2.5%SDS的乙基马来酰亚胺。去除封闭溶液后，将切片与1mM抗坏血酸钠在室温下孵育15分钟，以降低S公司-亚硝化蛋白质后0.1 mMN个-（3-马来酰丙酰）生物细胞素在室温下培养30分钟，然后在室温下与链霉亲和素Alexa Fluor 568（分子探针）孵育30分钟。贴标签前的所有程序N个-（3-马来酰丙酰基）生物细胞素在直射光保护下进行。细胞核在室温下用Sytox Green染色10分钟，并使用配置为Bio-Read MRX 1000共焦扫描激光显微镜系统的Olympus BX50立式显微镜扫描切片(39).
呼吸力学和高反应性测定
如前所述，使用强迫振荡技术对麻醉小鼠进行机械通气以评估呼吸力学(40，41). 记录牛顿阻力、气流不均匀性或组织阻力以及对乙酰甲胆碱递增剂量的气道关闭/弹性的测量结果。
统计分析
所有数据均表示为每组4至8只动物的平均值±SEM。使用Studentt吨检验，或用土耳其检验进行方差分析，以调整多个成对比较。在所有分析中，使用的显著性水平为对< 0.05. 所有实验至少重复两次。
结果
抑制精氨酸酶增加过敏性气道疾病小鼠的支气管周围和血管周围炎症及粘液化生
先前的研究表明，患有过敏性气道疾病的小鼠的肺匀浆中精氨酸酶表达增加(22). 我们首先研究了精氨酸酶在模拟免疫小鼠（Alum/OVA）或OVA致敏和攻击小鼠（OVA/OVA）肺部切片中的定位。中的结果证明精氨酸酶1在对照（Alum/OVA）小鼠肺部细支气管上皮中的免疫定位证据。正如预期的那样，为了应对OVA的致敏和挑战，精氨酸酶I在细支气管上皮中的表达似乎略有增加，并且在炎症细胞中高度表达，免疫荧光分析证明了这一点()以及OVA/OVA组BAL恢复的细胞中精氨酸酶活性的增加(). 因为我们最近证明，抑制小鼠气道上皮细胞中的精氨酸酶可抑制NF-κB和NF-κ接下来，我们评估了精氨酸酶抑制对过敏性气道疾病的影响。我们首先通过评估BAL细胞中的精氨酸酶活性，证实了BEC对精氨酸的抑制作用。BEC是一种硼酸基精氨酸类似物，已被合成并验证为双核锰金属酶精氨酸特异性竞争抑制剂。它已被用于研究NOS通过竞争内源池来调节NO生成我-人阴茎海绵体中的精氨酸(42，43). 中的结果证明与接受PBS的小鼠相比，BEC治疗24或48小时显著抑制OVA致敏和激发小鼠BAL细胞中精氨酸酶的活性，而在Alum/OVA小鼠中未观察到任何变化。为了证实BEC抑制精氨酸酶的酶活性，我们用不同浓度的BEC处理小鼠气管上皮细胞，并在不同浓度的底物存在下进行精氨酸活性测定，我-精氨酸。正如预期的那样，BEC在体外显著抑制精氨酸酶活性，并且在存在较低浓度的我-精氨酸，BEC对精氨酸酶的抑制作用更强(). 在证明服用BEC可减弱精氨酸酶活性后，我们接下来评估其对OVA诱导的炎症的影响。在最后一次挑战Alum/OVA对照组或OVA/OVA组2小时后施用精氨酸酶抑制剂BEC，不会影响BAL液中的炎症细胞分布(). 为了研究BEC是否影响Igs的产生，测量了OVA致敏和激发小鼠和对照组小鼠血浆中OVA特异性Igs水平。正如预期的那样，经PBS或BEC治疗的小鼠血浆中的OVA致敏和激发增加了OVA特异性IgG1（数据未显示）。令人惊讶的是，与PBS对照组相比，对OVA致敏和激发小鼠（OVA/OVA）施用BEC导致OVA特异性IgE降低(). 正如预期的那样，OVA致敏和激发导致BAL中几种炎症细胞因子水平升高。然而，与PBS对照组相比，暴露于BEC的炎症小鼠中观察到IL-4水平降低(). 接下来，我们评估了精氨酸酶抑制对OVA诱导的组织病理学和气道高反应性的影响。正如预期的那样，OVA致敏和激发导致BALB/c小鼠血管周围和支气管周围细胞显著浸润(). 精氨酸酶抑制剂BEC显著增强支气管周围炎性细胞的积聚()和血管周围区域()在OVA致敏和激发的小鼠中，而在Alum/OVA对照组中未观察到BEC的影响。接下来我们评估了BEC对OVA诱导的气道高反应性的影响。给过敏性炎症小鼠服用BEC会增加组织阻力或气流异质性（G，)和气道关闭/弹性（H，)与接受50 mg/ml乙酰甲胆碱剂量PBS的小鼠相比。接受BEC的小鼠的明显峰值反应可能发生在乙酰甲胆碱雾化期间，根据观察，暴露于BEC的炎症小鼠在乙酰甲胆碱激发后的第一次测量时，其最大可测量反应已经明显，并且与其他组相比显著增加。未观察到BEC对低剂量乙酰甲胆碱的反应（数据未显示）。BEC不影响牛顿阻力，这是一种衡量气道阻力的指标（数据未显示），表明BEC的作用发生在远端气道，与这些部位发生的血管周围和支气管周围炎症反应增强相一致。服用BEC不会影响未燃烧对照小鼠的呼吸力学。因为粘液化生是过敏性气道炎症和重塑的标志(36)接下来，我们评估了暴露于BEC的小鼠的粘液化生。与PBS治疗的同一组小鼠相比，精氨酸酶抑制导致OVA致敏和激发小鼠的粘液化生增强()而在Alum/OVA对照组中，BEC没有引起粘液化生。IL-13主要由激活的Th2细胞产生，是肺上皮细胞分泌粘液的关键调节器(44). 此外，CLCA3 mRNA水平在过敏性气道中诱导，并与黏蛋白基因调节和杯状细胞增生密切相关(36). 如预期，IL-13的mRNA水平()和CLCA3()OVA致敏和激发的小鼠肺组织中的表达增加。在接受精氨酸酶抑制剂BEC的OVA/OVA小鼠中，这些基因的mRNA表达进一步增强().
精氨酸酶抑制剂BEC对OVA诱导的炎症和精氨酸酶活性的影响。一个，通过多克隆Ab和与Alexa Fluor-568（红色）二次偶联在石蜡包埋的肺切片中分析Arginase I蛋白的表达。用Sytox Green（绿色）对细胞核进行复染。图像以×200的放大倍数呈现。B类，评估在服用BEC 24或48小时后从对照小鼠（Alum/OVA）或过敏性炎症小鼠（OVA/OVA）BAL收集的细胞中的精氨酸酶活性。*，对与OVA/OVA组相比，ANOVA值<0.05。C类，在不含我-精氨酸或存在100、250或500 mM时我-精氨酸*，对与假手术组相比，ANOVA值<0.05。D类，对服用PBS或BEC的对照小鼠（Alum/OVA）或过敏性炎症小鼠（OVA/OVA）BAL液中的差异细胞计数进行评估。E类，通过ELISA分析用PBS或BEC处理的OVA对未敏化和致敏小鼠血浆中的OVA特异性IgE。*，对<0.05使用学生的t吨与OVA/OVA组进行比较。数值为修正后的平均OD±SEM）n个=每组4-5只小鼠。
精氨酸酶抑制剂BEC增强OVA致敏和激发小鼠的支气管周围和血管周围炎症。通过肺气道石蜡包埋切片染色评估肺组织病理学(一个)和脉管系统(C类). 支气管周围组织学评分(B类)和血管周围炎症(D类)，放大X200.*，对<0.05是学生的t吨与OVA/OVA组进行比较。E类，使用强迫振荡侵入性力学评估气道高反应性(40，41). 所示为测量气流不均匀性或组织阻力的呼吸力学（参数G）和测量气道闭合/弹性（参数H），以响应50 mg/ml的乙酰甲胆碱剂量。牛顿阻力（R）参数不受BEC影响（数据未显示）。*，对方差分析表明，<0.05表示与OVA/OVA组相比，峰值反应存在差异。#，对方差分析表明，<0.05表示与OVA/OVA组相比，峰值反应时间存在差异。的左段x个-轴代表两次测量，在乙酰甲胆碱剂量为50 mg/ml之前相隔10 s。数据代表了在n个=每组4-8只小鼠。
评估用OVA致敏和激发并接受PBS或BEC治疗的小鼠肺组织中的粘液化生、IL-13和CLCA3基因表达。一个，石蜡包埋肺的代表性切片，使用周期性酸性希夫试剂染色，在放大×200倍的条件下观察气道中的粘液生成细胞。B类由两名独立的盲法观察者对气道的周期性酸性希夫反应性程度进行评分，并记录平均得分。从肺部收集RNA，逆转录并分析IL-13(C类)和CLCA3(D类). 用定量PCR分析总肺cDNA，并将数据归一化为看家基因，β-肌动蛋白。数据表示为平均相对表达式±SEMn个=每组4至8只小鼠。*，对<0.05（学生）t吨与OVA/OVA组进行比较。
表一
通过Bio-Plex分析评估BAL液中的细胞因子水平一
| 细胞因子水平，平均值±扫描电镜（pg/ml） |
|---|
|
|
|---|
| 细胞因子 | 明矾/OVA PBS | 明矾/OVA BEC | OVA/OVA PBS系统 | OVA/OVA BEC公司 |
|---|
| 白介素-1α | 1.575 ± 0.9 | 2.035 ±1.2 | 3.015 ± 0.4 | 2.475 ± 1.5 |
| 白介素-1β | 1.08 ± 0.1 | 2.50 ± 0.9 | 5.98 ± 0.7 | 6.75 ± 1.1 |
| 白介素-2 | 0.68 ± 0.2 | 0.41 ± 0.1 | 3.87 ± 1.3 | 3.11 ± 1.5 |
| 白介素-3 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 0.68 ± 0.2 | 0.62 ± 0.13 |
| 白介素-4 | 0.43 ± 0.2 | 0.51 ± 0.3 | 36.1 ± 10.1 | 22.29 ± 4.0b条 |
| 白介素-5 | 0.59 ± 0.2 | 0.8 ± 0.3 | 43.49 ± 20.6 | 42.24 ± 18.1 |
| 白介素-6 | 2.28±0.5 | 1.76±0.35 | 7.27 ± 1.36 | 6.91 ± 2.85 |
| 白介素-9 | 19.15 ± 7.2 | 17.20 ± 1.8 | 24.0 ± 5.5 | 23.66 ± 10.1 |
| 白介素-10 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 21.00±6.6 | 19.27 ± 7.1 |
| 白介素-12 p40 | 5.06 ± 0.5 | 5.91 ± 0.3 | 49.55 ± 10.6 | 49.79 ± 12.0 |
| IL-12 p70 | 3.20 ± 1.3 | 1.74 ± 0.4 | 2.80 ± 0.6 | 3.86 ± 0.7 |
| 白介素-13 | 29.49 ± 7.2 | 21.42 ± 3.4 | 111.32 ± 41.2 | 117.55 ± 22.0 |
| 白介素-17 | 1.38 ± 0.5 | ND（无损检测） | 6.90 ± 2.1 | 4.76 ± 2.5 |
| 肠毒素 | 34.65 ± 16.6 | 134.41 ± 76.8 | 139.90 ± 51.3 | 163.14 ± 48.2 |
| 兰特斯 | 1.84 ± 0.3 | 1.87 ± 0.05 | 10.62 ±1.0 | 9.75 ± 2.4 |
| MIP-1α | 165.60 ± 22.7 | 200.15 ± 21.3 | 241.44±10.3 | 241.09±42.7 |
| MIP-1型β | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 9.315 ± 3.6 | 2.475 ±3.1 |
| KC公司 | 58.12 ± 2.8 | 51.33 ± 16.9 | 576.47 ± 68.5 | 463.06±170.5 |
| G-CSF公司 | 2.36 ± 0.4 | 2.76 ± 0.9 | 3.015 ± 1.0 | 2.475 ± 2.6 |
| GM-CSF公司 | 10.12 ± 1.9 | 11.18 ± 2.0 | 26.66 ± 3.8 | 27.13 ± 5.6 |
| MCP-1型 | ND（无损检测） | ND（无损检测） | 32.65 ± 4.1 | 41.56 ± 9.5 |
精氨酸酶抑制导致NF增强-κB DNA结合与核因子-κ过敏性气道疾病小鼠B依赖性炎症基因的表达
NF公司-κB是过敏性气道疾病小鼠炎症基因表达的关键调节因子(11，45). 接下来我们调查了NF是否-κ服用BEC后，气道炎症小鼠肺核提取物中的B活性发生改变。基础NF-κB DNA结合在明矾/OVA对照肺中可检测到，并且不会因服用BEC而发生变化。如预期，NF-κBDNA结合在OVA致敏和激发小鼠的肺中增加，并且在BEC治疗后进一步增加，尽管个别小鼠之间存在一些差异(). NF的特异性-κB DNA结合复合物通过NF的完全置换得到证实-κ存在50倍摩尔过量未标记NF的B/DNA复合物-κB探头（数据未显示）。接下来，我们检测了炎性细胞因子KC和CCL20的表达，它们受到NF的转录调节-κB.KC参与中性粒细胞的趋化性和细胞活化(46)而CCL20负责招募CD4+和CD8+T淋巴细胞(47)以及未成熟的树突状细胞。接受OVA免疫和攻击的小鼠表明肺匀浆中KC和CCL20 mRNA均增加。在接受BEC的OVA免疫和激发（OVA/OVA）小鼠中，KC和CCL20 mRNA的表达进一步增加(和C类)与PBS对照组比较。
NF评估-κB活化和NF表达-κ在接受PBS或BEC的小鼠中用OVA致敏和激发后，肺匀浆中的B依赖性炎症基因。制备粉碎肺的核提取物以评估NF-κB DNA通过EMSA结合。一个，显示了包含RelA和p50的DNA结合复合物。图像下方显示了密度定量的结果，并表示为Alum/OVA组PBS对照标准化的折叠增加±SEM。从肺部收集RNA，逆转录，并分析炎症细胞因子KC(B类)和CCL20(C类). 通过定量PCR分析总肺cDNA，并将数据归一化为看家基因HPRT。数据表示为平均相对表达式±SEMn个=每组4-5只小鼠。*，对<0.05（学生）t吨与OVA/OVA组进行比较。
抑制精氨酸酶改变小鼠肺中NO代谢物的含量
以前的报告表明，抑制精氨酸酶可以增加髓细胞中NO的生成(48，49)和肺上皮细胞(18). 我们通过测量样品中的亚硝酸盐和亚硝基/亚硝酸盐复合物来检查精氨酸酶活性的抑制是否影响BAL和全肺匀浆中的NOx含量。中的结果证明BEC增加了对照（Alum/OVA）和炎症（OVA/OVA）小鼠BAL液和肺匀浆中的NOx含量。通过使用基于氯化钒的化学发光法，我们没有观察到BAL液中亚硝酸盐/硝酸盐总含量的任何变化，也没有观察到Alum/OVA或OVA/OVA组的脱蛋白肺匀浆对PBS或BEC的反应（数据未显示）。接下来，我们研究了精氨酸酶的抑制是否导致S公司-使用原位生物素开关分析法检测非致敏、致敏和激发OVA小鼠肺组织中的亚硝化蛋白(39). 与之前在肺上皮细胞中的观察结果一致(18)，精氨酸酶抑制导致抗坏血酸依赖性半胱氨酸标记增加，与S公司-在未致敏和致敏OVA攻击小鼠中的亚硝化蛋白。这种反应在细支气管上皮中最为显著，尤其是在患有过敏性炎症的小鼠中(，右下角).
BEC对NOx和S公司-非致敏小鼠和OVA致敏和攻击小鼠的亚硝化蛋白。BAL中的NOx（亚硝酸盐、亚硝基硫醇、RSNOs和亚硝胺/亚硝基血红素、RNNOs）(一个)或肺匀浆(B类)通过化学发光进行评价。注入等量样品，并将所得值归一化为蛋白质含量。在这两项分析中，NOx含量的测定使用S公司-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）作为标准。数值为平均值±SEMn个=每组4-5只小鼠。*，对与各PBS对照组相比，<0.01 ANOVA。S公司-在肺部石蜡切片中检测到亚硝化蛋白(C类)通过“生物素开关”检测小鼠，如材料和方法（红色，S公司-亚硝基化蛋白），在放大×200倍的条件下，用Sytox Green对细胞核进行复染。
由于BEC导致NOx含量增加，因此3-硝基酪氨酸的存在被评估为评估哮喘OVA模型中RNS引起的蛋白质氧化的稳定标记物(29). 免疫荧光分析()和西方印迹法()，硝基酪氨酸反应性增加，以应对OVA的致敏和挑战，大多数免疫反应性以间断模式累积，与炎症细胞一致(29). 精氨酸酶抑制剂BEC进一步增加了硝基酪氨酸的反应性，并增加了支气管周围区域的表观反应性(). 硝化蛋白含量的变化与iNOS表达的变化无关().
精氨酸酶抑制剂BEC对OVA致敏和激发小鼠的硝化蛋白和iNOS蛋白水平的影响。石蜡包埋肺切片用于检测硝化蛋白(一个)通过抗硝基酪氨酸单克隆抗体和与Alexa Fluor-568（红色）偶联的次级抗体，放大×200。Nuclei用Sytox Green复染。硝基酪氨酸(B类)或iNOS(C类)分别用小鼠单克隆抗硝基酪氨酸或抗iNOS在小鼠肺匀浆中检测到，并用HRP偶联二级抗体进行检测。β-肌动蛋白被用作硝基酪氨酸蛋白印迹的负荷控制。密度评估结果显示在硝基酪氨酸蛋白印迹下方，并表示为Alum/OVA组PBS对照标准化的倍数增加±SEM。数据为平均值±SEMn个=每组4-5只小鼠。*，对<0.01学生t吨测试。
讨论
NOS和精氨酸酶竞争共同的底物，我-精氨酸(18，50). 最近的研究表明，精氨酸酶在过敏性气道疾病模型和哮喘患者中上调(51，52)强调了过敏性疾病可能与NO或其功能代谢物的内稳态变化有关，包括S公司-硝基硫醇。事实上，在哮喘患者中S公司-观察到硝基硫醇(7). 在这项研究中，我们发现用OVA致敏和激发的BALB/c小鼠在炎症细胞和上皮中的精氨酸酶I的活性和表达增加，并且在用OVA致敏和激发后对精氨酸酶的抑制导致肺组织中的炎症反应增强，呼吸力学的改变。因为我们给气道注射了BEC，所以推测BEC的作用机制与抑制上皮中的精氨酸酶I有关是很有吸引力的。然而，显然还需要进一步的研究来调查精氨酸酶I和II在疾病发病机制中的相对作用，这两种酶在哮喘中均增加(51)除了说明它们的位置外，还可能涉及遥远的地点。
我们最近证明，抑制小鼠肺上皮细胞中的精氨酸酶可以提高NOx和S公司-亚硝基化蛋白和减弱NF的激活-κTNF诱导的B-α导致促炎细胞因子表达减少(18). 这些先前的发现表明，抑制或精氨酸酶在体内具有抗炎作用，与本研究形成了直接对比。相反，我们观察到，对OVA致敏和激发的小鼠施用精氨酸酶抑制剂BEC，会导致S公司-硝基硫醇和NF-κ肺组织中的B DNA结合。这些变化与血管周围和细支气管周围炎症、粘液化生增强以及趋化因子CCL20和KC表达增强有关。有许多可能解释这些明显的差异。首先，尽管肺组织中精氨酸酶的抑制导致S公司-硝基硫醇，3-硝基酪氨酸的增加也很明显，而亚硝酸盐/硝酸盐水平的增加则无法检测到。与之前的报告一致(29)这些变化并不是由于iNOS上调所致。这些共同的发现表明，虽然组成型NOS酶的“输出”增加，但与NOS和精氨酸酶对共享底物的竞争丧失一致，我-精氨酸，产生的额外NO可能已被消耗以产生高RNS，这可能会超过S公司-硝基硫醇是NO的有益形式。
在过敏性气道疾病中，炎症细胞，尤其是嗜酸性粒细胞的存在，与许多氧化剂的产生有关(53). 这些活性氧物种与精氨酸酶抑制产生的NOx水平增加相结合，有可能与RNS反应并生成高浓度RNS，如过氧亚硝酸盐或二氧化氮，这些被认为是NO的潜在有害代谢物(54). 重要的是，过氧化物酶，包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶，可以消耗NO代谢物亚硝酸盐，生成二氧化氮，二氧化氮也可以介导酪氨酸硝化(三，53，55). 在本研究中，我们无法检测到BEC给药后对照组或OVA/OVA小鼠肺匀浆或BAL中亚硝酸盐/硝酸盐浓度的变化，这可能是过氧化物酶摄入亚硝酸盐的结果，与观察到的蛋白质酪氨酸硝化增加相一致。哮喘患者的肺组织或呼出气体冷凝液中硝基酪氨酸反应性水平增加，与疾病严重程度有不同的相关性(4，5，29，56——58). 我们小组最近的工作表明，吸入25 ppm的二氧化氮会显著增加嗜酸性炎症(59)二氧化氮对雾化OVA起佐剂和致敏作用(60)强调了二氧化氮的促炎作用。因为与PBS对照组相比，BEC治疗的炎症小鼠肺部中的酪氨酸硝化明显增加()，在患有过敏性炎症的小鼠中，精氨酸酶抑制后形成的高反应性NO代谢产物的环境可能导致炎症反应加重，并增加气道高反应性。
与PBS对照组相比，BEC治疗小鼠血管周围炎症反应增强()也可能是由于高RNS形成增强的影响。事实上，过氧亚硝酸盐或具有类似反应性的物种的存在与过敏性气道炎症豚鼠在后期过敏反应期间的微血管通透性增加有关(61). 细胞暴露于重铬酸钾后产生的过氧亚硝酸盐增强了内皮细胞中ICAM-1的表达，这可以促进促炎白细胞的募集(62). 此外，最近的一份报告表明，骨髓源性单核细胞释放的NO促进血管舒张和血管通透性，增加炎症细胞的浸润(63). 这些结果表明，精氨酸酶抑制后NO的增加在某些微环境中也可能具有促炎作用，与更具反应性的NO代谢产物的形成无关。
操纵NOS酶活性或表达的各种啮齿动物模型，或S公司-硝硫醇稳态受到影响，表明NOx与控制过敏性炎症和气道高反应性之间存在复杂的关联。例如，过敏性气道疾病小鼠iNOS的慢性抑制导致气道嗜酸性粒细胞积聚减少，气道高反应性降低(64). 然而，在过敏性炎症豚鼠中，给予NOS抑制剂，我-NAME、气道壁单核细胞和嗜酸性粒细胞减少、胶原沉积增加、肺弹性和阻力增加，表明NO在气道结构和功能中可能发挥有益作用(65). 此外，肺组织中eNOS过度表达的两个独立模型显示OVA诱导的气道炎症减轻，呼吸力学改变(66，67). 最后，老鼠缺乏S公司-亚硝基谷胱甘肽还原酶升高了S公司-虽然OVA诱导的炎症在S公司-亚硝基谷胱甘肽还原酶缺乏小鼠(68). 尽管上述研究中各种NOx物种相对比例的变化程度尚不清楚，但它们共同说明了NO稳态在控制气道炎症和呼吸力学中的重要性。因此，在精氨酸酶受到抑制后观察到的NO稳态变化似乎是可信的，这反映在两者的增加上S公司-硝基硫醇和3-硝基酪氨酸可能解释血管周围和支气管周围细胞浸润增加的原因。服用BEC后，过敏性炎症小鼠对乙酰甲胆碱的反应导致组织阻力和气道关闭参数增加，这与支气管周围和血管周围区域细胞浸润增加有关(). 人们很容易推测，呼吸力学的这些变化是由于小气道的通透性改变与炎症增强有关，这可能会增加乙酰甲胆碱对平滑肌细胞的接触，如早期峰值反应加快所示(69). 尽管如此，我们小组和其他人报告了气道炎症和高反应性之间的脱钩(11)，连接或解偶联哮喘这些关键特征的机制尚待确定。
NF公司-κB是一种氧化还原敏感转录因子，可被活性氧物种和RNS调节。虽然最初的研究表明NF激活-κ由于氧化剂的作用，这些观察结果在后来的报告中受到质疑(70). 如前所述，我们最近证明了S公司-硝基硫醇抑制NF-κB由于S公司-半胱氨酸179在I中的亚硝化κB激酶-β(16). 然而，我们实验室的早期报告和其他报告(14)证明过氧亚硝酸盐或过氧亚硝酸盐的化学生成物促进了NF的转录激活-κB(12)可能是因为坏死的细胞碎片(71). 这些观察结果为增强的NF提供了可能的解释-κ精氨酸酶抑制后，小鼠肺组织中观察到B激活，酪氨酸硝化明显增加(14，15). 我们不能排除除RNS外的介质可能对NF增强负责的可能性-κ精氨酸酶抑制后B活性或炎症。精氨酸酶控制多胺的产生，在这方面，先前的研究表明，多胺的消耗会诱导神经营养因子-κB激活(72，73). 另外，精氨酸酶也可能影响免疫过程(74，75). 事实上，我们的数据支持精氨酸酶抑制对Ag特异性免疫过程的影响，因为经BEC治疗的小鼠BAL液中Th2细胞因子IL-4水平降低()以及IL-4调节的Ig、IgE循环水平降低(). 这些减少是由于IL-4的免疫反应性和活性降低，还是IL-4不能转导上皮细胞，尤其是考虑到细胞炎症、粘液化生和NF-κ与PBS处理的OVA/OVA对照组相比，这些动物的B活性升高，尚待确定。接受BEC的小鼠中IgE降低的可能解释可能与BEC对Th2细胞因子表达的影响有关，例如全肺匀浆中的IL-13(). Th2细胞因子，如IL-9，可促进肥大细胞增生并增加Fc数量εR表达细胞，从而隔离游离IgE并有效降低血清中的IgE水平(76). 然而，BAL液的细胞因子分析未能检测到接触BEC的炎症小鼠中Th2细胞因子的差异()并且不支持这种情况，或者提示Th2细胞因子环境的变化可能在其他时间点发生，或者系统性发生。
总之，我们在本文中证明，根据观察到的酪氨酸硝化与蛋白质平行增强，药物抑制正在发生过敏性炎症的小鼠中的精氨酸酶有助于NO稳态的改变S公司-亚硝化()，这可能会导致过敏性炎症和高反应性增强（有关综述，请参阅(77). 未来的研究旨在揭示导致这些结果的精确生化介质、作用位置以及所涉及的精氨酸酶亚型。有条件的基因消融策略提供了这一机会，也克服了与药理方法相关的潜在非特异性效应的担忧。这些努力对于哮喘或其他精氨酸酶上调的慢性炎症疾病的治疗药物的开发至关重要，以限制与这些酶的整体抑制相关的潜在副作用。
提出了描述精氨酸酶抑制剂BEC改变NO稳态从而导致气道炎症和高反应性增加的潜在机制的方案。
致谢
我们感谢Amy L.Brown提供的出色技术援助。
脚注
1这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款RO1 HL60014和HL074295的支持。
三本文中使用的缩写：iNOS，诱导型一氧化氮合酶；一氧化氮合酶；RNS，活性氮物种；支气管肺泡灌洗。
披露：作者没有经济利益冲突。
工具书类
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