预测和验证沿微血管排列的细胞作为肝再生中恢复组织结构的顺序原则

破坏和再生过程的量化。

接下来，我们定义了过程参数来量化再生过程。这些数据包括：（i）肝小叶内BrdU的空间掺入模式，作为细胞增殖的衡量标准；（ii）小叶切片中的细胞数量，作为小叶质量的衡量标准，（iii）中央坏死的面积，以及（iv）肝细胞-类核细胞接触面积，定义为肝细胞表面与相邻窦接触的百分比，作为小叶结构的测量。这些过程参数由CCl中毒后0、1、2、3、4、8和16天的光学显微镜图像和共焦激光扫描确定₄（1.6克/千克体重）。在我们的数学模型中，BrdU掺入模式被用作确定增殖模式的输入参数。中央坏死区与存活的肝细胞明显区分，CCl后1-2天最大₄管理(图2G公司)，此时小叶内的平均肝细胞密度最小(图2F类). CCl后2–3天，肝细胞中BrdU掺入达到峰值₄管理(图2E类). 增殖肝细胞在小叶上的分布不均匀，优先发生在死亡细胞区附近的肝细胞层(图2E类). 细胞层的顺序在图2地下二层（有关详细信息，请参阅SI附录). 中心周围肝细胞标志物谷氨酰胺合成酶（GS）短暂下降；mRNA表达、免疫染色和酶活性分析检测的影响(图S1–S3). 这表明中央周围肝细胞的破坏和再生动力学与先前报道的观察结果一致(1,4). 坏死区的巨噬细胞数量增加，并伴随CD68 mRNA的增加(图S4). 这可能解释了死亡细胞团迅速消失的原因。一些观察结果与破坏和再生过程相一致。其中包括ATP含量的短暂下降(图S5)以及白蛋白、CYP3A11和BSEP（ATP结合盒，B亚家族，成员11）mRNA表达（导致肝功能分化的因素）；甲胎蛋白和泛素mRNA表达的短暂增加(图S1); 以及所分析肝脏的宏观外观(图S6). 在8天内，中央坏死区被封闭(图2 一–D类和G公司)平均肝小叶肝细胞密度恢复(图2F类). 一旦中央死细胞区再生，就很难在组织学上识别中央静脉，而相邻切片的GS免疫染色可以看到中央静脉(图2A2类). 值得注意的是，正弦网络的结构基本上不受CCl的影响₄(图4F类). 为了量化肝小叶的微结构，我们测量了肝细胞-类脂质体和肝细胞-肝细胞接触面积。通过比较健康肝脏和肝癌组织，验证了该测量值(图1F类). 在正常肝脏中，35.8±2.3%（平均值±标准差）的肝细胞表面与其他肝细胞接触，48.5±2.5%与肝窦接触。在肝癌中，接触面积分别为48.1±3.6%（与肝细胞）和39.1±2.3%（与血窦），表明肝肿瘤中肝细胞与血窦的接触显著减少（非配对t检验：p=0.0015），肝细胞与肝细胞的接触相应增加。由于这两种测量方法是互补的，我们只考虑了血液和肝细胞之间发生代谢物交换的肝细胞-类脂质接触区。此外，在CCl后的再生过程中₄损伤后，肝细胞-类脂质接触暂时减少，第2天最低，随后恢复到第16天(图2H（H）).

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图4。

CCl后窦状细胞存活于肝小叶中央死细胞区₄中毒并激活tie-2启动子。(一)三重转基因tie-2报告小鼠的构建。(B类)未经治疗的tie-2报告小鼠的肝组织。绿色荧光（EGFP）表明静脉内皮细胞中的tie-2启动子活性为阳性（右上图中的白色箭头）。CD31免疫染色显示窦状细胞（左下方图像为淡红色），DAPI显示细胞核（右下方图像为蓝色）。合并后的图片（左上角图像）显示静脉内皮细胞而非窦细胞表达EGFP（黄色）。(C类)和(D类)CCl后两天₄给药后，一些正弦细胞开始表达EGFP。(C类)EGFP绿色荧光和(D类)绿色、红色和蓝色融合了荧光。中央死细胞区的特征是细胞核丢失和红色背景荧光增强。中心死肝细胞区内的大部分正弦细胞存活并开始表达EGFP，作为tie-2启动子活性的报告者。三维重建小叶(E类)在和之前(F类)CCl后₄行政管理。随着肝细胞（蓝色）死亡，窦状细胞（灰色）基本上保持完整。

时空仿真模型的建立。

在测量了肝损伤期间和之后肝脏结构的三维变化后，我们建立了一个单肝小叶的数学模型，模拟CCl治疗后16天的过程₄模型的基本单位是单个肝细胞和窦。我们将每个肝细胞建模为单个均匀、各向同性的弹性和粘附物体，能够迁移、生长、分裂和死亡。肝细胞之间、肝细胞和窦状细胞之间、以及肝细胞和细胞外基质之间的相互作用采用先前验证的力模型进行建模(5). 它包括细胞表面受体粘附产生的细胞间中心力和细胞压缩和变形产生的排斥力。肝细胞运动由每个肝细胞位置的随机运动方程建模。该方程包括在每个时间点施加在肝细胞上的所有力以及模拟肝细胞微运动的随机项。正弦网络的每个正弦曲线都被建模为一系列以其可扩展性为特征的链接球体。正弦网络的末端固定在中央静脉和门周野处。它的运动模式与肝细胞相似，但没有微动性。我们的数学模型由可测量的生物物理和细胞生物学参数参数化（有关详细信息，请参阅SI附录). 此外，我们还考虑了形态发生基因通过血液进入肝小叶或由靠近中央静脉的坏死细胞分泌的可能影响。我们迭代开发了我们的最终模型，该模型是由与中的工艺参数的直接比较驱动的图3 D类–F类。有关时空仿真模型、所用变量和模型参数的详细描述，请参见SI附录我们考虑了两种初始配置：（i）通过平均26个肝小叶的结构参数生成的代表性肝小叶，以及（ii）根据特定共焦数据集重建的具体肝小叶以避免平均可能产生的伪影。对于中所示的代表性初始配置图3C类肝细胞-类固醇接触面积为肝细胞表面的51±1.2%，接近48.5±2.5%的实验值。请注意，这些参数不能直接调整，因为它们完全由架构参数决定。

最初的分析是从一个模型变量（模型1）开始的，该变量在以前的研究中被成功用于定量模拟体外生长细胞群的生长动力学(6). 在模型1中，我们假设细胞分裂的随机方向，缺乏影响细胞运动方向的形态原，以及肝细胞与其他肝细胞的非特异性均匀各向同性粘附(图3一和电影S1). 尽管该模型与平均肝细胞密度的实验结果一致(图3D类)，这并不能解释实验观察到的再生过程的动力学，因为中央坏死病灶的闭合太慢(图3E类). 此外，肝细胞-类固醇接触面积与实验数据不一致(图3F类). 我们通过在一系列生理参数上运行模拟来验证这一发现，这些生理参数改变了细胞的微动性、肝细胞-肝细胞和肝细胞-淀粉样黏附、肝细胞与肝细胞以及肝细胞-基质摩擦，并改变了肝细胞和窦状体的生物物理特性。例如，微动性的强烈增加导致肝细胞脱离，个别迁移至坏死病灶(SI附录). 然而，在我们的实验中没有观察到单个细胞从再生前沿脱落。因此，微动性不得超过肝细胞分离并单独迁移到损伤部位的阈值。我们的结论是，在缺乏引导肝细胞迁移到坏死区的机制的情况下，如果不导致单个肝细胞分离，就无法以必要的速度关闭病变。我们测试了形态原和机械力梯度引导肝细胞向坏死区迁移的能力。

此外，我们引入了各向异性的细胞间粘附效应，因为肝细胞是极性的，顶端或胆管侧朝向邻近肝细胞，基底外侧血侧朝向窦状细胞。我们改进了模型中的细胞间粘附，使相邻的极性肝细胞仅在其顶端形成粘附键(SI附录). 最佳数据拟合是通过模型（模型2）获得的，该模型将极性肝细胞与微运动性结合在一起，微运动性偏向坏死区域的方向，从而引导细胞迁移。模型2(图3B类和电影S2)与肝细胞密度的实验观察结果一致(图3D类)并成功模拟了再生动力学(图3E类). 只要局部机械梯度或形态梯度都只影响坏死病灶边缘2-5个细胞的层厚，则可能会导致微运动的偏差。我们发现，如果一个小叶中的所有肝细胞都受到影响，小叶的结构就会扭曲。我们模拟了中央坏死区死亡或濒临死亡的肝细胞分泌细胞因子或通过血液运输细胞因子引起的梯度影响。然而，这些模型变化都无法成功恢复小叶微结构(图3F类). 16天后，代表性模型2显示肝细胞-类固醇接触面积仅为37.1±1.1%，显著低于实验情况（48.5±2.5%）。

肝细胞沿着窦状细胞排列是恢复肝脏微结构的关键机制。

因为模型1和模型2都不能完全解释实验观测数据，所以我们在模型中加入了另一种机制，即HSA。如前所述，在HSA过程中，来自细胞分裂的子代肝细胞沿着最近的正弦排列，这样连接两个子代细胞中心的线与最近正弦的局部方向平行。窦状体可能有助于再生肝细胞定向的第一个实验证据来自我们的tie-2报告小鼠。给予CCl后窦状细胞存活₄，甚至在几乎所有肝细胞死亡的小叶中心区域。然而，由于窦状细胞非常薄，因此在制备石蜡切片并用常规技术染色时，中央死细胞团中的窦状细胞很容易被忽略(图S7). 我们首先在tie-2启动子控制下EGFP表达的tie-2报告小鼠的中央死细胞团中发现了它们的存在(图4一和SI附录). 相对较高比例的正弦细胞，尤其是在死细胞区，表达EGFP(图4 C类和D类和图S8). 这一结果表明，死肝细胞区的正弦细胞存活，但可能受到应激，并开始显示tie-2启动子活性，已知其参与血管重塑(7). 为了可视化正弦网络的状态，我们用ICAM抗体对正弦细胞进行免疫染色，并在CCl后2天在健康肝脏中重建网络₄管理。虽然正弦网络显示出一定程度的破坏，但基本网络结构仍然完好无损(图4 E类和F类). 对肝细胞和肝窦细胞数量的分析表明，大多数肝窦细胞存活下来，即使在几乎所有肝细胞都被CCl破坏的中心区域也是如此₄(图S9). 这促使我们研究正弦细胞在再生过程中可能发挥作用的假设，并将HSA机制纳入我们的模型。因此，我们找到了模型3(图3C类和电影S3)与包括肝细胞密度在内的所有实验观察结果非常一致(图3D类)和再生动力学(图3E类). 此外，16d后小叶结构恢复，肝细胞-类固醇接触面积为50.4%，与实验情况相符（48.5±2.5%）(图3F类).图3C类示出了具有模型3的典型计算机模拟。总之，我们的模型模拟强烈表明HSA可能是肝脏结构再生的关键机制。根据敏感性分析，我们的模型预测，子细胞沿最近的窦状细胞排列必须在细胞分裂后最长2小时内发生。

图像处理和分析。

为了从共焦图像中重建和分析正弦网络，应用了复杂的图像处理链。我们使用自适应直方图均衡化（AHE）、形态学算子和中轴变换类过程将正弦网络几何表示为3D中的无向图，这使我们能够研究正弦网络的特性。类似的图像处理链包括AHE、中值滤波、，基于Voronoi空间分解的细胞形状重建为研究肝细胞特性奠定了坚实的基础。有关详细信息，请参阅SI附录.

我们感谢G.Schütz博士和U.Deutsch教授分别提供Alfp小鼠和tie-2驱动小鼠。本研究得到了BMBF（联邦教育和研究部）网络HepatoSys（项目0313081A和0313081F）以及（欧盟）项目CancerSys（HEALTH-F4-2008-23188）和Passport（编号：223894）的支持。我们将这项工作献给我们的合著者亚历山大·鲍尔，他在博士答辩前不久去世，以纪念他的宝贵贡献。