临床癌症研究。作者手稿；PMC 2011年1月15日发布。
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应用蛋白质组学和基因组学分析新辅助紫杉醇和放射治疗患者乳腺癌紫杉烷敏感性标记物
,1 ,2 ,1 ,三 ,1 ,4 ,4 ,5 ,5 ,5 ,5 ,1 ,2 ,三 ,4 ,6 ,7 ,1和1
约书亚·A·鲍尔
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心范德比尔德-英格拉姆癌症中心生物化学系
A.Bapsi脉轮变性
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詹妮弗·罗森布鲁思
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戴明·米
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艾琳·H·西利
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奈拉·德马托斯·格兰贾·因格拉姆
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玛丽亚·奥利瓦雷斯
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马克·凯利
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英格丽德·梅耶尔
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英格丽德·梅佐利
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朱莉·梅恩斯·鲍威尔
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金伯利·N·约翰逊
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蔡卓忠
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格雷戈里·艾尔斯
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梅琳达·E·桑德斯
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理查德·卡普里奥利
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詹妮弗·彼得波尔
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6纽约大学微生物系，纽约，纽约
7纽约大学放射肿瘤学系
通讯作者：Jennifer A.Pietenpol，Vanderbilt-Ingram癌症中心，652 Preston Research Building，Nashville，TN 37232。电话：615-936-1512；传真：615-936-2294；ude.tlibrednav@lopneteip.j - 补充资料
补充数据。
GUID:AFDD28BF-7F1A-4CBC-9617-8204A865A90C
摘要
目的
为了确定新辅助紫杉醇/放射治疗的病理反应的分子标记，对预处理活检进行了蛋白质和基因表达谱分析。
实验设计
高危、可手术乳腺癌患者接受三个周期的紫杉醇治疗，然后同时接受紫杉醇/放射治疗。在这项研究的38名患者中，有19名患者从预处理活检中获得肿瘤组织。对获得病理完全应答（pCR）的患者活检的连续切片进行蛋白质和基因表达谱分析，并与残留疾病非CR（NR）患者进行比较。
结果
蛋白质组学和验证免疫组织化学分析显示，pCR患者肿瘤中α-防御素（DEFA）过度表达。基因表达分析显示，MAP2是一种微管相关蛋白，在获得pCR的患者中具有显著较高的表达水平。乳腺癌细胞系中MAP2的升高导致紫杉醇敏感性增加。此外，与碱性、三阴性表型相关的基因表达在pCR患者的肿瘤中丰富。对接受术前分类基础治疗的患者的更大肿瘤组的分析表明，DEFA和MAP2的表达以及炎症的组织学特征都与手术时的治疗反应有关。
结论
我们展示了预处理活检的分子剖析用于发现反应标记的实用性。我们的研究结果表明，DEFA和MAP2（一种微管相关蛋白）等免疫信号分子有可能被用作与新辅助紫杉烷治疗反应相关的肿瘤标志物。
新辅助（术前）化疗广泛用于治疗局部晚期乳腺癌患者(1–三). 除了允许更高的乳房保护率外(1,2)，它允许使用病理反应数据作为长期临床结果的早期替代标记(4,5).
紫杉醇（紫杉醇和多西紫杉醇）是有效的抗微管药物，是治疗乳腺癌的有效方法(6,7). 虽然单剂紫杉烷的病理完全缓解率（pCR）仅为5%至15%(8–10)基于紫杉醇的联合治疗使pCR率提高了8%至31%，具体取决于联合治疗(11–14). 预处理活检的基因表达谱已经产生了基因特征，可以使用独立的验证集以不同的准确度（78–92%）预测新辅助疗法的疗效(11,13,14). 一些特征与单独使用临床参数获得的特征一样好或更好[肿瘤大小、淋巴结状态、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、HER2等；参考文献。15]. 然而，基因签名在临床试验或治疗设计中的使用受到了限制。因此，识别新佐剂反应的预测性标记物仍然是一个重要目标。
几项研究表明紫杉烷是有效的放射增敏剂(16–18). 我们和其他人已经发现，在以紫杉醇为基础的新辅助治疗中增加放射治疗可以提高高危、可手术乳腺癌患者的pCR率（30-35%）(17,19). 尽管有这些提高的应答率，但这种新佐剂组合的应答分子标记尚不清楚。因此，我们使用蛋白质组和基因组技术来分析预处理活检，以确定新辅助紫杉醇/放射治疗反应的标记。组织学定向矩阵辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）可用于鉴别pCR和非CR（NR）患者肿瘤活检中差异表达的肽。同时，基因表达阵列用于识别差异表达基因。
材料和方法
患者和新辅助治疗
患有高危（IIA-IIB期）可手术乳腺癌的妇女接受三个周期的紫杉醇（175 mg/m2每3周），然后每周两次紫杉醇（30 mg/m2)和同时辐射。患者在完成放化疗后接受最终手术(19). 组织样本取自范德比尔特大学或纽约大学医学中心接受机构审查委员会批准治疗的个人。所有患者均签署了协议专用同意书。如前文所述，由乳腺病理学家对治疗前核心活检进行ER、PR和HER2分析和评分(19). 荧光证实HER2扩增就地免疫组化评分为2+时进行杂交。pCR被定义为没有任何浸润性癌，NR被定义为乳腺或淋巴结中任何活的肿瘤（部分反应）或进展性疾病。乳腺病理学家在手术时从主要病理切片中测定pCR和NR。存活患者的中位随访时间为51个月（范围40-73个月）。
组织学导向的MALDI-MS和蛋白质组数据分析
对于MALDI-MS分析，每个冰冻活检的连续切片进行H&E染色或解冻安装，并固定在MALDI板上。乳腺病理学家对H&E染色切片的显微照片进行注释，以标记肿瘤和基质感兴趣的区域（约200μm，至少10个点），以进行基质斑点定位。避免所有正常、发育不良或坏死组织、炎症区域、潜在污染（如血液）和肿瘤切片边缘。将带注释的H&E图像与MALDI平板图像叠加，以提取机器人定位的坐标。声学机器人观测仪（LabCyte）在每个组织上放置结晶基质（20 mg/mL芥子酸，1:1乙腈/0.2%三氟乙酸）斑点（直径180–220μm）。如前所述，使用Autoflex II（Bruker Daltonics）MALDI质谱仪采集组织轮廓光谱，并使用针对2至40 kDa肽优化的自动线性模式采集方法进行运行(20). 实验在不同的日期重复进行，以解释实验变化。使用ProTS标记（Biodesix）对MALDI-MS光谱进行基线校正、归一化和比对。多光谱(n个≥10）取同一受试者不同肿瘤和基质实验的平均值。从13个NR和6个pCR活检中对数转换处理光谱中115个候选特征的峰值强度。采用微阵列显著性分析和线性混合效应模型（受试者内和受试者间变异性）确定NR和pCR样本之间的差异特征。排列测试(n个=10000）通过控制假发现率（FDR）来确定显著性（<0.05）。P（P）线性混合效应模型的数值（显著性<0.05）未经多重检验调整。使用这两种方法确定了感兴趣的差异特征。
MALDI-MS成像实验通过在组织表面涂覆基质进行，以100μm的空间分辨率在样品上的每个位置获取光谱，并将光谱文件重建为离子密度图像以供查看。
免疫组织化学
如前所述，对组织切片进行免疫组织化学处理(21). 简单地说，将石蜡包埋的乳房组织切片固定并在二甲苯中脱蜡。在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中通过微波载玻片实现抗原回收。将载玻片在1:1丙酮/甲醇溶液中渗透，清洗，并在3%过氧化氢中培养。使用Dako蛋白块（Dako）继续阻断。切片在25°C下用1:1000稀释的α-防御素（DEFA）抗体（AbD Serotec）孵育1小时，然后暴露于标记的链霉亲和素-生物素系统（Dako）。DEFA和MAP2免疫组织化学染色评分和炎症描述见补充材料和方法.
基因表达谱分析和数据分析
在38名患者中，14名患者有足够的组织（4名有pCR，10名有NR）来获得高质量的RNA。使用PixCell II激光捕获显微切割系统（Arcturus）将连续切片中的侵袭性肿瘤细胞捕获到聚合物帽上。导管癌区域就地排除正常乳腺组织，避免炎症区域。从捕获的细胞中分离总RNA，进行量化、完整性分析，并使用Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0阵列进行微阵列分析。22). 来自每个活检的重复RNA样本的数据(n个=28）被导入GeneSpring GX（版本10.0.2）软件（安捷伦）。探针水平分析采用鸟嘌呤胞苷稳健多阵列分析进行，包括背景校正、分位数归一化和探针汇总。探针组在重复样品中进行对数转换和平均。未配对的t吨该试验用于鉴定pCR和NR样本之间的基因差异表达。FDR多重测试t吨测试（Benjamini-Hochberg）用于生成校正P（P）每个探针的值(23). 生成热图以显示差异表达的探针。使用基于丰富的统计测试生成P（P）使用GeneSpring的基因本体类别的值。
细胞培养与细胞工程
如前所述，在补充有10%胎牛血清、10μg/mL胰岛素（MCF-7细胞）和1%青霉素-链霉素的DMEM中培养MCF-7和MDA-MB-468细胞(24). 所有细胞在37°C和5%CO下培养2。对于三维培养模型，如前所述，细胞接种在生长因子减少的Matrigel（BD Biosciences）上(25–27). 在细胞接种后24小时加入紫杉醇（Sigma-Aldrich），并每3天更换一次。将Mammspheres消化、胰蛋白酶化，并使用血细胞仪计数单细胞。
为了产生稳定的细胞系，地图2cDNA克隆到FG12慢病毒载体中。如前所述进行病毒生产和基因转导(28).
免疫印迹法
如前所述，使用稀释1:500的MAP2抗体（Lab Vision/NeoMarkers）和稀释1:1000的GAPDH抗体（Chemicon International；参考文献。21).
生物标记物分析与紫杉醇新佐剂患者
为了进行生物标记物分析，从接受以紫杉醇为基础的新辅助化疗的患者中获得64例预处理活检。患者被分为接受以紫杉醇为基础的新辅助治疗的患者，包括(一)紫杉醇/辐射(b条)单用剂量密集型多西他赛，或(c（c）)阿霉素/环磷酰胺，然后是紫杉醇。患者和治疗比较的临床变量（如年龄、ER/PR等）如所示补充表S1使用中位数和四分位数范围（第25至75百分位）总结免疫组织化学评分得出的MAP2表达加权指数。使用Spearman相关性估计变量之间的线性配对相关性。使用logistic回归估计了DEFA表达或炎症单位变化和MAP2表达四分位间变化的pCR几率。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
结果
新佐剂紫杉醇/辐射
高危、可手术乳腺癌患者接受三个周期的紫杉醇治疗，然后同时接受紫杉醇/放射治疗。此前，我们报道有丝分裂指数是术前治疗反应的重要预后指标（pCR=34%）(19). 在这项研究中，我们从同一患者队列中获得了足够的肿瘤组织，分别对19名和14名患者进行蛋白质组学和基因表达分析().
表1
| 患者编号。 | 急诊室 | 公共关系 | HER2型* | pH值CR | 结果 | 分析
|
|---|
| 蛋白质组学 | 微阵列 |
|---|
| 1 | + | + | − | 不 | 全轮驱动 | 是的 | 是的 |
| 2 | + | − | − | 不 | NED公司 | 是的 | 是的 |
| 三 | + | + | + | 不 | NED公司 | 是的 | 是的 |
| 4 | + | + | − | 不 | NED公司 | 是的 | 是的 |
| 5 | − | − | − | 不 | 全轮驱动 | 是的 | 是的 |
| 6 | − | − | − | 不 | 全轮驱动 | 是的 | 是的 |
| 7 | − | − | + | 不 | 国防部 | 是的 | 不 |
| 8 | + | − | − | 不 | 国防部 | 是的 | 是的 |
| 9 | − | − | + | 不 | 国防部 | 是的 | 是的 |
| 10 | + | + | − | 不 | 国防部 | 是的 | 是的 |
| 11 | − | − | + | 不 | 国防部 | 是的 | 不 |
| 12 | − | − | − | 不 | 国防部 | 是的 | 不 |
| 13 | − | − | + | 不 | 国防部 | 是的 | 是的 |
| 14 | − | − | + | 是的 | NED公司 | 是的 | 不 |
| 15 | − | − | − | 是的 | NED公司 | 是的 | 是的 |
| 16 | − | − | − | 是的 | NED公司 | 是的 | 是的 |
| 17 | − | − | − | 是的 | NED公司 | 是的 | 不 |
| 18 | − | − | − | 是的 | NED公司 | 是的 | 是的 |
| 19 | − | − | − | 是的 | NED公司 | 是的 | 是的 |
蛋白质组肿瘤图谱
我们进行了组织学导向的MALDI-MS，以确定38例患者中19例（6例pCR患者）对新佐剂紫杉醇/辐射反应的蛋白标记物，这些患者有足够的组织可用。该技术允许细胞特异性（200μm直径）和生成蛋白质谱以发现生物标记物(20). 收集每个注释肿瘤和基质区的MALDI-MS图谱，并对每个活检取平均值。使用两种统计方法（见材料和方法）比较6例pCR和13例NR患者的平均肿瘤光谱，以确定差异表达的特征（即每个患者的峰值强度米/z). 平均NR光谱强度被抵消(年=+400）以直观比较平均pCR光谱的差异(). 三大特点(米/z=3371、3442和3485）过度表达>30倍(P（P）<0.05)和四个功能(米/z=5677、6955、7007和15348）表达不足>2倍(P（P）<0.05）。基质剖面图中未观察到具有统计学意义的差异表达特征(n个=19）pCR和NR活检（数据未显示）。
pCR的平均肿瘤光谱(绿色)和NR(红色)来自MALDI-MS.Inset，差异表达米/zpCR相对于NR的峰值较高（#）或较低（*）。使用微阵列的显著性分析计算折叠变化。P（P）使用线性混合效应模型生成值。
三个最显著的峰值，米/z=3371、3442和3485()，之前分别被确定为α-DEFA1、α-DEFA2和α-DEFA3(29–31). DEFAs是一个参与吞噬细胞介导的宿主防御的杀菌和细胞毒性肽家族，富含中性粒细胞颗粒(32). 消除DEFA肽作为活检材料中污染血液的伪制品存在的可能性(33)，我们首先评估了肿瘤标本中是否存在组蛋白H4肽，这在有核细胞中非常丰富(; 峰值米/z=11307和11349）。更重要的是，我们的肿瘤MALDI光谱缺少血红蛋白峰值(米/z=7564和7835或15127和15668；)在血样标本中高度丰富(33).
A、，平均pCR(绿色)和NR(红色)DEFA1-3的光谱峰值。B、，两种典型pCR和NR肿瘤的DEFAs免疫组织化学分析。C中，DEFA1和DEFA2的MALDI-MS成像是通过将光谱文件与H&E图像叠加重建为离子密度图像来完成的(左边)显示NR和pCR。
为了验证我们基于蛋白质组学分析的发现并确定DEFA表达的来源，我们用DEFA特异性抗体通过免疫组织化学分析了预处理活组织检查。一些获得pCR的患者（第14和19号）在肿瘤细胞和肿瘤间质区显示出强大的DEFA表达，而在NR肿瘤中几乎没有DEFA的表达（第9和11号；). 值得注意的是，浸润性中性粒细胞在所有切片中DEFA表达阳性，表明抗体的特异性。
为了进一步确保根据基质斑点的位置检测DEFA的表达没有偏差，在整个组织切片上进行MALDI-MS成像，以便可视化DEFA在活检切片上的空间分布。一个具有代表性的NR和pCR样本显示，在达到pCR的患者的肿瘤和基质中都存在DEFA1和DEFA2，但在没有达到pCR（NR；). 值得注意的是，DEFA肽仅在肿瘤区域被识别（比较H&E和MALDI-MS图像)这表明DEFAs在肿瘤细胞或周围基质中特异性表达，而不仅仅是由于全血污染所致。尽管如此，任何未来将DEFA作为生物标记物的考虑都需要考虑使用没有像我们在本研究中所做的那样被肿瘤相关血液污染的组织。此外，在中性粒细胞浸润程度高的肿瘤区域，我们不能排除中性粒细胞对DEFA表达的可能贡献。与我们的结果一致，DEFA的表达在鳞状细胞癌中普遍存在(30). 这些分析和成像数据首次表明，组织学导向的MALDI-MS能够准确识别与反应相关的预处理活检中的差异特征，并显示蛋白质组学在未来生物标记物分析中的应用。
基因表达谱分析
在14名患者（4名pCR患者）中，使用基因表达谱来确定与新辅助紫杉醇/放射治疗反应相关的差异表达模式。激光捕获显微切割是因为肿瘤细胞密度在20%到95%之间的活检存在明显的异质性。从捕获的肿瘤细胞中分离的RNA与Affymetrix基因芯片杂交。我们首先注释了pCR和NR基因表达数据，并进行了未配对t吨对所有探针进行测试，以确定差异表达基因。生成了一个101-probe集的热图，该热图表示表达变化大于3倍的基因(P（P）<0.05）在pCR和NR样品之间(). MAP2，微管相关蛋白2，通过两种探针评估，其表达变化超过4倍，是一种高度显著的差异表达基因（FDR校正t吨测试，P（P）<0.03）pCR与NR患者的肿瘤().
A、，101-probe集（>3倍变化，P（P）<0.05）从pCR患者中分离肿瘤(绿色)与NR相比(红色).B、，分析NR和pCR肿瘤中MAP2的表达水平。FDR修正t吨测试表明已显著修正P（P）两个MAP2探针的NR与pCR样品之间<0.03（绝对折叠变化的平均值和归一化值）。
由于MAP2结合并稳定微管，紫杉醇治疗增强了这种相互作用，这可能有助于药物敏感性，因此我们选择进一步研究该基因作为紫杉醇敏感性的标记(34). MAP2在几种癌症中过度表达(35–39). 我们从五种乳腺癌细胞系中获得了MAP2 mRNA的基本表达，以及紫杉醇浓度，在紫杉醇的浓度下，其生长被抑制50%（GI50价值观；看见补充材料和方法). 乳腺癌细胞系中MAP2的表达高度相关(R（右）2>0.99）紫杉醇敏感性在体外(补充图S1). 这些数据表明，MAP2的表达是乳腺癌紫杉烷敏感性的关键决定因素。
为了确定MAP2蛋白水平和紫杉烷敏感性之间是否存在机械联系，我们设计了两个乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-468，以过度表达MAP2。两种细胞系都用含有地图2cDNA或空载体。免疫印迹分析证实，MAP2在MCF-7和MDA-MB-468细胞中稳定过表达(). 这些细胞是作为三维乳房球生长的，这是一种培养方法，具有良好的特征，并概括了乳腺上皮的功能和形态(25–27). 与载体对照相比，紫杉醇治疗使过度表达MAP2的MCF-7和MDA-MB-468细胞的乳腺形成和总细胞数分别减少53.7%和46.4%(). 我们还检测了这些工程乳腺癌细胞株在生长为二维集落时对紫杉醇的敏感性，并观察到类似的现象（数据未显示）。
A、，Western分析显示用载体控制或转基因的MCF-7和MDA-MB-468细胞中MAP2和GAPDH蛋白水平地图2.B，对照组和MAP2表达细胞以乳腺球±紫杉醇的形式生长。箭头，非粘附或凋亡细胞。在10 d±紫杉醇作用后测定活细胞数，并与未处理对照组进行比较。
在确定了影响紫杉醇反应的个体生物标志物后，我们使用我们的基因表达数据来探索与反应相关的肿瘤的临床亚组。基因表达谱分析已将乳腺癌分为五种不同的亚型：正常乳腺、HER2+、基底样、管腔-A和管腔-B(40–42). 基底样亚型主要由三阴性乳腺癌组成(43,44). 将定义这些分子亚型的基因签名与pCR与NR中表达变化超过3倍的探针进行交叉引用(P（P）<0.05）导致这些肿瘤的亚型分类。例如，我们观察到19个中的9个过度表达(ACTG2、SLPI、ANXA8、KRT5、TRIM29、KRT17、GAPRP、FOXC1、和第三代)基底样信号中的已知基因和13个基因中5个的下调(TFF3、ESR1、GATA3、ACADSB、和重新注册)在前面定义的灯具特征中(43)，发生pCR的患者(补充表S2). 同样，ER调节基因的表达（例如。，GATA3协议和重新注册)在ER+缺乏反应（NR）的患者中发现。这些观察结果也与我们的发现相一致，即六名pCR患者中有五名患有三重阴性肿瘤(). 值得注意的是，本文中分子分析的三阴性肿瘤的数量与整个研究中登记的肿瘤数量相似，消除了潜在的采样偏差。
对pCR和NR患者之间差异表达的探针的基因本体类别进行了基于富集的统计检验（>3倍；P（P）< 0.05). 免疫信号类别显著丰富，包括防御反应、免疫反应、MHC复合物、刺激反应、趋化因子活性和免疫细胞激活(补充表S3).
在另一个接受以紫杉醇为基础的新辅助治疗的患者队列中进行生物标记物验证
为了进一步验证在独立患者队列中，DEFA和MAP2这两个标记物的表达是否与pCR相关，我们从接受新辅助紫杉烷化疗的患者的47例额外的预处理活检中获取组织，并通过免疫组织化学法评估DEFA与MAP2的表达(补充表S1). 第二队列47名接受以紫杉醇为基础的新辅助治疗的患者中，有11名（23%）达到pCR。此外，由于DEFA是中性粒细胞的标记物，我们对pCR患者肿瘤的基因表达和基因本体分析显示与宿主免疫反应有关，我们还对活检标本进行评分，以确定肿瘤周围的免疫细胞浸润是否为炎症标志，以及浸润内的中性粒细胞计数（如材料和方法所述）。我们发现六个肿瘤（占总数的9%）有高水平的中性粒细胞浸润（>10/高倍视野），其中三个肿瘤来自达到pCR的患者(补充图S2B; 数据未显示）。
pCR的单变量logistic回归显示与所有三个标志物DEFA具有统计学意义的相关性(P（P）=0.007），炎症(P（P）=0.031）和MAP2(P（P）=0.037）通过免疫组化评估。DEFA表达和炎症水平的增加与pCR分别达到3.4（95%可信区间，1.4-8.1）和2.3（95%置信区间，1.1-4.9）的几率增加相关(). 值得注意的是，中性粒细胞标志物DEFA与肿瘤样本中的炎症相关(对= 0.36,P（P）=0.007，斯皮尔曼相关）。第75百分位MAP2患者的pCR是第25百分位患者的3.2倍（95%置信区间，1.1-9.3）(). 对所有三个标记物进行多变量分析（数据未显示）未达到统计显著性，可能是因为该患者队列中pCR的数量有限。在接受以紫杉烷为基础的新辅助治疗的更大患者队列中，这些标记物的最终多元评估是有保证的。
表2
| 分数 | NR、，n个（分数百分比） | pCR，n个（分数百分比） | OR（95%置信区间） |
|---|
| DEFA公司 | 0 | 8 (100%) | 0 (0%) | 3.4 (1.4–8.1),P（P）= 0.007 |
| +1 | 17 (81.0%) | 4 (19.1%) | |
| +2 | 13 (56.5%) | 10 (43.5%) | |
| +3 | 2 (40.0%) | 3 (60.0%) | |
| 炎症 | 0 | 4 (100%) | 0 (0%) | 2.3 (1.1–4.9),P（P）= 0.031 |
| +1 | 22 (88.0%) | 3 (12.0%) | |
| +2 | 13 (61.9%) | 8 (38.1%) | |
| +3 | 7 (63.6%) | 4 (36.4%) | |
| 地图2* | | 第50页（第25页–第75页） | 第50页（第25页–第75页） | 3.2 (1.1–9.3),P（P）= 0.037 |
| 33.3 (18.3–38.3) | 35.0 (31.7–40.0) | |
讨论
我们使用蛋白质组学和基因组分析来确定新辅助紫杉醇/放射治疗的pCR分子标记。pCR和NR肿瘤活检中均发现炎症标记物DEFA、肿瘤浸润免疫细胞的高水平以及微管相关蛋白2（MAP2）的差异表达。为了验证我们的发现，我们显示这些标记物与接受基于紫杉醇的新辅助治疗的单独队列患者的反应显著相关。
在我们研究的38名患者中，12名患者呈三重阴性，其中58%（7名患者）有pCR。只有23%的非三重阴性肿瘤患者达到pCR。因此，患有三阴性疾病的患者对该治疗方案的反应是正常患者的两倍。同样，在两项独立研究中，在接受紫杉烷新辅助治疗的患者中，基底样（三阴性）和HER2+亚组与较高的pCR率（27-45%）相关，而管腔pCR率（6-7%）相关(45,46). 值得注意的是，经过进一步随访，获得pCR的患者到目前为止仍然无病（中位随访59个月），这表明了识别反应分子标记物的重要性。
蛋白质组分析确定DEFAs是pCR的预测因子。DEFAs在先天免疫防御炎症相关疾病（包括上皮性肿瘤）中发挥重要作用(30,47). DEFA表达也与高水平炎症和免疫细胞浸润有关。此外，通过基因表达谱分析和统计测试来分析pCR和NR患者之间差异表达的基因，我们观察到免疫反应类别显著增加。值得注意的是，DEFAs在基因分析中没有差异表达，可能是因为DEFAs是在颗粒加工的翻译后水平上调节的(32).
最近一项针对三阴性肿瘤的基因表达谱研究发现，淋巴细胞浸润增加、IFN调节和免疫球蛋白基因高表达的肿瘤与无转移生存率的提高有关(44). IFN调节基因(CXCL10系列)和两个免疫球蛋白基因(IGHG1型和IGHG3型)研究中发现pCR患者肿瘤中三阴性肿瘤簇增加（>3倍）（数据未显示）。这些数据表明，免疫相关蛋白（如DEFAs）的表达以及三阴性乳腺肿瘤中免疫细胞浸润的存在可能预示着新辅助紫杉醇/放射治疗的反应，综合使用基因组和蛋白质组肿瘤分析可以获得更多的分子见解。
从我们的微阵列分析中，我们发现地图2在pCR和NR肿瘤中表达水平较高(P（P）< 0.03). MAP2通过其微管稳定功能在神经突起生长和树突发育中发挥关键作用(48)，在非小细胞中表达(38)、神经内分泌(35,37)和口腔鳞癌(36). 转移性黑色素瘤细胞中MAP2的表达导致微管稳定，G2-M细胞周期阻滞和生长抑制在体外和体内(39). MAP2高表达的原发性黑色素瘤与那些很少或没有表达的黑色素瘤相比，具有明显更好的无转移生存率。MAP2相关肽在多西他赛敏感性胰腺导管腺癌与多西他西难治性胰腺癌中高表达(49). 紫杉醇治疗增强微管蛋白和MAP2之间的相互作用，这可能有助于MAP2高表达细胞的紫杉烷敏化(34). 支持这一理论，我们发现两种乳腺癌细胞系中MAP2的过度表达与紫杉醇敏感性相关。MAP2在乳腺肿瘤活检中的预处理表达可以作为对基于紫杉烷的新辅助治疗的反应的标志。
在新佐剂、佐剂和转移环境中，紫杉醇治疗仍是乳腺癌最有效的治疗方法之一，并可提高无病生存率和总体生存率(8,50). 在接受新辅助紫杉烷治疗的大范围患者中，DEFA和MAP2表达以及免疫浸润与pCR显著相关。这些生物标记物可能在选择接受紫杉烷类作为治疗方案一部分的乳腺癌患者方面具有未来的实用价值。
致谢
我们感谢参与的患者、协助样本收集的研究护士、Rakesh Reddy和Theresa Adkins输入临床数据，以及Carlos Arteaga对手稿的洞察和审查。
赠款支持
NIH资助P50 CA95131（乳腺癌卓越研究专业计划）；CA105436和CA070856（J.A.Pietenpol）；ES00267和CA68485（核心业务）；CA009385（J.A.Bauer）；5R01 GM58008-09（R.M.Caprioli）；国防部W81XWH-05-1-0179（R.M.Caprioli）；美国陆军拨款DAMD17-99-1-9422（J.A.Pietenpol）；以及范德比尔特-英格拉姆癌症中心发现拨款（a.B.Chakravarthy）。
工具书类
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