丝状甲型流感病毒的结构组织

摘要

甲型流感病毒是一种脂类发育的原粘病毒，是通过季节变化产生的毒株以及病毒重组或适应导致的大流行性感染（将新的流感病毒引入人群）而导致人类疾病的原因。病毒基因组包含八个独立的负极性RNA片段，编码八个结构蛋白和四个额外蛋白。基因组片段以核糖核蛋白颗粒（RNPs）的形式与核蛋白（NP）复合包装在病毒中(1). RNP也与病毒聚合酶有关（由PA、PB1和PB2亚单位组成）(2)，这是病毒复制所必需的。该病毒通过宿主质膜出芽，获得一个含有两种棘突糖蛋白的膜包膜，即血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）。基质蛋白（M1）是病毒中含量最丰富的蛋白质，形成与包膜内侧相关的一层。病毒外壳中还存在一个离子通道（M2）(三).

在感染期间，病毒附着在含有唾液酸的细胞表面受体上，唾液酸被HA蛋白识别(4)病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞。在内体的低pH值下，HA的大的结构重排暴露出疏水性融合肽，并介导病毒膜与宿主内体膜的融合(4)，将病毒的包装物（RNP）释放到宿主细胞质中。此外，通过M2离子通道酸化病毒核心对于RNP的膜融合和释放是必要的(5,6). M1蛋白还具有RNP结合功能，调节RNP向细胞核的运输，在细胞核中可以发生病毒基因产物的复制和转录，随后也可以将RNP运输到发生病毒组装的质膜(7). NA糖蛋白是一种受体去卵巢酶，可从潜在受体中清除唾液酸，并可能在病毒的进入和退出中发挥作用(8). 中性pH构象下HA三聚体的高分辨率x射线晶体结构(9)，HA蛋白水解片段的低pH构象(10,11)和NA四聚体(12,13)提供了对这些蛋白质功能的分子理解。

进一步了解病毒的生命周期需要对超微结构进行3D研究，以确定控制病毒自组装的特定分子相互作用。此外，细胞进入过程中对膜融合和病毒粒子分解至关重要的超微结构变化仍有待描述。快速冷冻玻璃化流感病毒的电子冷冻显微镜(14–17)显示了病毒粒子结构本身的对比，而不是染色分布的对比，染色分布也可能扭曲或破坏病毒结构。然而，由于流感病毒的多形性，对其结构组织的理解仍然很困难。电子冷冻断层摄影术可用于直接确定多形病毒粒子的结构，尽管其分辨率受到累积辐射损伤和倾斜系列限制角度的限制。

在本研究中，我们研究了流感病毒丝状形态的结构基础。丝状形态是流感病毒临床分离株的典型形态，而在许多实验室传播的流感毒株中观察到球形形态(18,19). 利用已知持续丝状表型的流感病毒（A/Udorn/72）所显示的惊人结构规律(20)我们将冷冻水化病毒的电子冷冻断层扫描与高分辨率投影图像分析相结合，以阐明流感病毒的结构组织。我们发现M1蛋白形成一个螺旋，与丝状Udorn病毒的均匀圆柱形结构相关。病毒粒子的极性组织在基因组的包装和周围包膜的结构中都很明显，并且根据与我们获得的非丝状流感A/Aichi/68 X-31的图像和断层图的比较，通常适用于流感病毒。我们还通过电子断层扫描研究了酸处理的Udorn病毒，以在内体的低pH值下成像病毒的超微结构，并观察到与病毒形态变化相关的基质层的结构重组。

结果

pH值为7时冷冻水化流感病毒（H3N2）的冷冻显微镜检查。

图1显示了通过平面内旋转排列的Udorn和X-31病毒粒子的图像库，以强调共同特征。

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图1。

在单个层析场中记录的冷冻水化甲型流感病毒的层析切片。(A类–G公司)A/Udorn/72来自单个字段的病毒，如所示图S1A类和电影S1.病毒A类与中的相同B类，但已手动着色以指示与RNP（红色）、多层线圈（蓝色）、NA（紫色）和HA（绿色）相对应的特征。(K（K）,L（左）、和M（M）)图中所示为A/Aichi/68 X-31单场病毒图S1b和电影S2。的负染图像(H（H）)HA玫瑰花结（绿色HA三聚体模型插图）(我)NA花环（紫色NA头部结构域四聚体模型插图），以及(J型)从X-31纯化的RNP。红线用于比较RNP长度。紫色弧线D类和K（K）表示一端的典型NA簇。

乌多恩病毒粒子(图1A类–G公司)，记录在单个视野的断层扫描图中（断层扫描图电影S1和图S1A类)，显示出扩展的形态，有胶囊状颗粒（圆柱形，两端各有一个半球形帽），通常长度约为120 nm，还有更长的丝状颗粒，包括一些长度超过1μm(图S2). 病毒粒子的长轴通常位于薄冰膜的平面上，但一些较小的囊状病毒粒子的轴相对于平面倾斜。丝状颗粒显示出约55 nm的均匀直径（从脂质双层测量），而较短囊状颗粒的平均直径在59 nm处稍宽。有一种趋势是病毒粒子像一串香肠一样端到端地结合在一起(图S3).

X-31病毒(图1K（K）–M（M）,图S1B类和S4系列、和电影S2)仅显示偶尔的长丝状颗粒，但与之前的冷冻显微镜研究相比(16)，我们观察到更多的部分是具有半球端的长椭球体。图像显示，145个粒子中有87个沿着一个轴被拉长了1.5倍以上。X-31病毒粒子比圆柱形Udorn病毒粒子宽（从双层测量平均直径70 nm）。

病毒粒子的外膜含有表面糖蛋白，膜下有致密的基质层。RNP在许多病毒体内可见。丝状Udorn病毒表明RNP是一端固定的组件的一部分，内部的其余部分通常是空的。一些粒子似乎缺少内部RNP段，但仍保持圆柱形形态。因此，形态完全由基质层和病毒包膜维持，不需要RNP。

RNP是组件的一部分，该组件正好安装在基质层的内径内，并在基质层进入半球形帽时逐渐变细。在丝状颗粒中，两个RNP比其他RNP延伸得更远（总长度约为100 nm），并且在长度上与阴性染色显微镜观察到的最长纯化RNP片段相似(图1J型). 这些可能暂时归属于序列最长的基因组片段1和2。RNP似乎只与组件锥形端的矩阵层接触；它们不会沿其长度与基体层相互作用或定期接触。一些较短的病毒粒子刚好足够长（120 nm）来包装最长的、直的RNP片段。

虽然Udorn粒子可以更清楚地观察到病毒粒子内RNP组装的程度和不对称性，但X-31病毒粒子内的RNP排列非常相似(图1). 然而，X-31病毒粒子比Udorn短，因此RNP完全从一端延伸到另一端，并遵循基质层和膜的椭圆形轮廓，但仍然没有进行规则的接触。因此，X-31 RNP组件似乎比Udorn组件略宽。

观察到的表面糖蛋白与其已知的晶体结构相匹配(图1). 四聚体NA比HA三聚体（13 nm）稍长（从膜上测得14 nm），显示出较低的密度，更接近膜，与窄柄一致，但目前还没有x射线晶体结构。虽然NAs可能在病毒表面的任何地方都能找到，但Udorn病毒的层析图显示，NAs聚集在病毒粒子的末端，与RNP附着的末端相反(图1). 在单个Udorn图像中，一端的NA聚集也很明显（168个病毒粒子图像中有72个图像的一端有3个以上的NA可见）。X-31的断层扫描也显示NA聚集在病毒粒子的半球端(图1)单个图像显示87个病毒粒子中的44个中有簇（至少3个NA），其中25个病毒粒子显示簇位于病毒粒子的一端。由于分子重叠可能会使投影结构的解释复杂化，因此层析成像可以最有力地证明一端的聚集，丝状Udorn粒子的层析成像现在显示，发现聚集的一端与RNP附着的一端相反。

图2A类显示了Udorn病毒粒子在散焦条件下的图像，该散焦条件可以解析双层和相邻的基质层。密度线穿过双层，可能是HA的跨膜区域。图2B类和C类显示了其中菠萝蛋白酶消化去除了大部分糖蛋白层的乌多恩病毒粒子。这些显示了基质层的清晰视图，显示了向双层的薄投影，这在其进入半球盖的位置也很明显。双层中的密度线可能是HA跨膜区域，在糖蛋白去除后仍与基质层接触。由于糖蛋白外结构域之间的距离使得它们彼此不接触，这意味着糖蛋白的间距可归因于与底层基质层的相互作用。

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图2。

乌多恩病毒的低剂量图像。(A类)pH 7和(B类和C类)菠萝蛋白酶消化后。

流感Udorn基质蛋白形成螺旋。

基质层是一个空心圆柱体，在图像和层析图中具有周期性特征。由于辐射损伤限制了层析成像的分辨率，我们分析了低剂量图像中的这些周期性特征(图3A类)，在投影中提供更高分辨率的信息。衍射图案（傅里叶变换）(图3C类)从图像中计算出的结果表明，最大值沿层线出现，表示螺旋组织。38°处的强层线对应于从水平方向略微倾斜的螺旋的螺距（尽管不同的图像采用不同的角度）。通过变换的噪声滤波获得的图像(图3B类)包括层线数据只揭示了与圆柱形基质层螺旋对称性相关的周期模式，与从蛋白质水解片段的生物物理数据和晶体结构衍生的类似于M1的维度亚单位一致(21–26). 它的外观与分离M1蛋白期间获得的线圈的阴性染色图像相似(26). 因此，基质层的螺旋成分是M1蛋白的组织，尽管其他病毒或宿主蛋白可能与基质层相关。虽然是一个直径约为500º的空心圆柱体，但螺旋线的长度至少为12º，表明其为刚性结构。

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图3。

丝状流感A Udorn显示基质蛋白的螺旋结构。(A类)病毒粒子的图像。(C类)膜（黑箱）内面积的傅里叶变换A类表示螺旋形组织。晶格（红色）显示螺旋线一侧产生的突出反射。38°反射来自一个7起点螺旋。(B类)双面后获得的图像(上部)和单边(下部)中变换的滤波C类在三层线和赤道上（用右边的黑色勾号表示）。

以特定离焦值记录的图像显示了基质层的条纹，这些条纹受到膜内半径的限制，并且在进入半球盖区域时直径不断变窄(图2B类和C类和图S3A类). 这些观察结果与M1形成球形螺旋一致，但不可能评估极点附近的详细分子排列。螺旋体以前在被破坏病毒的阴性染色研究中被发现(27).

偶尔出现的丝状X-31病毒粒子和椭球状粒子的傅里叶变换确定了与乌多恩观察到的基质层相似的38°间距，尽管顺序较低(图S4)，这可以在图像中直接看到。基质层的椭球形状与M1的螺旋形状一致，其半径由膜半径决定。病毒的形状和宽度表现出更大的多样性，仍然表明M1蛋白具有类似的局部平坦2D晶格，这与M1能够以大范围的曲率聚合一致。先前描述的A/WSN/33的M1蛋白（K102A）突变，通过反向遗传学获得，将非丝状菌株转化为丝状表型(28). 在图S5，我们表明K102A在38°处显示出一条强层线，表明基体层的螺旋对称性与Udorn相似。因此，螺旋结构与M1蛋白的特定序列相关。

矩阵层中的结构转换。

为了研究内体中遇到的低pH值时病毒结构的变化，我们对酸处理或酸处理后再经胰蛋白酶处理的冷冻水化Udorn病毒进行了成像。胰蛋白酶去除HA分子的HA1残基28–328，这些HA分子经历了低pH诱导的构象变化，如果存在这种变化，则极难观察单个糖蛋白。胰蛋白酶处理后残留的分子三聚体HA2部分(10)之前已显示(29,30)其N端融合肽和C端跨膜区插入病毒膜的构象。外结构域看起来像一个薄柄，带有一个膜状的远端球结，与未改变的HA和NA截然不同。

断层扫描切片(图4和电影S3)图中显示了酸处理、胰蛋白酶处理的乌多恩病毒区域，与未经处理的pH7病毒相比，其形态范围更广。有丝状和球形颗粒，混合形态颗粒，还有一些可能是聚变事件的产物。酸诱导的形状变化与以前的研究一致，但丝状表型使这种变化显得更为剧烈(31). 大的球形颗粒可能代表失去了长丝状形状的颗粒，而较小的球形颗粒则可能是以前的胶囊状颗粒。在电影S4，三个囊泡结构的膜被经历低pH相关形态变化的相邻病毒粒子扭曲成泪滴形状。

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图4。

层析成像（也显示在电影S3和S4系列)显示在pH 4.9下酸处理10分钟和中和后胰蛋白酶处理10分钟后的冷冻水化A型Udorn流感病毒的部分。

当在层析图中观察内部病毒结构时，很明显，丝状形态的丧失与膜下高度组织化的基质层的分解有关。观察到的球形病毒粒子图像图5A类显示了含有HA2糖蛋白的解析的脂质双层（已经发生了低pH诱导的构象变化），并且没有相邻的基质层。相反，丝状病毒图5B类有一个基质层与脂质双层相邻且几乎不可从脂质双层中溶解，大多数HA保持中性pH构象。我们观察到丝状形态的丧失、基质层的破坏和HA糖蛋白的构象变化之间的相关性。

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图5。

酸和胰蛋白酶处理的病毒的多层螺旋库。(A类)多层螺旋轴垂直于图像和分辨膜的球形病毒粒子。(B类)丝状颗粒显示完整的基质层和基质层剥落膜，形成多层线圈。(C类)显示分层结构的小线圈。(D类)垂直于轴的多层线圈，显示薄膜附着。(电子)附在薄膜上的多层线圈的侧视图。(F类)与相同的线圈电子向下轴查看。

丝状颗粒显示基质层从病毒粒子的内侧剥离。球形颗粒中没有杂乱无章的基质层，而是具有大而致密的卷曲结构，通常在小范围内与膜相关，在膜附近仍有完整的基质层(图5D类和电子). 在丝状颗粒中，可以看到基质层从膜上脱落，这表明螺旋状基质层的几股结合以及球形颗粒中观察到的向紧密卷曲结构的转变。

在部分破坏的病毒粒子上，负染显微镜观察到了类似的螺旋结构(27)并不是Udorn菌株独有的。单幅图像和断层照片显示，它们是一个直径不同的卷曲结构，典型的节距为110度，壁厚，内部中空(图5D类和电子). 当线圈的轴线沿着断层图的垂直方向时，最容易看到线圈的多层结构(图5A类和C类)，其中线圈的壁由几层组成，每层的厚度与螺旋矩阵层相似。垂直于线圈轴投影的傅里叶变换(图S6)显示36º和45º的间距，类似于M1在晶体结构中N末端畴的3D堆积中观察到的间距。

有人建议，这些密集的螺旋结构（在pH7病毒制剂中也偶尔可见）由RNP片段的排列组成(16). 在这张层析图中可以看到密集线圈的大多数粒子中，自由RNP片段清晰可见(电影S4). RNP类似于pH值为7的丝状颗粒，以及分离和纯化RNP制剂中的RNP(图1J型). 它们不再作为一个包裹在病毒的一端。有些确实似乎通过一端和密集的线圈有关，但它们是独立的、不同的结构。通过菠萝蛋白酶消化或巯基乙醇处理破坏病毒糖蛋白层也可以促进基质层转化为具有相同转化特性的多层线圈(图S7). 未经胰蛋白酶处理而进行酸处理的Udorn颗粒图像也显示出丝状形态的丧失、基质层的破坏以及多层致密卷曲结构的存在(图S8). 我们无法辨别单个糖蛋白的形状，可能是由于HA1结构域的紊乱。

讨论

丝状流感病毒颗粒的结构组织为其组装提供了模型。我们已经证明，基质层的高度有序螺旋组织与丝状和囊状Udorn流感病毒的圆柱形形态有关。此前，M1基因片段已被确定为丝状形态的遗传决定因素(20,28,32,33). 尽管有报道称M1蛋白单独对病毒样颗粒（VLP）的形成至关重要，并且能够形成细胞内管(34)现在看来，病毒膜蛋白是出芽所必需的(35). 螺旋提供了一种特殊的结构机制，通过这种机制，M1亚单位可以被添加到刚性组件中，从而驱动质膜上的芽生。基质层和膜组分之间的规则相互作用表明，膜糖蛋白的募集将M1螺旋的形成与通过膜的出芽结合起来。

通过染色塑料切片的电子显微镜获得的细胞出芽的丝状流感颗粒图像表明，在出芽病毒的顶端和病毒膜的远端发现了RNP集合(36). RNP组件可能是萌芽的重要触发因素。M1螺旋在RNP组件的附着点附近成核，随后的聚合过程驱动丝状病毒离子萌发。RNP可能会影响周围基质层的宽度，并在夹缩发生之前确定病毒粒子的最小长度。

Udorn M1蛋白的序列可能通过稳定基质层中的特定螺旋接触而赋予丝状表型(28). Udorn颗粒的长度变化可能反映了M1螺旋的延伸与芽的完成（“掐掉”）和释放之间的竞争。端到端关联产生的“串珠”结构，让人想起其他脂质发达病毒中萌芽的缺陷(37)，可能反映了这种竞争。与液泡分选途径相关的细胞因子与多个病毒家族的病毒出芽和释放有关，其中一些可能形成蛋白质组合，调节掐断所需的物理收缩(38). 目前尚不清楚是什么宿主因子调节正粘病毒的出芽(39,40)，但宿主因子如肌动蛋白和病毒M2蛋白可能有助于丝状表型(20,41,42).

典型的X-31基质层的椭球形状可以被认为是两个螺旋结构，类似于Udorn病毒半球帽中的螺旋结构，但没有中间的圆柱形区域。X-31基质层的形状反映了由于与Udorn M1的序列差异，X-31 M1蛋白没有强烈的固有螺旋或圆柱形聚合，并且可能受到RNP组件或膜的形状的影响。M1蛋白在具有广泛曲率的2D晶格中聚合的能力是流感病毒多形性的重要基础，反映了使用相对较小的构建块来构建具有大半径的结构。

M1螺旋聚合驱动的出芽可能导致病毒膜中HA和NA的分离，通过M1和HA细胞质结构域之间的特定接触或通过排除显示头部结构域之间横向相互作用的NA簇来招募HA(图1我，NA玫瑰花饰）。NA簇可能通过将基质层延伸与糖蛋白募集和芽延伸解耦联而导致夹缩。HA和NA的细胞质域都会影响颗粒形状(43,44). 膜微域（如“筏”）被认为将HA集中在出芽部位(45). 也有报道称，在缺乏基质蛋白的情况下，VLP表达HA和NA(35)，但我们假设它们不具备此处所述的由M1螺旋聚合和糖蛋白募集驱动的轴向组织。

病毒包膜糖蛋白的组织可能具有功能意义。HA糖蛋白晶格的刚度、曲率半径和规则间距可能对受体结合和膜融合提供特定的几何约束。虽然以前已经描述过病毒表面的NAs聚集(16,46)我们观察到在RNP对面的病毒粒子末端聚集，靠近宿主细胞膜的释放点，并且聚集的方向使得神经氨酸酶活性位点定位为水解宿主细胞表面的受体，这可能反映了受体破坏的局部需求(46). NA酶活性抑制剂导致病毒在宿主膜上停滞或聚集。锚定在膜上的NA抑制剂可以靶向该作用位点。

在内体低pH值下培养的病毒中，丝状形态的丧失、基质层的分解和HA的构象变化之间存在相关性。我们观察到，螺旋状基质层在低pH值下与病毒膜分离，形成一种替代的、稳定的组装体，这里描述为多层螺旋。我们还发现了这种卷绕转变的中间结构。除了M2离子通道外，病毒内部的酸化可能是HA融合肽插入病毒膜的结果。由于多层螺旋也可以在中性pH下形成，特别是当糖蛋白被破坏时，低pH不是其形成的必要条件，而是基质层与膜协同分离的结果。低pH值下基质层的分解可通过暴露膜双层的裸露斑块或允许糖蛋白自由运动形成融合复合物来促进膜融合。通过M2离子通道酸化病毒离子内部可提高流感病毒与脂质体之间的膜融合速率(5). 基质的分解和相关的形态学改变也有助于从病毒粒子顶端附着的组件中释放单个RNP片段。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

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