神经病理学学报。2010; 120(2): 223–236.
中枢神经系统固有免疫诱导的炎症导致原发性星形胶质细胞功能障碍，继而脱髓鞘
,1 ,1 ,1 ,2,三 ,2 ,4 ,4 ,1和
1 拉基·夏尔马
1奥地利维也纳1090年Spitalgasse 4号维也纳医科大学大脑研究中心
玛丽·特蕾丝·费舍尔
1奥地利维也纳1090年Spitalgasse 4号维也纳医科大学大脑研究中心
简·鲍尔
1奥地利维也纳1090年Spitalgasse 4号维也纳医科大学大脑研究中心
保罗·A·费尔茨
2英国伦敦大学学院神经病学研究所
三英国苏格兰邓迪邓迪大学解剖与人类识别中心
Tatsuro Misu公司
4日本仙台东北大学医学研究生院
莫妮卡·布拉德尔
1奥地利维也纳1090年Spitalgasse 4号维也纳医科大学大脑研究中心
汉斯·拉斯曼
1奥地利维也纳1090年Spitalgasse 4号维也纳医科大学大脑研究中心
1奥地利维也纳1090年Spitalgasse 4号维也纳医科大学大脑研究中心
2英国伦敦大学学院神经病学研究所
三英国苏格兰邓迪邓迪大学解剖与人类识别中心
4日本仙台东北大学医学研究生院
通讯作者。 2010年4月30日收到；2010年5月25日修订；2010年5月25日接受。
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摘要
星形胶质细胞的原发性丢失和功能障碍可能会引发脱髓鞘，如视神经脊髓炎，一种中枢神经系统的炎症性疾病。在大多数受这种疾病影响的患者中，星形胶质细胞的损伤是由针对星形胶质细胞上的水通道水通道4（AQP-4）的自身抗体的作用引起的。我们在此表明，在缺乏自身抗体介导机制的情况下，星形胶质细胞的损伤和随后的脱髓鞘也可能发生。将脂多糖注射到白质后，小胶质细胞的初始激活会导致星形胶质细胞的功能紊乱，主要表现为胶质界限处星形胶质细胞足突的收缩以及AQP-4和连接蛋白的丢失，参与星形胶质细胞和少突胶质细胞之间缝隙连接的形成。该模型中的脱髓鞘和少突胶质细胞变性遵循星形胶质细胞病理学。在多发性硬化症的一部分活动性病变中也观察到类似的结构异常。我们的研究表明，星形胶质细胞损伤可能是脑炎症损伤形成级联反应的重要早期步骤。
关键词：脑炎症、多发性硬化、星形胶质细胞、脱髓鞘、视神经脊髓炎
介绍
炎症性脱髓鞘疾病（如多发性硬化症（MS））中的组织损伤通常被认为是由主要靶向髓鞘和/或少突胶质细胞引起的[29]. 然而，脱髓鞘疾病，如视神经脊髓炎（NMO）表明，直接靶向髓鞘或少突胶质细胞并不必要。在NMO中，针对星形细胞抗原水通道蛋白4（AQP-4）的特异性自身抗体[20,21]当这些抗体到达T细胞介导的脑炎症动物的靶点时，它们可以引发中枢神经系统的组织损伤[6,7]. 在这个实验范式中[7]以及NMO患者[34]星形胶质细胞的最初破坏之后是少突胶质细胞变性和原发性脱髓鞘。这些研究表明，在某些情况下，少突胶质细胞损伤和脱髓鞘可能是星形胶质细胞功能障碍或变性的继发后果。
最近，一种新的脊髓脱髓鞘模型被引入，它是通过将脂多糖（LPS）局部注射到脊髓白质中而形成的[11]. 利用该模型，研究表明，通过先天免疫机制激活的小胶质细胞会产生毒性分子，影响髓鞘和少突胶质细胞，从而诱导原发性脱髓鞘，并保留部分轴突[11,26]. 然而，局部小胶质细胞激活是LPS注射的早期反应[26]，但脱髓鞘仅在5-6天后开始。小胶质细胞激活和脱髓鞘开始之间的这种时间延迟，与激活的小胶质细胞产物在诱导脱髓鞘过程中的直接毒性相矛盾。根据NMO及其实验模型的新发现，我们分析了体内外星形胶质细胞对LPS的反应。我们的结果表明，星形胶质细胞的结构和功能变化在脱髓鞘之前以与实验性NMO损伤相似的方式出现，这增加了星形胶质细胞参与脱髓鞘的可能性。我们还提供证据表明，星形胶质细胞功能障碍可能参与了一部分活动性MS病变的发病机制。
材料和方法
实验设计
在四种不同的大鼠脑炎症模型中分析星形胶质细胞病理学（表). 被动转移髓磷脂碱性蛋白（MBP）反应性致脑T细胞系可诱导T细胞介导的炎症反应。通过将含有免疫球蛋白的人类AQP-4自身抗体共同转移到T细胞介导的自身免疫性脑脊髓炎（EAE）动物体内，可获得星形胶质细胞的特异性靶向性。对于对照组，使用针对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的单克隆抗体，以与共转移EAE相似的方式诱导脱髓鞘和少突胶质纤维细胞破坏。在另一个模型中，脊髓局部注射LPS诱导的先天免疫引发炎症性脱髓鞘。最后，我们分析了急性、复发和进行性MS患者不同活动性MS病变中的星形胶质细胞病理学。
表1
| 实验模型/MS组织 | 说明 | 动物/病例数量 | 病变数量 |
|---|
| T细胞EAE | T细胞炎症、巨噬细胞活化、水肿 | 每个时间点3个 | 108 |
| T细胞EAE+MOG抗体 | T细胞炎症、巨噬细胞活化、血脑屏障损伤、脱髓鞘（抗体+补体沉积） | 5 | 30 |
| T细胞EAE+NMO抗体 | T细胞炎症、巨噬细胞活化、血脑屏障损伤、原发性星形细胞破坏（抗体+补体沉积）（继发性脱髓鞘） | 4 | 24 |
| 活性EAE+NMO抗体 | 作为T细胞EAE+NMO抗体，但长期活动性疾病和血脑屏障损伤 | 三 | 15 |
| 液化石油气 | 炎症活动期（粒细胞、少量T细胞），随后是小胶质细胞激活、巨噬细胞募集和脱髓鞘 | 每个时间点3个 | 42 |
| 盐分 | 短暂轻度急性炎症（粒细胞） | 6 | 12 |
| MS模式III | 炎症性脱髓鞘、轴突损伤、低氧样组织损伤、线粒体损伤 | 6 | 21 |
| MS模式II | 炎症性脱髓鞘、轴突损伤、免疫球蛋白+活化补体沉积 | 2 | 14 |
| 渐进式MS（缓慢膨胀） | 中度炎症，缓慢进行性脱髓鞘，轴突损伤，T细胞+巨噬细胞/小胶质细胞 | 5 | 11 |
T细胞介导的EAE
本研究中使用的MBP特异性T细胞是根据标准方案从Lewis大鼠身上获得的[5]. Lewis大鼠腹腔注射1×105活化MBP特异性T细胞或用生理盐水（对照）。之后，每天监测大鼠的体重减轻或EAE的临床症状。诱导EAE后3、6、9、12和15天，动物被过量CO杀死2经心灌注4%多聚甲醛（PFA）于0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）中。脊髓无需解剖，在4%PFA中固定过夜，用PBS清洗并用石蜡包埋。
脑源性T细胞与特异性自身抗体的共转染
如上所述，用MBP-特异性T细胞激发的Lewis大鼠接受了来自NMO患者的10 mg人免疫球蛋白或10 mg正常人IgG（亚库巴）®[7])。另一组患有T细胞介导的EAE的动物接受了1 mg单克隆抗体Z12，针对MOG的构象脱髓鞘表位，如前所述[23,31]. 当T细胞介导的中枢神经系统炎症开始时，在T细胞转移后第4天全身注射抗体。抗体转移后1天处死动物，解剖大脑和脊髓，并常规用石蜡包埋。为了研究损伤发展的后期时间点，Lewis大鼠在尾部底部用100µg MBP（含完全弗氏佐剂）主动致敏。在临床疾病开始时（免疫接种后第10天），动物接受NMO IgG或皮下注射。24小时后重复此操作。免疫后第12天进行中枢神经系统损伤分析。
LPS模型
Felts等人详细描述了LPS介导的大鼠脊髓损伤[11]. 在异氟醚麻醉下，在T12椎体水平进行四分之一椎板切除术，并在硬脑膜上开一个小孔。然后将尖端外径为25μm的拉制玻璃微移液管插入背索，并在0.7和0.4 mm（共2μl）深度的两个相邻位置注射0.5μl LPS（100 ng/μl生理盐水），纵向间隔1 mm。LPS来自马流产沙门氏菌（Sigma，Poole，UK）未经进一步纯化。对照组只注射生理盐水。注射部位通过在邻近硬脑膜上放置少量无菌活性炭进行标记。
在注射后的不同时间点（8小时和1、3、5、8、12和15天），用异氟醚麻醉动物，然后用4%PFA在0.15 M PBS中经心灌注。对脊髓进行游离解剖，将注射部位以及注射部位前、后1 cm区域的组织块包埋在石蜡中。
本研究中使用的所有动物组织都是从大脑研究中心的档案中检索到的，相关研究已在早些时候发表[7,26,23].
人体尸检组织
这项研究是在奥地利维也纳医科大学脑研究中心存档的多发性硬化症患者和石蜡切片对照患者的尸检脑上进行的（表). 对这些尸检大脑的半球或双半球切片进行特征描述和分类，以确定急性II型和III型[26]进行性MS的缓慢扩张病变和慢性非活动性病变[12]. 作为对照，我们纳入了8名无神经系统疾病且无任何CNS损伤的患者的尸检组织。
免疫组织化学
对人和大鼠材料的3-5μm厚石蜡切片进行免疫组织化学研究。用二甲苯替代物（XEM）（德国Fluka分析公司）对切片进行两次脱蛋白处理，每次20分钟，用96%乙醇冲洗两次，用甲醇中的过氧化氢处理30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，在一系列乙醇中再水化（96>70>50>30%）并在含有10%胎牛血清（PBS/CSF）的磷酸盐缓冲盐水中进一步孵育1小时，以阻断非特异性抗体结合。在家用食品蒸锅设备中，通过在EDTA（1 mM EDTA，10 mM Tris，pH 8.5或9）或0.1 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6）中加热切片60-90分钟来进行抗原回收。主要抗体（见表)隔夜应用于PBS/FCS。然后，将载玻片在PBS中洗涤3-4次。然后，将载玻片与生物素化的二级抗体（绵羊抗小鼠、驴抗兔、驴抗山羊；均来自Amersham或Jackson Immuno Research）在室温下孵育1小时。在PBS中清洗3-4次后，用亲和素过氧化物酶（在10%FCS/PBS中稀释1:100）处理切片，并在室温下培养1小时。为了显示结合的抗体，如前所述，使用二氨基联苯胺作为发色剂[18].
表2
| 一级抗体 | 目标 | 稀释 | 预处理 | 二级抗体 | 稀释 | CuSO公司4增强 |
|---|
| 免疫组织化学 |
| α-GFAP（新标记物） | 胶质纤维酸性蛋白 | 1:3,000 | 乙二胺四乙酸 pH=8.5，60分钟 | 生物-α-兔 | 1: 2,000 | − |
| α-AQP-4（西格玛） | 水通道蛋白4 | 1:250 | 无 | 生物-α-兔 | 1:2,000 | − |
| α-Col IV（Abcam） | 胶原蛋白IV | 随时可用 | 乙二胺四乙酸 pH=8.5，60分钟 | 生物-α-小鼠 | 1:500 | − |
| α-Cx30（Invitrogen） | 连接蛋白30 | 1: 5,000 | 乙二胺四乙酸 pH=9.0，60分钟 | 生物-α-兔 | 1:2,000 |
+
|
| α-Cx43（Invitrogen） | 连接蛋白43 | 1:5,000 | 乙二胺四乙酸 pH=9.0，60分钟 | 生物-α-兔 | 1:2,000 |
+
|
| α-C9neo（S.Piddelsden） | 补体因子9 | 1: 2,000 | 蛋白酶 （0.005%） | 生物-α-兔 | 1:2000比例 | − |
| α-ADG（Hycult Biotech） | α-dystrogycan | 1:500 | 乙二胺四乙酸 pH=9.0，60分钟 | 生物-α-小鼠 | 1:5,000 | − |
| 激光共焦扫描显微镜 |
| α-CNPase（亲和力） | 2′3′-环核苷酸3′磷酸二酯酶 | 1:500 | 乙二胺四乙酸 pH=8.5，60分钟 | 生物-α-小鼠 | 1:500 | |
| α-Col IV（Abcam） | 胶原蛋白IV | 随时可用 | 蛋白酶 (0.005%) | 生物-α-小鼠 | 1:500 | |
| α-GFAP（新标记物） | 胶质纤维酸性蛋白 | 1:100 | 乙二胺四乙酸 pH=8.5，60分钟 | Cy2-α-小鼠 | 1:200 | |
| α-AQP-4（西格玛） | 水通道蛋白4 | 1:100 | 无 | 生物-α-兔 | 1:200 | |
| α-Cx43（Invitrogen） | 连接蛋白43 | 1:2,000 | 乙二胺四乙酸 pH=9.0，60分钟 | 生物-α-兔 | 1:200 | |
| α-Cx30（Invitrogen） | 连接蛋白30 | 1: 2,000 | 乙二胺四乙酸 pH=9.0，60分钟 | 生物-α-兔 | 1:200 | |
| α-DG（2.08）（Hycult生物技术公司） | α-dystrogycan | 1:250 | 乙二胺四乙酸 pH=9.0，60分钟 | 生物-α-小鼠 | 1:500 | |
激光共焦扫描显微镜
连续切片分析EAE和LPS模型中IV型胶原（col IV）沉积区域和星形细胞标记物丢失区域。如前所述，对人和大鼠的3-5μm厚石蜡切片进行荧光免疫组化，几乎没有修改。如上所述将切片脱蜡，用甲醇中的过氧化氢处理以阻断内源性过氧化物酶，并在DAKO稀释剂中培养20分钟以阻断非特异性抗体反应。对于共焦荧光双重标记，使用小鼠单克隆抗体或兔多克隆抗体显示胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫反应性。作为第二个标记物，我们应用了小鼠单克隆α-col IV、抗α-肌营养不良多糖抗体、多克隆α-连接蛋白43或α-AQP-4抗体。
第二天，用PBS清洗玻片两次。然后，在室温下同时应用荧光结合或生物素化二级抗体1小时。当二级抗体被生物素化时，通过在室温黑暗中应用链霉亲和素Cy2/Cy3复合物（Jackson ImmunoResearch，1:75）1小时完成标记。使用凝胶/凝胶将载玻片与盖玻片安装在一起。玻片干燥后（4°C下24小时后），通过共焦显微镜进行分析。使用Leica TCS SP5 LASAF显微镜（Leica microsystems，CMS-GmbH，德国），配备一台氩离子激光器（488 nm激发）和两台HeNe激光器（543和633 nm激发）。在绿色（Cy2）和红色（Cy3）通道中同时采集荧光信号。
定量分析
在LFB或免疫细胞化学染色的切片上，分别对脱髓鞘、GFAP阳性星形胶质细胞密度和脊髓横截面内星形胶质细胞抗原的表达进行定量分析。切片上覆盖有形态计量网格，通过计算相应区域上的网格点，手动确定髓磷脂丢失和星形细胞抗原丢失的区域。此外，我们还测定了CNS实质内细胞外IV型胶原（col IV）沉积的面积、胞质表达col IV的星形胶质细胞的数量以及基底层分裂的血管数量。在EAE和LPS模型中，使用1mm的显微视野，通过连续切片分析col IV沉积区域和星形细胞标记物丢失区域2所有值均表示为每毫米的细胞计数和/或面积2.
脂多糖对小胶质细胞和星形胶质细胞作用的表征
作为小胶质细胞和星形胶质细胞来源的混合胶质细胞培养物的生产
处死0-24小时大的Lewis大鼠，解剖其大脑并转移至RPMI 1640/10%胎牛血清（FCS）。脑膜剥离后，轻轻用吸管将大脑机械分离。将得到的单细胞悬浮液在聚乙烯中培养5-7天-我-赖氨酸涂层培养瓶，使用RPMI1650/10%FCS，每隔一天更换培养基。在这段时间后，混合胶质细胞培养物由单层星形胶质细胞和成纤维细胞组成。在单层的顶部，发现了松散粘附的分支小胶质细胞和胶质祖细胞。
小胶质细胞培养
将融合的混合胶质培养物搅拌12–15 h（180 rpm，37°C）。将上清液离心（1400 rpm，RT）。然后，将细胞颗粒重新悬浮在RPMI 10%FBS中，接种到无涂层的培养皿中，并在37°C、5%CO下培养10分钟2在这个潜伏期内，只有小胶质细胞粘附在培养皿的地板上，而其他污染细胞（主要是胶质祖细胞）仍留在上清液中。去除上清液，在室温下用PBS清洗粘附的小胶质细胞2-3次。这些小胶质细胞培养物的纯度约为99%。
富含星形胶质细胞的文化
将汇合的混合神经胶质培养物搅拌12-15小时（180 rpm，37°C）。然后，丢弃上清液，用PBS冲洗粘附牢固的细胞（主要是星形胶质细胞和成纤维细胞-我-赖氨酸涂层盖玻片，并在治疗前在RPMI 1640/10%FCS中额外培养1-2天。基于GFAP染色，这些培养物中约75%的细胞是星形胶质细胞。
刺激富含星形胶质细胞的文化
对于处理，将每个盖玻片转移到12孔板的单独孔中并倒置。小点的石蜡用作盖玻片细胞层和12孔板底部之间的间隔物。盖玻片上生长的星形胶质细胞要么未经处理作为对照（1），接受LPS（100 ng/ml）12 h（2），要么与生长在平板底部的小胶质细胞（星形胶质细胞与小胶质细胞的比例为1:1）在没有（3）或有（4）LPS（100ng/ml）的情况下共同培养12 h。然后，用PBS清洗盖玻片两次，并用于免疫细胞化学分析。
免疫细胞化学分析
将差异处理的细胞用4%PFA固定15分钟（室温），用0.05 M Tris缓冲盐水（TBS）（pH 7.4）洗涤，并在室温下用含有0.5%Triton、5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma）和5%驴血清（西格玛）的TBS渗透30分钟。然后用TBS清洗细胞两次，并在4°C下用商用兔抗AQP-4抗体和小鼠抗GFAP抗体（均在TBS/1%驴血清中稀释1:100）孵育过夜。然后，用TBS清洗细胞三次，并在室温下用驴抗兔Cy3（Jackson Immunor Research Laboratories，West Grove，PA，USA）孵育1小时，以观察AQP-4（红色）和驴抗鼠Cy2（Jackson-Imunor Research Laboritories）以鉴定星形胶质细胞GFAP（绿色）（均以1:100稀释于TBS/1%驴血清中）。细胞用TBS清洗，并用没食子酸盐/凝胶醇固定。
统计分析
定量数据通过非参数检验进行统计评估。描述性分析包括平均值和标准误差。由于样本量和数据的可变性，我们使用了非参数组检验（Kruskal–Wallis）。使用SPSS 14.0统计软件系统（SPSS Inc.，芝加哥）进行计算。
结果
NMO患者源性循环AQP-4抗体扩增的T细胞介导的自身免疫性脑脊髓炎的星形胶质细胞病理学
如前所述[7]AQP-4的深度丢失和星形胶质细胞损伤是T细胞介导的EAE动物中枢神经系统损伤中最早的病理改变，这些动物接受了来自NMO患者的含有免疫球蛋白的AQP-2抗体的额外全身注射（表). 抗体注射后的一天，AQP-4严重缺失（图b） 并且可以看到GFAP（图c） 在没有脱髓鞘的情况下（图a） ●●●●。这与血管周围神经胶质界限蛋白的主要紊乱有关，如α-dystroglycan（ADG）染色切片所示（图d） 而血管基底膜仅在炎症区域出现一些分裂（图n） ●●●●。这些病变中的星形胶质细胞病理学与免疫球蛋白和补体沉积有关（图h） ●●●●。在主动诱导EAE的动物中注射含有免疫球蛋白的AQP-4抗体三天后，出现了类似的星形胶质细胞改变（图f–h），但此时病灶内出现脱髓鞘。这些数据表明，在NMO的实验模型中，特异性抗体反应针对星形胶质细胞抗原AQP-4，脱髓鞘发生在星形胶质细胞损伤之后。在接受对照免疫球蛋白的T细胞介导的EAE大鼠中，没有类似的星形胶质细胞改变和脱髓鞘（表; 图i–l，o–p）。
自体免疫性脑脊髓炎不同实验模型中的星形胶质细胞病理学和脱髓鞘：在病变的连续切片上对不同标记物进行免疫细胞化学。T细胞介导的EAE与含水通道蛋白4抗体的人免疫球蛋白联合转移。抗体转移后24小时，没有脱髓鞘（Luxol快速蓝染色一)，水通道蛋白损失4(b条)、GFAP(c（c）)和α-失调聚糖(d日)在病灶中。抗体转移后72小时，水通道蛋白4的损失(（f）)和GFAP(克)与局灶性脱髓鞘有关（卢克索固蓝染色e（电子）)补体C9neo抗原的沉积(小时). T细胞介导的EAE与对照免疫球蛋白的联合转移。无脱髓鞘（Luxol固蓝染色我)，水通道蛋白4无损失(j个)GFAP公司(k个)或α-dystroglycan(我). 抗体转移24小时后，T细胞介导EAE与含水通道蛋白4抗体的人免疫球蛋白共转移。米连接蛋白43免疫反应性在水通道蛋白4丢失的区域丢失（见图1b）。n个IV型胶原蛋白染色显示炎症血管中基底膜出现一些分裂。T细胞介导的EAE与对照免疫球蛋白联合转移；未见连接蛋白43缺失(o个); IV型胶原染色显示炎症血管的基底膜发生了一些分裂(第页). T细胞介导的EAE与抗MOG抗体的联合转移。血管周围脱髓鞘（勒克索固蓝染色问)，但水通道蛋白4表达无变化(第页)无GFAP损失(秒). 然而，与邻近的正常白质相比，病变内连接蛋白43的免疫反应性显著降低(t吨). 这个插入显示与胶质细胞表面相关的点状连接蛋白43反应性(正确的)在病变处消失(左边).酒吧100微米
表3
| 脱髓鞘（mm−2) | AQP-4损失（mm−2) | GFAP损失（mm−2) | C9neo沉积（mm−2) | 细胞外Col IV沉积（mm−2) | 分裂血管数（mm−2) |
|---|
| LPS时间进程 |
| 液化石油气储罐 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 0 |
| LPSd1号机组 | 0 | 0.06±0.01 | 0 | − | 0 | 0 |
| LPSd3号机组 | 0 | 0.05 ± 0.01 | 0 | − | 0 | 0.5±0.3 |
| LPSd5型 | 0.06±0.02 | 0.12 ± 0.02 | 0.023 ± 0.01 | − | 0.01 ± 0.01 | 1.3 ± 0.8 |
| LPSd8型 | 0.16 ± 0.02 | 0.2 ± 0.02 | 0.07 ± 0.01 | − | 0.06 ± 0.01 | 2.8 ± 0.5 |
| LPSd12 | 0.51 ± 0.02 | 0.24 ± 0.02 | 0.15 ± 0.02 | − | 0.11 ± 0.01 | 7.5 ± 1.8 |
| LPSd15 | 0.29 ± 0.01 | 0.33 ± 0.01 | 0.16 ± 0.02 | − | 0.15 ± 0.01 | 9.8 ± 3.8 |
| 盐分 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 0 |
| EAE时间进程 |
| EAEd0（欧洲编辑0） | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 0 |
| 欧洲教育部3 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 0.43 ± 0.3 |
| EAEd6版 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 6.6 ± 1 |
| EAEd9版 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 5.14 ± 0.6 |
| EAEd12版 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 1.9±0.5 |
| EAEd15版 | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 0.14 ± 0.1 |
| EAE+MOG（d1） | 0.09 ± 0.03 | 0 | 0 | +++ | 0 | 0 |
| EAE+NMO（d1） | 0.028 ± 0.005 | 0.57 ± 0.11 | 0.25 ± 0.1 | +++ | 0 | 0 |
| EAE+C Ig（d1） | 0 | 0 | 0 | − | 0 | 0 |
作为额外的对照，我们使用了动物的脊髓切片，其中EAE是由MBP特异性T细胞和针对MOG的脱髓鞘抗体诱导的。在这些动物中，注射抗体24小时后，血管周围已出现深度脱髓鞘。然而，没有出现与实验NMO模型相比的星形胶质细胞病理学（图q–s）。
LPS模型中星形胶质细胞AQP-4的早期丢失
将生理盐水局部注射到脊髓白质中不会引起脱髓鞘或星形胶质细胞损伤（图a–d）。通过研究LPS模型中病变发展的时间进程，我们发现注射部位的AQP-4免疫反应性在LPS注射后的第一天就已经丧失，并且AQP-3的丧失程度随着时间的推移而增加（表; 图e–l）。在LPS注射后的早期阶段，GFAP阳性星形胶质细胞仍表现正常（图克，)，但已经观察到星形细胞突起的回缩（图a、，). 在注射LPS后的后期，观察到星形胶质细胞数量减少（图k） ●●●●。同样，第5天出现脱髓鞘和少突胶质细胞核变化的最早迹象，类似于凋亡，脱髓鞘损伤的大小随后增加，在注射LPS后12天达到峰值（图e、 i）。
脂多糖诱导脊髓损伤的星形胶质细胞病理学和脱髓鞘：一–d日在脊髓白质内注射生理盐水的动物中，未见星形胶质细胞病理改变和脱髓鞘。注射LPS后3天，没有脱髓鞘（Luxol固蓝染色e（电子）); 水通道蛋白4染色减少(（f）)，但星形胶质细胞仍然保存着(克). 相反，血管神经胶质界区的α-dystroglycan反应性严重丧失(小时). 注射LPS后第12天，可以看到局部脱髓鞘斑块（Luxol固蓝染色(我)与水通道蛋白4完全丧失有关(j个)和α-dystroglycan反应(我)星形胶质细胞及其过程的显著减少(k个). 在LPS病变中，连接蛋白30免疫反应随着时间的推移逐渐消失(n个–第页)与盐水注射动物的比较(米).问–t吨连接蛋白43的免疫反应性与连接蛋白30的免疫反应性相似。u个–xLPS病变显示，随着时间的推移，脊髓细胞外间隙中的IV型胶原沉积量增加。酒吧100微米
共焦激光显微镜观察GFAP和其他标记物的免疫细胞化学双重染色。第一列正常白质，第二列注射LPS后第3天，第三列注射LPS后12天，病灶边缘，第四列注射LPS后12天，病变中心。与对照组白质相比，注射LPS后星形胶质细胞及其过程随着时间的推移逐渐消失。与图共聚焦显微镜在注射LPS后第3天显示出更明显的变化，这是由于光学截面厚度非常薄，并且该技术的分辨率更高。请注意，在w个和x大多数剩余的星形胶质细胞胞浆内显示胶原4免疫反应性(黄色)表明该抗原在星形胶质细胞内合成。一–e（电子）,克–j个,n个–第页,u个–x
酒吧25微米。（f）,k个,我,米,问–t吨
酒吧10微米
AQP-4的缺失与胶质细胞界限的结构紊乱有关
AQP-4集中于胶质界区的星形细胞足突，实验性NMO损伤中AQP-2的丢失与胶质界区血管周围星形细胞足突起的收缩或破坏同时发生。为了分析LPS注射后是否也出现这种情况，我们使用了两种标记物来分析胶质细胞界限蛋白的结构组织：ADG和col IV。在LPS损伤中，ADG反应性胶质终末足与AQP-4的丢失平行丢失（图h、 我，e–l）。Col IV存在于大脑内皮细胞和神经胶质终末足的基底膜中，但在CNS实质的细胞外间隙中未发现Col IV（图n） ●●●●。然而，LPS病变中血管周围胶质细胞界限的损伤导致脊髓组织细胞外基质中出现col IV，这在反应性星形胶质细胞胞体周围更为突出（图v–x，v–x）。此外，在星形胶质细胞的细胞质中也观察到col IV免疫反应，表明其在细胞内合成（图w、 x）。在注射盐水的对照动物中，未观察到ADG或col IV表达的改变（图d、 u、，i、 u）。
代谢连接星形胶质细胞和少突胶质细胞的分子在原发性星形胶质细胞或少突胶质细胞损伤的病变中丢失
由于LPS和NMO模型中的脱髓鞘遵循星形胶质细胞功能障碍，我们分析了在少突胶质细胞稳态中起作用的其他星形胶质细胞分子。中枢神经系统中的少突胶质细胞通过异型缝隙连接与星形胶质细胞相连，异型缝隙接头由少突胶质中的连接蛋白32（Cx32）和连接蛋白47（Cx47）组成，星形胶质细胞中的连接素30（Cx30）和连接素43（Cx43）组成，Cx32/Cx30和Cx47/Cx43作为偶联伙伴[22,30]. 这些间隙连接允许在星形胶质细胞和少突胶质细胞之间运输代谢物和离子[三,36]. 在LPS病变中，Cx30和Cx43的表达均显著降低（图m–t）以及实验性NMO损伤（图m） ●●●●。LPS模型中Cx 43和30损失的时间过程与上述AQP-4的时间过程密切相关。然而，有趣的是，在抗MOG抗体诱导的原发性脱髓鞘损伤中也观察到类似的Cx30和43免疫反应性丢失（图t） ●●●●。
小胶质细胞是LPS的主要靶细胞
LPS由toll样受体4（TLR4）识别，TLR4与分化簇14（CD14）蛋白协同作用。体内星形胶质细胞不表达这些分子[9]. 然而，与此形成鲜明对比的是，体内小胶质细胞容易同时表达TLR4和CD14[32]. 因此，注射到背索后LPS对星形胶质细胞的影响似乎是由小胶质细胞衍生因子驱动的。因此，在接下来的一组实验中，我们将星形胶质细胞与小胶质细胞共培养，分别进行LPS治疗和不进行LPS处理，并分析星形胶质细胞形态学和AQP-4表达的变化。正常情况下，星形胶质细胞培养物是原生质细胞和星状细胞的混合物（图a、 e）。AQP-4在星形细胞上的表达很弱，而在原生质型星形细胞上表达更强烈。在这两种情况下，AQP-4反应性均匀分布在星形胶质细胞的细胞膜上，在膜皱褶上有一些加重（图i、 m，q）。在用LPS富集星形胶质细胞培养物暴露24小时后，这张图片没有改变（图j、 n，r）。然而，在与小胶质细胞共同培养后，许多星形胶质细胞获得了以细胞突起收缩为特征的反应性表型（图c、 g）。星状星形胶质细胞的观察频率较低，具有圆形外观的星形胶质细胞数量增加。虽然AQP-4反应性仍然分布在整个星形细胞表面，但AQP-2分子的聚集很容易检测到，这强烈暗示了AQP-3通过内吞作用内化（图k、 o，s）[17]. 体外小胶质细胞对星形胶质细胞的影响可以很容易地解释，因为这些小胶质细胞具有激活的表型，即使没有额外的刺激。然而，当LPS被添加到小胶质细胞-星形胶质细胞共培养物中时，星形胶质细胞形态和AQP-4反应性的变化变得更加明显：培养物中几乎完全没有星形胶质细胞，反应性和聚集性星形胶质细胞的数量增加（图d、 h），AQP-4活性的聚集体检测频率更高（图p、 t）。
与活化的小胶质细胞共同培养对体外星形胶质细胞形态和水通道蛋白4表达的影响。一–小时GFAP免疫反应显示的形态学变化(绿色). 在没有LPS的情况下在没有小胶质细胞的情况下孵育的星形胶质细胞培养物(一放大倍数更高e（电子）)以及在100ng/ml LPS存在下(b条放大倍数更高（f）)包含原生质和星状星形胶质细胞。与小胶质细胞孵育后，具有大细胞突起的星形胶质细胞数量减少，星形胶质细胞开始聚集(c（c）放大倍数更高克). 在存在100 ng/ml LPS的情况下，星形胶质细胞与小胶质细胞孵育时，这一过程更为明显(d日放大倍数更高小时).我–t吨水通道蛋白4表达的变化。星形胶质细胞用GFAP双重染色(绿色
我–我，覆盖问–t吨)和AQP-4(红色
米–第页，覆盖问–t吨). 在没有小胶质细胞的情况下培养的星形胶质细胞(我,米,问)或存在100 ng/ml LPS(j个,n个,第页)，显示AQP-4的均匀点状染色模式，在膜皱褶和细胞过程中更为突出。在小胶质细胞存在下培养的星形胶质细胞(k个,o个,秒)细胞表面也有点状AQP-4免疫反应。然而，除此之外，大量星形胶质细胞也显示囊泡状AQP-4聚集体。在含有100 ng/ml LPS的情况下，与小胶质细胞一起培养的星形胶质细胞中也可以看到这种情况(我,第页,t吨). 所示数据代表了两个独立执行的实验。酒吧100微米
暴发性疾病加重的多发性硬化症患者的病变中可见星形胶质细胞病理学
在确定星形胶质细胞功能障碍和损伤可能是先天免疫引发的炎性脱髓鞘病变发病机制中的重要组成部分后，我们分析了是否在MS患者的病变中也可以看到类似的星形胶质细胞变化。我们筛选了MS尸检，其中包括死于急性MS或复发复发MS的患者（II型和III型病例，表[24])或继发进行性或原发进行性MS，并对病变进行研究，寻找星形胶质细胞界限蛋白紊乱的证据。为此，我们使用了AQP-4、ADG、col IV和GFAP的抗体。如前所述，MS病变分为典型活动性病变、缓慢扩张性病变或非活动性病变[12]. 在大多数MS病变中，无论活动或疾病分期如何，我们都没有看到血管周围神经胶质界限破坏的证据（图h–m）。仅在主要发生III型脱髓鞘后的一部分活动性病变中[24]急性MS或慢性MS暴发性发作患者出现的血管周围星形细胞足突缺失与实质细胞外间隙中的col IV沉积有关（图a–g）。此外，col IV在高反应性星形胶质细胞的细胞质中也有表达，反应性星形细胞胞体和突起的细胞外表面上存在沉淀的col IV沉积，以及AQP-4的大量表面表达（图d、 f、g）。在II型和III型脱髓鞘后的活动性病变中，基底膜裂开，反映了炎症引起的血管周围间隙的扩大（表).
表4
| MS P三 | 毫秒P II | PGR质谱 |
|---|
| 脱髓鞘 | +++ | +++ | +++ |
| AQP-4损失 | +++（帕奇） | − | − |
| 神经胶质界限紊乱 | +++ | ± | − |
| col IV在星形胶质细胞中的扩散反应性 | +++ | − | − |
| col IV阳性星形胶质细胞数量（mm−2) | 1.55 ± 0.7 | 0.09 ± 0.03 | 0.06 ± 0.02 |
| 细胞外col IV沉积 | +++ | + | ++ |
| 劈开BV的数量（mm−2) | 1.72 ± 0.1 | 1.6 ± 0.1 | 0.1 ± 0.02 |
多发性硬化病变中的星形胶质细胞病理学：一–克Ⅲ型脱髓鞘后急性多发性硬化的暴发性活动性病变[21]. 髓鞘染色显示初始病变（I）为髓鞘苍白，晚期病变为完全脱髓鞘（DM）一). 在最初损伤的区域，细胞质中已经有巨噬细胞含有髓磷脂降解产物(b条). 在病变内部，GFAP大量表达，但血管周围的神经胶质界限被破坏(c（c）). 水通道蛋白4染色显示免疫反应性斑片状丧失，大量高度反应的原生质星形胶质细胞表面具有强烈的水通道蛋白4免疫反应性(d日
插入). α-Dystroglycan免疫反应仅存在于某些血管的胶质界限上，且表达强度不均匀且较弱(e（电子）). 反应性星形胶质细胞的细胞质中可见IV型胶原免疫反应，这些细胞失去了形成胶质界限的突起(（f）,克). 此外，反应性星形胶质细胞表面有大量IV型胶原沉淀(克).小时–n个II型脱髓鞘后慢性扩张病变中的星形胶质细胞[24]. 具有早期髓鞘降解产物的巨噬细胞宽边缘的活动性病变边缘(小时,我). 在这些病变中，可见深部星形胶质细胞胶质增生，胶质细胞界限仍保留在GFAP染色的病变中(j个). 水通道蛋白4在巨噬细胞之间的星形胶质细胞上密集表达，含有髓磷脂碎片(k个). 正常白质中α-Dystroglycan的表达(我)在病变内部(米)显示了胶质细胞界限的类似表达模式。IV型胶原染色显示病变内血管基底膜深度分裂，但星形胶质细胞无免疫反应，实质内无胶原沉积(n个).酒吧100微米；（f）
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讨论
我们目前的研究表明，在两种发病机制完全不同的炎症性脱髓鞘实验模型中，星形胶质细胞功能障碍先于脱髓鞘。在NMO损伤中，特异性自身抗体以星形细胞膜蛋白AQP-4为靶点，通过激活补体、抗体依赖性细胞毒性机制或这两种机制的混合，破坏星形细胞[6,7]. 在LPS模型中，抗AQP-4的自身抗体不起作用。在正常大鼠中未发现针对AQP-4的自身抗体[7]LPS注射和皮损内出现AQP-4丢失之间的时间（1天）太短，无法诱导自身抗体反应。此外，我们在病灶中没有发现免疫球蛋白和补体沉积。相反，我们发现LPS激活的小胶质细胞上清液可以在体外诱导星形胶质细胞营养不良。据描述，LPS激活的小胶质细胞产生大量分子，其中包括白细胞介素-1、肿瘤坏死因子-α和一氧化氮，这些分子可以在体外损害星形胶质细胞的功能[33]. 尽管诱导星形胶质细胞营养不良的模式完全不同，但其对星形胶质细胞功能和体内损伤形成的影响基本相似。在这两种情况下，血管周围神经胶质界限处的星形细胞足突首先受到严重影响。这反映在ADG的丢失，ADG是一种重要的锚定蛋白，将星形胶质细胞过程与血管周围空间的细胞外基质分子联系起来，也参与了胶质细胞界限处的AQP-4聚集。众所周知，在EAE中，ADG在白细胞外渗部位的薄壁基底膜上选择性裂解[2]. 然而，在简单的EAE模型中，这种分裂似乎并不意味着病变中ADG反应性的完全丧失。Col IV也至少在一定程度上是血管周围神经胶质界限完整性的标志。它也由星形胶质细胞产生，在正常情况下以极化方式沉积在胶质细胞界限的星形细胞表面。我们在这里显示，col IV在反应性星形胶质细胞的细胞质中表达，并在胶质细胞界限结构受损时分泌到中枢神经系统组织的薄壁细胞外间隙。此外，它修饰病变内反应性星形胶质细胞的表面，这可能进一步干扰星形胶质细胞功能。
我们实验中观察到的事件的时间进程表明，在NMO和LPS病变中，脱髓鞘可能是星形细胞功能障碍的继发后果。这可能反映了几种不同的潜在机制。星形胶质细胞功能障碍可能损害血脑屏障功能，导致血管周围纤维蛋白沉淀。沉淀的纤维蛋白在LPS损伤脱髓鞘开始时存在[26]已知在炎症条件下是小胶质细胞激活的额外触发因素[1]. 此外，我们还测试了可能部分参与少突胶质细胞损伤的分子的表达。Cx30和Cx43在星形胶质细胞和少突胶质细胞之间形成异质性缝隙连接[30]，被认为对维持少突胶质细胞正常功能的离子、渗透水和代谢物的输送、清除和一般流动起着至关重要的作用[16]. 当这种连接中断时，少突胶质细胞可能会经历能量剥夺状态。先前报道的少突胶质细胞损伤的替代候选物是兴奋性氨基酸转运体EAAT2[38
15]. 它在星形胶质细胞中表达，参与谷氨酸从细胞外间隙的清除，因此有助于细胞外谷氨酸稳态。因为少突胶质细胞对谷氨酸受体介导的损伤敏感[27]细胞外谷氨酸缓冲减少可能参与少突胶质细胞变性和脱髓鞘。先前从体外数据得出结论，这种机制可能对NMO脱髓鞘的发病机制很重要。
早期的研究也观察到星形胶质细胞损伤与脱髓鞘之间的联系。例如，消融星形胶质细胞导致脊髓损伤后严重脱髓鞘和神经元以及少突胶质细胞死亡[10]EAE中炎症和组织损伤的扩散加剧[37]. 当信号转导子和转录激活子3（STAT3）阳性星形胶质细胞被选择性杀死时，也得到了类似的结果[14]. 此外，前脑刺伤后GFAP阳性星形胶质细胞的耗竭导致大量神经元变性，而慢性谷氨酸受体阻断可减轻这种变性[8]; 最后，将人类补体和NMO IgG注射到小鼠大脑后，还观察到星形胶质细胞原发性丢失，随后出现广泛脱髓鞘[35].
虽然NMO患者的病变中有大量星形胶质细胞的严重结构损伤，但MS病变中星形胶质细胞潜在的病理改变尚未引起重视。反应性原生质神经胶质增生症和纤维胶质增生症在活动性和慢性多发性硬化病变中有很好的描述[19]. 在这里，我们表明，至少在MS病变的一个子集中存在星形胶质细胞变化，这些变化与NMO和LPS病变中的变化相似。然而，MS和NMO病变之间存在重大差异。在NMO病变中，星形胶质细胞被广泛破坏，导致大片区域缺乏星形胶质细胞[28]. 相比之下，MS星形胶质细胞病理主要影响细胞进程，星形胶质细胞的破坏或丢失较小。这些变化的功能意义目前尚不清楚，但与NMO类似，可以推测它们也可能参与髓磷脂和少突胶质细胞损伤的发病机制。有趣的是，我们在研究中主要发现星形胶质细胞营养不良的暴发性III型病变显示T细胞浸润程度很低[4,13,26]在许多方面与脊髓局部注射LPS引起的损伤相似[11,26]. 因此，以前有人认为，在这些病变中，先天免疫可能起着显著的致病作用。
最后，我们目前的观察结果对诊断神经病理学有影响。NMO的诊断基于循环AQP-4自身抗体的检测[20,21]. 然而，有一部分患者在不同队列中存在差异，AQP-4测试为阴性。我们在这里展示了星形细胞损伤和AQP-4丢失的另一种机制，它不依赖于AQP-2自身抗体的存在。此外，当神经病学家面临疑似NMO的尸检或活检标本时，通常无法获得AQP-4自身抗体滴度。目前，免疫细胞化学检测病变中AQP-4的丢失被视为NMO病变的一个很好的诊断标志。根据我们目前的结果，这一假设必须加以限定。与AQP-4抗体驱动的NMO相比，在免疫发病机制完全不同的病变中可以看到AQP-2的丢失。然而，与NMO病变相比[28,34]AQP-4的缺失是片状的，与反应性星形胶质细胞细胞表面该分子的过度表达有关。此外，与NMO病变相比，星形胶质细胞的完全丢失和破坏较小[25,28,34]免疫球蛋白和补体在星形胶质细胞损伤部位没有特异性沉积。
致谢
我们感谢Ulrike Köck、Angela Kury和Marianne Leiser提供的专家技术援助。本研究由博士项目“健康与疾病中的细胞通信”（CCHD）资助，由奥地利科学基金会和维也纳医科大学共同资助，由澳大利亚科学基金会（FWF，项目P19854-B02 to HL和P21581-B09 to MB）资助，欧洲联盟（LSHM-CT-2005-018637）资助，英国MRC to KJS资助，GB和NI的多发性硬化学会对KJS，以及KJS的大脑研究信托。
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