圆形Res。作者手稿；PMC 2011年6月11日发布。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理2891748
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院198872
动脉粥样硬化血流动力学调节纤维连接蛋白沉积以产生维持内皮炎症的正反馈
,1,三 ,1,三 ,三 ,1,2,三和1,三
瑞安·E·费弗
1生物医学工程系
三罗伯特·M·伯尔尼心血管研究中心
布拉德利·D·盖尔芬德
1生物医学工程系
三罗伯特·M·伯尔尼心血管研究中心
王冲（Chong Wang）
三Robert M Berne心血管研究中心
马丁·施瓦茨
1生物医学工程系
2微生物和细胞生物学系
三Robert M Berne心血管研究中心
布雷特·布莱克曼
1生物医学工程系
三罗伯特·M·伯尔尼心血管研究中心
1生物医学工程系
2微生物学和细胞生物学系
三罗伯特·M·伯尔尼心血管研究中心
- 补充资料
1
GUID:2D1AE37A-F0EE-42BC-A9FA-0F313E22881C
摘要
理论基础
细胞外基质蛋白，纤维连接蛋白（FN），集中沉积在动脉粥样硬化区域，在那里它有助于炎症信号传导。
目标
阐明FN沉积受局部剪切应力模式调节的机制，其对PECAM-1机械传导的依赖性，以及该途径在维持动脉粥样硬化/促炎表型中的作用。
方法和结果
暴露人内皮细胞在体外动脉粥样硬化蛋白或人类颈动脉产生的动脉粥样硬化保护剪切应力模式。动脉粥样硬化保护血流的开始导致FN沉积的短暂增加，而动脉粥样硬化保护血流导致FN表达和整合素活化随时间的推移而稳定增加，导致FN的沉积相对于动脉粥样硬化保护状态显著持续增加。ApoE中FN染色的比较−/−和ApoE−/−PECAM公司−/−小鼠表明，PECAM-1对FN在主动脉弓动脉粥样硬化区的积聚至关重要。在体外，针对PECAM-1的siRNA阻断了FN的诱导和NF-κB通过动脉粥样硬化流动的激活，而外源性FN的加入可以挽救这一过程。此外，阻断NF-κB活化可减弱流诱导的FN表达。抗FN的siRNA显著降低了NF-κB活性，而外源性FN的加入可以挽救NF-κ的活性。
结论
这些结果表明，FN基因的表达和组装成基质纤维是由动脉粥样硬化流体剪切应力诱导的。这种效应至少部分由转录因子NF-κB介导。此外，由于FN促进NF-κB的激活，动脉粥样硬化剪切应力产生了维持炎症的正反馈。
关键词：血流动力学、动脉粥样硬化、纤维连接蛋白
介绍
动脉粥样硬化是血管系统的一种局部炎症性疾病，以内皮细胞的慢性激活为特征1在疾病区域，局部环境持续刺激炎症信号传导，以促进疾病进展。众所周知，与剪切应力通常为单向和高的动脉粥样硬化保护区相比，动脉粥样硬化环境往往在血管系统中的球状、弯曲或分叉部位发展，这些部位通常具有低和振荡的剪切应力模式2确实，动脉粥样硬化和动脉粥样硬化保护剂在体外剪切应力诱导不同的内皮表型，剪切应力是导致局部动脉粥样硬化的早期内皮活化因子之一三,4.
动脉粥样硬化剪切应力模式激活炎症转录因子NF-κB，其下游靶点包括多种细胞因子（单核细胞趋化蛋白1[MCP1]、白细胞介素8[IL8]）和粘附分子（血管细胞粘附分子[VCAM]、E-选择素），它们共同介导损伤形成所必需的白细胞的募集4-6NF-κB活化由剪切应力机械传感器、血小板内皮细胞粘附分子（PECAM）-1介导7,8PECAM是一种细胞间连接蛋白，与VE-Cadherin和VEGF受体2形成机械感觉复合物。这种复合物启动了许多对剪切应力的早期信号传导事件，包括MAP激酶和整合素的激活7PECAM对PECAM中NF-κB的激活、病变形成和动脉粥样硬化区域的血管重塑是必要的−/−动脉粥样硬化小鼠模型8-11因此，剪切应力通过机械传导激活内皮炎症，以响应局部动脉粥样硬化剪切应力。
动脉粥样硬化区域还以细胞外基质的差异为标志。内皮细胞通常位于主要由IV型胶原和层粘连蛋白组成的细胞外基质上，除非受到损伤12相反，纤维连接蛋白（FN）优先沉积在人类斑块内13损伤形成前野生型小鼠的内皮下14FN-null小鼠在胚胎发育过程中死于严重缺陷；然而，已经从FN亚型（胞外结构域A）被敲除或缺乏剪接调控的小鼠中获得了洞察力。预计这两种缺陷都会导致FN表达或基质组装减少15,16两者都会减少动脉粥样硬化斑块负担17-19FN是一种临时基质成分，在迁移和伤口愈合中起重要作用。促进细胞生长和运动20并调节其他基质成分如胶原蛋白的沉积和组装21根据FN的短暂功能，在细胞培养系统中，FN被基质金属蛋白酶（MMP）降解和FN内吞/分泌，可以相对快速地重塑22,23FN结合，主要（但不限于）由整合素αvβ3和α5β1结合，可以影响内皮细胞内的外源性信号传导，包括NF-κB和其他途径的调节24,25重要的是，Orr等人发现，在FN上而不是胶原蛋白或层粘连蛋白上的内皮细胞激活了NF-κB，以应对剪切应力的开始，尽管没有研究剪切应力持续刺激的后果14Chiang等人最近一致认为，阻止FN体内粘附分子表达减少和白细胞浸润血管壁26因此，FN似乎增强了动脉粥样硬化区域内的炎症信号。
总的来说，动脉粥样硬化区域炎症加剧，这受PECAM机械传导调节，并通过局部FN沉积增强。本研究的目的是确定流体剪切应力是否介导FN在动脉粥样硬化区内皮下的沉积。这些数据揭示了一种正反馈机制，该机制可能在慢性炎症以及这些区域的斑块形成中发挥重要作用。因此，阻断这一循环可能为动脉粥样硬化的预防、消退或稳定提供一种新的方法。
方法
鼠标模型
所有小鼠研究都是在弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会（ACUC#3597）的批准下进行的，并符合NIH在“实验动物护理和应用指南”中提出的建议。研究PECAM在双ApoE主动脉弓FN沉积组织切片中的作用−/−（n=3）和ApoE−/−PECAM公司−/−（n=3）双敲除（DKO）小鼠（C57BL6）；前面描述过8)如前所述实施安乐死并获取组织8主动脉弓石蜡包埋切片进行纤维粘连蛋白免疫染色（兔多克隆，Sigma-Aldrich），并在动物接受西方饮食（年龄：8周，周饮食）之前或14周后（年龄：22周）用苏木精进行复染8.
细胞培养
如前所述，在第2代使用来自不同单个供体的人脐静脉内皮细胞（EC）进行每个实验复制27人内皮细胞在补充有10%胎牛血清（FBS；Hyclone）、5mg/ml内皮细胞生长补充剂（ECGS；Biomedical Technologies）、10mg/ml肝素（Sigma）、2mM L-谷氨酰胺（Gibco）和100U青霉素/链霉素（Invitrogen）的M199生长培养基（Biowitaker）中以80000个细胞/cm的速度培养2在流动之前，在DPBS中洗涤细胞，并将培养基与还原的血清培养基（按重量计2%的FBS和4%的右旋糖酐以增加粘度）交换。
体外血流动力学模型和试剂
研究剪切应力模式对FN沉积的作用在体外，锥板流动装置施加的剪切应力波形源自我们实验室先前定义的人类颈内动脉窦（动脉粥样硬化）或颈总动脉（动脉粥样硬化保护性）三,27动脉粥样硬化保护波形是脉动的、单向的，时间平均切变为14.5dyne/cm2而动脉粥样化蛋白波形是脉动的，并且是反向的，时间平均值为0.22dyne/cm2如所示在线图IA。除非另有说明，否则所有流动实验均为24小时。如前所述，一些实验使用添加了从人血浆中分离的外源性FN的培养基28、8mM BAY 11-7082（Calbiochem）、pan-MMP抑制剂GM 1489（Calbiochem），整合素激活抗体TS2/16（10mg/ml）或5ng/ml IL-1β（PeproTech）。
免疫沉淀、Western印迹、实时RT-PCR和病毒感染
为了测量PECAM磷酸化，在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂（Sigma）的冰镇裂解缓冲液中收集细胞，并对PECAM（SantaCruz）进行免疫沉淀（IP）。IP后，用4G10磷酸酪氨酸抗体（Upstate）分析蛋白质，并将其归一化为总抗PECAM（SantaCruz）。完成流动实验后，立即将细胞直接收集到SDS-MAPK样品缓冲液中（细胞信号）。Western blotting用于测量相对FN（BD，1:2000）、VCAM（R&D，1:500）和PECAM（Santa Cruz，1:500。提取总RNA并逆转录至cDNA RT-PCR分析。FN、VCAM、E-选择素、IL-8、MCP-1和β2-微球蛋白（B2M）的引物序列已在其他地方发表29,30(补充表1). 内皮细胞感染50个含有NF-κB荧光素酶报告子的MOI腺病毒（Vector Labs），在相关实验中，在剪切应力前16-24小时，再感染100个IκB显性阴性结构的MOI。
纤维连接蛋白和PECAM的siRNA敲除
PECAM siRNA转染遵循上述方案8用1nmole FN1 siRNA（L-009853-00，Dharmacon）或对照（D-001810，Dharmcon）和60ml低聚丙胺在6ml OptiMEM-I培养基中治疗约300万EC 5小时，可击倒纤维连接蛋白。转染后16-24小时恢复后，将内皮细胞移植到1%明胶上，如上所述进行感染，24小时后使用。
结果
生理剪应力对纤维结合蛋白沉积的不同调节
先前的观察结果表明，FN优先沉积在人类和小鼠血管系统的病变颈动脉分叉处13,14由于FN沉积的焦点性质体内，我们假设剪切应力可能通过内皮调节这种局部FN表达和基质组装。因此，人类内皮细胞暴露于动脉粥样硬化或动脉粥样硬化保护剪切应力(在线图IA)并评估FN表达。4小时后，动脉粥样硬化保护性剪切应力导致FN表达立即增加，24小时后恢复到基础水平(). 相反，动脉粥样硬化蛋白流量导致FN稳定增加，导致24小时后显著升高。这种调节在一定程度上是由于内皮细胞主动产生和分泌FN，并与24小时时动脉粥样硬化中FN mRNA表达水平高于动脉粥样硬化保护流量相关(). 在相同时间平均剪切应力的稳定流动条件下，没有观察到剪切应力引起的FN沉积增加，这表明剪切应力大小本身并不能控制这一途径(在线图IB). 在两种生理流动条件下，内皮细胞都能产生FN纤维(). 然而，在动脉粥样硬化流动下的原纤维呈网状且致密，没有明显的排列。相比之下，动脉粥样硬化保护血流下的FN纤维显得稀疏，但沿血流方向排列。
生理剪切应力调节FN沉积A.在动脉粥样硬化或动脉粥样硬化保护剪切应力或静态条件下，对内皮细胞在4、16和24小时的FN蛋白表达进行分析，并将其归一化为α-微管蛋白，以相对于初始条件（t0）的倍数变化表示。显示了24小时流动后的典型印迹。24小时后评估B.FN基因的表达，并表现为相对于倾向血流的折叠变化。在粥样硬化蛋白或粥样硬化保护剪切应力作用下，24小时后在指定放大倍数下进行C.FN染色。（数值为平均值±SE，n=5-10。A.*=p<0.05，不同流型之间，双向方差分析，B.*=p<0.05，学生t检验）。
PECAM介导流动诱导纤维结合蛋白沉积
缺乏PECAM的高胆固醇血症小鼠可减少动脉粥样硬化，这与NF-κB活性降低有关8先前的工作也证明FN沉积在野生型小鼠或幼年ApoE的动脉粥样硬化区域−/−动脉粥样硬化发生前的小鼠14我们假设PECAM缺乏小鼠动脉粥样硬化的减少与动脉粥样硬化蛋白区域FN表达的减少有关。两个ApoE动脉粥样化蛋白主动脉弓的组织切片−/−和ApoE−/−PECAM公司−/−双基因敲除（DKO）小鼠在喂食周粮或西餐后进行FN染色(). 在ApoE中−/−PECAM公司−/−与ApoE相比，单纯喂食食物的小鼠在损伤形成之前，内皮下基质中的FN缺失−/−。这一结果在ApoE中更为明显−/−喂食西式饮食的小鼠，其内皮下基质和粥样斑块内的大病灶显示FN染色强烈，而DKO小鼠的病灶较小，形成的病灶完全没有FN(). 因此，在动脉粥样硬化发生之前和发展期间，小鼠动脉粥样硬化区的局部FN沉积是PECAM依赖性的。
PECAM-1促进ApoE−/−小鼠FN沉积对ApoE−/−PECAM+/+和ApoE–/−PE CAM−/–小鼠在病变形成之前（饮食）和晚期病变（饮食）（每种情况下3只小鼠的代表性图像）的主动脉弓横截面上的FN染色进行比较。较大的图像显示插图中显示的整个血管横截面的放大率较高。
这一结果得到了证实在体外使用siRNA-介导的PECAM敲除，将PECAM表达降低至对照组的30±9%。先前研究表明，降低PECAM可以阻断动脉粥样硬化蛋白流诱导的NF-κB活性和VCAM表达8PECAM的敲除使FN蛋白沉积降低到对照组的46±13%，NF-κB活性降低到62±15%(). 在siPECAM细胞培养液中添加外源性FN，可恢复FN与内皮下基质的结合，并通过动脉粥样化蛋白流挽救NF-κB的活化(). VCAM蛋白表达，NF-κB活性的下游靶点，也被外源性FN恢复(). 因此，PECAM依赖性的FN诱导是动脉粥样硬化环境中NF-κB活性的重要决定因素。有趣的是，向siControl样本中添加外源性FN并没有显著增强NF-κB活性或VCAM表达，这表明内源性FN最大限度地支持了这一途径。
PECAM通过FN沉积促进动脉粥样硬化血流诱导的NF-κB活性A.PECAM（siPECAM）或对照siRNA（siControl）处理的内皮细胞暴露于动脉粥样硬化流中，通过Western blot分析蛋白表达，并归一化为α-微管蛋白。每个测量值都是相对于未经处理的siControl条件的折叠变化，由1（B-D）处的水平线表示。在siPECAM（+）或siControl（−）后，在动脉粥样硬化流下评估内皮细胞中FN蛋白水平（n=4-8）（B.）、NF-κB荧光素酶报告活性（n=4~7）（C.）和VCAM表达（n=4.6）（D.），有无外源性FN。测量暴露于动脉粥样硬化或动脉粥样硬化保护剪切应力后的E-F。PECAM酪氨酸磷酸化（n=4）（F）。数值为归一化为α-微管蛋白的平均值±SE，表示为相对于未处理siControl（A-D）或归一化总PECAM的折叠变化，并表示为相对于静态条件（E-F）的折叠变化。†与未经处理的siControl（B、C、D）或静态条件（F）相比，单样本t检验p<0.05，*p<0.05，单向方差分析。
为了了解PECAM差异激活FN和NF-κB的机制，在动脉粥样硬化保护、动脉粥样硬化或静态条件下24小时后评估PECAM的磷酸化状态。据报道，剪切应力的发生可刺激酪氨酸上PECAM磷酸化31.结果表明，24小时后，动脉粥样硬化流动增加了PECAM磷酸化水平，而在动脉粥样硬化保护流动中，磷酸化与静态条件相似。这些结果表明，慢性动脉粥样硬化血流刺激PECAM通路，从而刺激FN表达和炎症信号。
流动诱导纤维结合蛋白沉积依赖于NF-κB
先前发现纤维连接蛋白的转录依赖于NF-κB，后者能够结合并激活FN启动子中的NF-κ的B位点32,33我们之前发现，动脉粥样硬化流动激活NF-κB体内和在体外以PECAM依赖的方式，类似于FN8因此，我们研究了NF-κB是否控制FN表达。我们使用药物抑制（BAY 11-7082）和腺病毒传递显性阴性IκB来抑制NF-κB。BAY（8mM）阻断了动脉粥样硬化流动诱导的NF-κB活性，使其相对于载体（DMSO(). 尽管BAY化合物不能有效降低NF-κB，但与显性阴性IκB相比，BAY化合物能更有效地降低FN蛋白沉积，这表明可能存在非靶向效应。然而，这两种治疗方法都证实，在动脉粥样硬化流量下，FN mRNA和蛋白水平都是NF-κB依赖性的。
动脉粥样硬化诱导的FN沉积依赖于NF-κB使用BAY药物或IκB显性阴性结构阻断NF-κB活性，并与载体对照组比较评估FN蛋白（A）和基因表达（B）。数值为平均值±SE（n=4），并报告为相对于动脉粥样硬化对照组的倍数变化*p<0.05，配对t检验。
整合素激活减少在动脉粥样硬化保护流下维持低纤连蛋白沉积
结果表明，消耗PECAM可降低FN表达和NF-κB活性，以应对动脉粥样硬化，两者均被外源性FN所挽救。因此，我们测试了在动脉粥样硬化保护流中表达低水平FN的内皮细胞是否可以诱导FN沉积和NF-κB活性增加。在16小时动脉硬化保护血流预处理后，在剩余8小时内添加外源性FN。尽管循环介质中FN增加，但FN在基质中的组装保持在低水平，与对照组相似，NF-κB没有变化(). 与未经治疗的对照组相比，IL-1β治疗的内皮细胞导致NF-κB的短暂激活（4-8小时：63.9±2.3倍；24小时：35.5±3.6倍）。尽管有这种激活水平，但IL-1β治疗不足以诱导FN沉积，与以前的报道类似34(). 这一结果表明，除动脉粥样硬化保护流下低NF-κB活性外，其他因素有助于低FN基质组装。接下来，我们测试了基质金属蛋白酶是否参与FN降解。然而，与其他研究一致，pan-MMP抑制剂GM1489（Calbiochem）不影响动脉粥样硬化保护血流下FN积聚的时间模式21，表明该过程与MMP无关(在线图二). 这一结果表明，动脉粥样硬化保护流通过FN蛋白生成或MMP依赖性降解以外的机制调节基质组成。FN组装需要整合素激活35层流剪切的开始可以瞬时激活整合素αvβ3和α5β114,36因此，我们考虑了动脉粥样硬化流动是否通过控制整合素的激活来影响FN基质的组装。整合素活性，通过结合FNIII测定9-11与动脉粥样硬化保护流相比，高亲和力整合素特异性蛋白在动脉粥样硬化蛋白中升高(). 为了测试整合素激活在FN沉积中的作用，整合素活化抗体TS2/1637与外源性FN同时添加。当TS2/16与FN一起添加时，在动脉粥样硬化保护流下，细胞内FN沉积显著增加，但两种药物均未单独激活(). 值得注意的是，尽管FN和TS2/16治疗后FN水平增加，但NF-κB活性没有改变().
通过减少整合素激活维持低基础FN的动脉保护流量在动脉粥样硬化保护血流24小时后，在最后8小时内添加或不添加外源性FN和/或整合素激活抗体TS2/16，评估A-B.FN水平和NF-κB活性，数据显示为相对于初始条件（t0）或动脉粥样硬化控制的倍数变化。用5ng/ml的IL-1β治疗C.EC，将FN归一化为α-微管蛋白，并与未治疗的情况进行比较（用1处的水平线表示）。D.剪切应力24小时后，用20μg/ml GST-FNIII培养EC单层9-11持续30分钟，测量整合素活性/结合，并显示为相对于动脉粥样硬化状态的折叠变化。数值为平均值±SE（n=3-5），A-B*=p<0.05，与未治疗对照组相比的双向方差分析，C.与未治疗组相比的单样本t检验，D.*p<0.05学生t检验。
纤维连接蛋白增强动脉粥样硬化血流中NF-κB活性
以前的报告显示，在FN上的内皮细胞中，层流的开始激活了NF-κB，而胶原上的细胞则没有；他们还表明，持续的动脉粥样硬化剪切应力激活了NF-κB，与动脉粥样硬化保护剂相关8,14因此，我们评估了FN通过动脉粥样硬化蛋白和动脉粥样硬化保护流量对NF-κB差异调节的作用。首先，为了在动脉粥样化蛋白流下最小化细胞衍生FN，采用siRNA抑制培养物中FN的产生。与对照siRNA（siControl）相比，使用抗FN的siRNA（siFN）将prone诱导的FN减少至15±3%(). 在用siFN处理的培养物中，动脉粥样硬化24小时后NF-κB报告活性显著降低22%(). 将外源性FN（10mg/ml）添加到siControl和siFN处理细胞的培养基中，FN沉积（135±41%）和NF-κB活性完全恢复到控制水平。还在动脉粥样硬化流下研究了siFN和siControl条件下NF-κB依赖性基因转录。显示与siControl相比，E-selectin、MCP-1和IL-8（但不包括VCAM）均显著降低。
动脉粥样硬化血流下FN沉积增加促进NF-κB活性A.用抗FN的siRNA（siFN）处理内皮细胞，在静态和动脉粥样硬化条件下添加或不添加外源性FN，并与未经处理的siRNA对照（siControl）进行比较。动脉粥样硬化24小时后，比较siFN和siControl内皮细胞的B.NF-κB-报告活性，并显示为相对于siControl未经治疗的动脉粥样硬化状态的倍数变化（由1处的水平线表示）。C.用siFN或siControl处理的细胞暴露于动脉粥样硬化流中24小时，然后分析NF-κB依赖基因的表达，这些基因表现为相对于siControl的折叠变化（水平线为1）。数值为平均值±SE（n=6）。†p＜0.05，单样本t检验，与未治疗的siControl动脉粥样硬化情况相比，设置为1，*p＜0.05，单因素方差分析）。
讨论
体内，内皮下FN的沉积与易感区域炎症通路的激活有关。体外，FN促进内皮细胞中多种炎症信号通路的激活14,38,39在这里，我们发现动脉粥样硬化剪切应力可以有效地调节FN的表达和炎症，为局灶性FN沉积提供了有力的证据体内是由于局部血流动力学。根据这些和以前的结果，动脉粥样硬化环境中内皮细胞炎症通路的激活涉及两个独立的事件。首先，必须重塑内皮下基质，用促炎蛋白（如FN）取代抗炎基底膜蛋白（如胶原蛋白和层粘连蛋白）。其次，通过整合素的持续信号必须由阻止炎症信号适应和下调的流动模式诱导。目前的数据表明，动脉粥样硬化保护血流抑制这两条通路，而动脉粥样硬化保护血流模式可以诱导这两条反应臂，因此足以诱导内皮持续炎症激活。
内皮PECAM是一种机械感觉复合物的组成部分，它对整合素的激活是必要的，因此整合素依赖性通路如NF-κB在血流中的激活也是必要的7,8,11之前，我们小组和其他人报告在动脉粥样硬化小鼠模型（ApoE−/−，低密度脂蛋白−/−PECAM的缺失降低了动脉粥样硬化区域的斑块负担，与核NF-κB的降低相关8-11减少EC中的PECAM在体外还通过动脉粥样硬化流动减弱NF-κB活化8,10我们现在展示FN矩阵的集合在体外需要PECAM，并且该效应由NF-κB介导。PECAM分析−/−小鼠主动脉粥样硬化区FN减少，NF-κB降低。虽然在小鼠模型中很难确定因果关系，但这些结果支持体外观察的相关性。因此，PECAM促进FN表达和NF-κB活性的诱导，以响应动脉粥样硬化流动，从而促进持续的促炎反应。
有趣的是，Chen等人观察到，PECAM中流动诱导的组织重塑（高度依赖细胞外基质并活跃于动脉粥样硬化）减少−/−动物11在同一颈动脉结扎模型中阻断FN聚合也同样抑制血管重塑和炎症26因此，FN减少可能导致PECAM的重塑缺陷−/−小鼠，可能通过损害胶原蛋白的沉积或炎症反应，两者都是许多血管重塑过程的重要组成部分21,26删除或抑制PECAM或FN后出现的部分减少表明动脉粥样硬化可以通过独立的途径发生，然而，它们也强烈支持这些事件是重要的促因。
层流开始时PECAM的磷酸化被认为是机械传导的早期关键事件31我们的结果表明，PECAM磷酸化在动脉粥样硬化流动中持续存在。因此，PECAM磷酸化可能与体内-类似的，持续的表型三,8,29,40发展为动脉粥样硬化的区域受到涉及流动逆转的剪切应力模式的影响，这可能会持续激活PECAM及其下游靶点。相反，单向流动（动脉粥样硬化保护区的特征）可能允许PECAM途径在以后适应或脱敏。因此，PECAM的差异激活可能解释了在小鼠和在体外PECAM对某些血流动力学环境中的损伤形成和细胞信号传导有显著影响，而对其他环境则无显著影响8-10,41.
我们的数据的一个重要含义是，在动脉粥样硬化流动下，NF-κB依赖性FN的增加，以及FN促进NF-κ的B活化的能力，创造了一个积极的反馈回路。预计该电路会增强NF-κB活化和FN沉积，从而产生持续的进行性炎症。人们可以预测这种正反馈机制在动脉粥样硬化等终身进行性炎症状态中的存在。FN剪接发生改变的转基因小鼠的结果也支持FN在该疾病中的重要性18,19.
在我们的siRNA实验中，FN缺失的细胞将外源性FN掺入细胞外基质。相比之下，将外源性FN加入对照细胞几乎没有效果。这一发现对于处于动脉粥样硬化保护流下的细胞尤其值得注意，24小时时，基质中FN水平较低，但在培养基中添加FN后没有增加(). 这一结果表明，FN基因表达是决定FN基质组装的唯一因素；由于其他原因，处于动脉粥样硬化保护流下的细胞一定不能将FN组装成原纤维。鉴于血浆中FN浓度很高，而FN沉积到基质中主要发生在动脉粥样硬化区域，这个想法特别有趣体内.
在这方面，已知只有构象激活的高亲和力整合素介导FN矩阵组装35因此，我们检测了动脉粥样硬化蛋白与动脉粥样硬化保护血流中整合素的激活。事实上，在动脉粥样硬化流动下，细胞中的整合素活性显著升高，这可能会在这种情况下介导FN沉积升高。此外，如上文所述，在动脉粥样硬化保护血流下抢救减少的FN沉积需要添加外源性FN和激活整合素，以支持对通路双臂的必要性。令人惊讶的是，即使在动脉粥样硬化保护流下FN沉积增加，尽管没有达到动脉粥样硬化诱导的水平，NF-κB活性仍然很低。这一结果表明，FN本身不足以激活炎症信号，但可以增强血流依赖性信号。这些发现提供了证据，表明局部血流动力学环境通过调节转录和纤维组装来决定局部内皮下FN基质组装。
在这里，我们发现动脉粥样硬化易感区域中FN的增加可以增强内皮的炎症信号。此外，大量证据表明，纤维连接蛋白可以促进整个血管壁的炎症信号传导。单核细胞与FN结合导致诱导强大的炎症细胞因子IL-1β42,43内皮细胞暴露于细胞因子（如IL-1β）可进一步激活局部炎症，因为内皮细胞表达粘附分子以吸引和招募其他炎症细胞122周时WT和PECAM−/−血管中层FN的显著差异()提示内皮细胞的机械传导也可能间接影响周围平滑肌中FN的沉积和表型调节。FN还通过增加血管壁内细胞（可能是平滑肌）的增殖和浸润来调节血管壁增厚，这是早期重塑和晚期斑块的标志26因此，内皮下增加的FN可能在内皮激活后对血管壁产生进一步的有害影响。
长期以来，人们认识到血流动力学环境是动脉粥样硬化中内皮促炎或抗炎表型的关键决定因素。在这里，我们开始阐明剪应力机械传导在基质重塑中的作用。我们的结果表明，FN沉积增加是动脉粥样硬化流诱导炎症表型的重要事件。PECAM是该途径中的关键机械感受器，NF-κB形成正反馈回路，建立炎症状态，并随时间推移而进展。进一步研究不同的局部环境线索（机械力、细胞外基质、可溶性因子）是如何相互作用的，对于理解炎症信号是如何变成慢性的并促进动脉粥样硬化的进展至关重要。
新颖性和意义
这篇文章提供了哪些新信息？
动脉粥样硬化是一种在血管系统特定部位发生的进行性炎症疾病。病变区域的血流动力学变化刺激炎症信号，使这些区域易发生动脉粥样硬化病变。这项研究揭示了内皮细胞重塑细胞外基质的一种方式，进一步增强局部血流诱导的炎症信号。这种信号级联产生了一种“持续反馈”效应，加剧了内皮的局部炎症状态。打破这种炎症循环可能是减缓动脉粥样硬化进展的一种治疗策略。
鸣谢
作者承认：Aaron Mackey博士协助统计分析，Andy Pryor负责细胞培养和小鼠工作以及染色协助，John Sanders负责组织染色技术协助，Brian Harry负责小鼠组织的制备和收集，Jeremy Meier负责分离和提供外源性纤维连接蛋白，考特尼·弗雷德里克森协助进行了早期的试点实验。
资金来源
资金由NIH RO1 HL082836，B.R.B.、NIH生物医学研究合作伙伴基金RO1-HL080956向M.A.S.和B.R.B.以及NIH培训基金5T32HL007284-32，R.E.F.和B.D.G.提供。
非标准缩略语和缩写
| FN公司 | 纤维连接蛋白 |
| 电子计算机 | 内皮细胞 |
| PECAM公司 | 血小板内皮细胞粘附分子1 |
| VCAM公司 | 血管细胞粘附分子1 |
| 核因子-κB | 核因子-kB |
脚注
披露
没有。
这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
工具书类
1Ross R.动脉粥样硬化——一种炎症性疾病。新英格兰医学杂志。1999;340:115–126.[公共医学][谷歌学者] 2DeBakey ME、Lawrie GM、Glaeser DH。动脉粥样硬化的模式及其外科意义。外科年鉴。1985;201:115–131. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。Feaver RE、Hastings NE、Pryor A、Blackman BR。GRP78通过内皮细胞中的p38-、alpha2beta1-依赖机制通过动脉粥样硬化剪切应力上调。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2008年；28:1534–1541. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Dai G，Kaazempur-Mofrad MR，Natarajan S，Zhang Y，Vaughn S，Blackman BR，Kamm RD，Garcia-Cardena G，Gimbrone MA.，Jr人类血管系统动脉粥样硬化易感和耐药区域的动脉波形诱发的不同内皮表型；美国国家科学院院刊；2004年，第14871–14876页。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Brand K、Page S、Rogler G、Bartsch A、Brandl R、Knuechel R、Page M、Kaltschmidt C、Baeuerle PA、Neumeier D。动脉粥样硬化病变中存在活化转录因子核因子-κB。临床研究杂志。1996;97:1715–1722. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Nakashima Y、Raines EW、Plump AS、Breslow JL、Ross R.在ApoE缺乏小鼠内皮上的动脉粥样硬化预防部位上调VCAM-1和ICAM-1。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。1998;18：842–851。[公共医学][谷歌学者] 7Tzima E、Irani-Tehrani M、Kiosses WB、Dejana E、Schultz DA、Engelhardt B、Cao G、DeLisser H、Schwartz MA。一种调节内皮细胞对流体剪切应力反应的机械感觉复合物。自然。2005;437:426–431.[公共医学][谷歌学者] 8Harry BL、Sanders JM、Feaver RE、Lansey M、Deem TL、Zarbock A、Bruce AC、Pryor AW、Gelfand BD、Blackman BR、Schwartz MA、Ley K.内皮细胞PECAM-1促进ApoE缺乏小鼠血流紊乱区域的动脉粥样硬化病变。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2008年；28:2003–2008. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Goel R、Schrank BR、Arora S、Boylan B、Fleming B、Miura H、Newman PJ、Molthen RC、Newman DK。PECAM-1对低密度脂蛋白受体缺乏小鼠动脉粥样硬化的部位特异性影响。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2008年；28：1996-2002年。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Stevens HY、Melchior B、Bell KS、Yun S、Yeh JC、Frangos JA。PECAM-1是动脉粥样硬化的关键介质。疾病模型和机制。2008年；1:175–181. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 11Chen Z，Tzima E.PECAM-1对流动诱导的血管重塑是必要的。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2009:291067–1073. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Sechler JL、Corbett SA、Wenk MB、Schwarzbauer JE。细胞外基质相互作用的调节。纽约科学院年鉴。1998;857:143–154.[公共医学][谷歌学者] 13Pedretti M、Rancic Z、Soltermann A、Herzog BA、Schliemann C、Lachat M、Neri D、Kaufmann PA。使用F16、F8和L19对动脉粥样硬化斑块进行比较免疫组化染色：三种临床级全人类抗体。动脉粥样硬化。2009[公共医学][谷歌学者] 14Orr AW、Sanders JM、Bevard M、Coleman E、Sarembock IJ、Schwartz MA。内皮下细胞外基质通过流量调节NF-kappaB活化：在动脉粥样硬化中的潜在作用。细胞生物学杂志。2005;169:191–202. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 15Guan JL，Trevithick JE，Hynes RO.大鼠纤维连接蛋白交替剪接形式的逆转录病毒表达。细胞生物学杂志。1990;110:833–847. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Wang A，Cohen DS，Palmer E，Sheppard D.通过转化生长因子对纤维连接蛋白分泌和选择性剪接的极化调节。生物化学杂志。1991;266:15598–15601.[公共医学][谷歌学者] 17George EL、Georges-Labouesse EN、Patel-King RS、Rayburn H、Hynes RO。缺乏纤维连接蛋白的小鼠胚胎中胚层、神经管和血管发育缺陷。发展（英国剑桥）1993;119:1079–1091.[公共医学][谷歌学者] 18Babaev VR、Porro F、Linton MF、Fazio S、Baralle FE、Muro AF。纤维连接蛋白EDA外显子无调控剪接减少小鼠动脉粥样硬化。动脉粥样硬化。2008年；197:534–540. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19Tan MH，Sun Z，Opitz SL，Schmidt TE，Peters JH，George EL。小鼠选择性剪接纤维连接蛋白EIIIA结构域的缺失可减少动脉粥样硬化。鲜血。2004;104:11–18.[公共医学][谷歌学者] 20Larsen M，Artym VV，Green JA，Yamada KM。基质重组：细胞外基质重塑和整合素信号传导。当前操作细胞生物学。2006;18:463–471.[公共医学][谷歌学者] 21Sottile J，霍金特区。纤维结合蛋白聚合调节细胞外基质纤维和细胞基质粘附的组成和稳定性。细胞的分子生物学。2002;13:3546–3559. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Sottile J，Chandler J.纤连蛋白基质的转换是通过一个依赖于小窝蛋白-1的过程发生的。细胞的分子生物学。2005;16:757–768. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23夏皮罗SD。基质金属蛋白酶降解细胞外基质：生物学后果。当前操作细胞生物学。1998;10:602–608.[公共医学][谷歌学者] 24Scatena M、Almeida M、Chaisson ML、Fausto N、Nicosia RF、Giachelli CM。NF-kappaB介导alphavbeta3整合素诱导的内皮细胞存活。细胞生物学杂志。1998;141:1083–1093. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Klein S、de Fougerolles AR、Blaikie P、Khan L、Pepe A、Green CD、Koteliansky V、Giancotti FG。α5β1整合素激活对血管生成和炎症重要的NF-kappa B依赖性基因表达程序。分子和细胞生物学。2002;22:5912–5922. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Chiang HY、Korshunov VA、Serour A、Shi F、Sottile J.纤维结合蛋白是血流诱导血管重塑的重要调节因子。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2009;29:1074–1079. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Blackman BR，Garcia-Cardena G，Gimbrone MA，Jr：一种新的体外模型，用于评估内皮细胞对模拟动脉剪切应力波形的差异反应。生物力学工程杂志。2002;124:397–407.[公共医学][谷歌学者] 28Scott DL，Bedford PA，Walton KW。血浆纤维连接蛋白抗原和抗血清的制备。免疫学方法杂志。1981;43:29–33.[公共医学][谷歌学者] 29Hastings NE、Simmers MB、McDonald OG、Wamhoff BR、Blackman BR。动脉粥样硬化-血液动力学差异调节内皮细胞和平滑肌细胞表型，促进促炎启动。美国生理学杂志。2007;293：C1824–1833。[公共医学][谷歌学者] 30Wieghaus KA、Gianchandani EP、Neal RA、Paige MA、Brown ML、Papin JA、Botchwey EA。邻苯二甲酰亚胺新生血管因子1（PNF1）调节人微血管内皮细胞中的MT1-MMP活性。生物技术和生物工程。2009;103:796–807. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Fleming I，Fisslthaler B，Dixit M，Busse R.PECAM-1在剪切压力诱导内皮细胞Akt和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）激活中的作用。细胞科学杂志。2005;118:4103–4111.[公共医学][谷歌学者] 32Solanas G、Porta-de-la-Riva M、Agusti C、Casagolda D、Sanchez-Aguilera F、Larriba MJ、Pons F、Peiro S、Escriva M、Munoz A、Dunach M、de Herreros AG、Baulida J.E-cadherin控制间充质基因表达中的β-catenin和NF-kappaB转录活性。细胞科学杂志。2008年；121:2224–2234.[公共医学][谷歌学者] 33Chen S、Mukherjee S、Chakraborty C和Chakrabarti S。高葡萄糖诱导的内皮素依赖性纤维连接蛋白合成是通过NF-kappa B和AP-1介导的。美国生理学杂志《细胞生理学》。2003;284：C263–272。[公共医学][谷歌学者] 34Boyle DL，Shi Y，Gay S，Firestein GS。IL-1对内皮细胞CS1纤维连接蛋白表达和功能的调节。细胞免疫学。2000;200:1–7.[公共医学][谷歌学者] 35Wu C，Keivens VM，O’Toole TE，McDonald JA，Ginsberg MH。整合素激活和细胞骨架相互作用对于纤连蛋白基质的组装至关重要。单元格。1995;83:715–724.[公共医学][谷歌学者] 36Tzima E，del Pozo MA，Shattil SJ，Chien S，Schwartz MA。流体剪切应力激活内皮细胞中的整合素可介导Rho依赖性细胞骨架排列。EMBO杂志。2001;20:4639–4647. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Orr AW，Ginsberg MH，Shattil SJ，Deckmyn H，Schwartz MA。剪切应力信号中整合素激活的矩阵特异性抑制。细胞的分子生物学。2006;17:4686–4697. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 38Hahn C，Orr AW，Sanders JM，Jhaveri KA，Schwartz MA。内皮下细胞外基质通过流动调节JNK的激活。流通研究。2009;104:995–1003. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Orr AW、Stockton R、Simmers MB、Sanders JM、Sarembock IJ、Blackman BR、Schwartz MA。基质特异性p21活化激酶激活调节动脉粥样硬化形成中的血管通透性。细胞生物学杂志。2007;176:719–727. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Simmers MB、Pryor AW、Blackman BR。动脉剪切应力调节融合单层中内皮细胞定向迁移、极性和形态。美国生理学杂志心脏循环生理学。2007;293：H1937–1946。[公共医学][谷歌学者] 41Cybulsky MI。动脉粥样硬化地形的变形：PECAM-1的意外作用。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2008:281887–1889.[公共医学][谷歌学者] 42Roman J、Ritzenthaler JD、Perez RL、Roser SL。细胞外基质对白细胞介素-1β表达的不同调节模式。免疫学。1999;98:228–237. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Roman J，Ritzenthaler JD，Fenton MJ，Roser S，Schuyler W.纤维连接蛋白对人白细胞介素1β基因的转录调控：蛋白激酶C和活化蛋白1（AP-1）的作用细胞因子。2000;12：1581–1596。[公共医学][谷歌学者] 
