了解组织在发育过程中彼此分化的机制对于了解如何有效利用干细胞至关重要。在小鼠发育过程中，植入胚泡由滋养层（TE）、原始内胚层（PE）和外胚层（EPI）组成。在发育的这个阶段，单个细胞已经受到谱系限制，但能够分化为该谱系中所有更专业化的细胞(1). 一旦由谱系特异性转录因子网络建立，每个祖细胞的转录记忆可以通过表观遗传修饰来维持(2). 因此，遗传因子和表观遗传修饰物如何相互作用来调节谱系决定，是干细胞研究人员和发育生物学家的一个重要目标。大量表观遗传修饰物的靶向缺失已被证明会导致谱系特异性基因的异位表达和着床期致死，这表明表观遗传程序的建立和维持对早期发育至关重要(三——5)。
永久干细胞系可以来源于小鼠胚泡中存在的三种组织谱系，并被用作体外模型来研究早期谱系祖细胞的调节。这些细胞系包括胚胎干细胞(6,7)，滋养层干细胞(8)和胚胎外内胚层干（XEN）细胞(9). 所有三种干细胞都可以在体外自我更新，但在体外和体内以适合谱系的方式分化和贡献(8——10). 在干细胞建立期间，将这些祖细胞从其胚胎环境中分离出来后，这一过程的表观遗传调控可能为维持谱系身份提供了一种优雅的机制。在组蛋白修饰水平上观察到染色质的年龄特异性差异(11,12). 组蛋白标记的这些谱系特异性差异是否影响转录调控，并参与谱系祖细胞的建立或维持尚不清楚。因此，比较来自小鼠胚泡的三个谱系的组蛋白甲基化状态至关重要。
ES细胞的自我更新依赖于维持适当的表观遗传调控，包括核小体重塑和DNA和组蛋白的修饰(2,4,13). 特别是，由活性成分（如组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3））和抑制成分（如组蛋白H3赖氨酸27三甲基化，H3K27me3）异常共存组成的二价结构域，修饰已被证明在ES细胞发育重要基因的推定调控位点中过度表达，与其他细胞类型相比(14——16). 这些发现导致了这样的预测，即二价结构域可能通过保持发育基因在分化过程中处于激活状态而促进ES细胞的多能性。然而，介导H3K27me3的Polycomb组（PcG）蛋白对于维持ES细胞的多能性和谱系潜能是不可或缺的，但在分化过程中需要精确控制基因表达(17——19). 总之，这些研究表明，PcG介导的表观遗传抑制可能调节发育过程中细胞命运的转变。然而，胚胎外谱系已被证明在许多表观遗传途径上不同于多能性胚胎谱系。X染色体失活发生在所有谱系中，但在胚胎外细胞中都有父亲印记，并且特别依赖PcG蛋白Eed来维持失活状态(20,21). 印迹基因表达的表观遗传调控在胚胎和胚外谱系之间也有所不同，组蛋白修饰独立于DNA甲基化维持胚外细胞的印迹(22,23). 胚胎和胚外谱系之间的表观遗传状态也存在全球差异。胚胎外细胞的DNA甲基化水平低于胚胎细胞(24,25). 然而，最近比较TS和ES细胞启动子甲基化的全基因组研究表明，大多数差异可能位于非基因区域(26). 此外，免疫细胞化学显示，与EPI相比，TE中几种组蛋白修饰水平较低，包括H3K27me3和组蛋白H3赖氨酸9乙酰化（H3K9ac）(11,12). 组蛋白标记的这些谱系特异性差异是否影响转录调控，并参与谱系祖细胞的建立或维持尚不清楚。因此，在基因特异性水平上比较来自小鼠胚泡的三个谱系的组蛋白甲基化状态仍然是一个重要目标。为此，我们检测了ES、TS和XEN细胞中活性和抑制性组蛋白修饰的全基因组位置。我们的结果表明，激活修饰H3K4me3在三种干细胞类型中具有相似的作用，但相比之下，抑制修饰H3K27me3在丰度和全基因组分布上有所不同。我们发现TS和XEN细胞中很少有启动子以H3K27me3标记，因此H3K4me3/H3K17me3二价结构域不是所有囊胚衍生干细胞的共同表观遗传特征。同样重要的是，确定这些表观遗传学机制是在体外选择干细胞自我更新过程中产生的，还是真正反映胚胎中早期谱系祖细胞的状态。使用载体chomatin免疫沉淀法（cChIP），我们能够证明ES细胞中的二价结构域存在于早期小鼠胚胎的多能干细胞中。然而，胚胎中胚胎外祖细胞的表观遗传状态并不能完全反映胚胎外干细胞系。这些研究表明，组蛋白修饰机制可能在早期胚胎谱系之间存在差异，并强调了检测体内和体外祖细胞的重要性。
结果
双价结构域在TS和XEN细胞中并不常见。
为了比较胚胎干细胞和胚外干细胞的组蛋白甲基化状态，我们检测了ES、TS和XEN细胞中活性和抑制性组蛋白修饰的全基因组位置(). 我们进行了天然染色质免疫沉淀（ChIP），以分离与H3K4me3或H3K27me3修饰组蛋白相关的DNA，并使用Illumina基因组分析仪对其进行测序。独特的阅读被映射到基因组(图S1A类). 根据随机化模型的定义，基因组区域超过阈值信号(27)，被归类为组蛋白修饰显著增强（详细信息见SI方法). 重要的是，我们的ES细胞数据与之前发表的研究非常相似(图S1B类)(16)。
全基因组组蛋白状态分析显示ES（R1）、TS（A4）和XEN（F4）细胞之间H3K27me3的差异。(A类)用于检测早期小鼠胚胎谱系祖细胞组蛋白修饰的实验方法概述。箭头表示用于ES、TS和XEN细胞衍生的组织来源，虚线箭头表示具有相同发育谱系的细胞。（巴，100μM）(B类)对19号染色体的分析表明，TSS中1kb内的类似数量的区域在ES、TS和XEN细胞中含有H3K4me3峰。相反，TS和XEN细胞中H3K27me3峰的数量较低，与ES细胞相比，这些峰位于TSS 5 kb范围内的比例较小。(C类)基因组中被H3K4me3、H3K27me3、H3K4me3和H3K17me3修饰或两者都不修饰的基因启动子的数量。与ES细胞相比，TS和XEN中H3K27me3标记的启动子更少。基因进一步细分为有或无CpG岛的基因。尽管TS和XEN细胞中H3K4me3/H3K27me3标记基因的数量很低，但基因本体分析表明，这类基因参与器官发育、染色质组装、代谢过程和细胞周期(图S7). (D类)H3K4me3相对于最近的TSS的分布揭示了ES、TS和XEN细胞（ES、，n个=13131个基因；TS、，n个= 11,637; 氙气，n个= 10,660). H3K27me3相对于最近的TSS的分布表明，H3K17me3仅定位于ES细胞的启动子区域（ES，n个=2320个基因；TS、，n个= 104; 氙气，n个= 171).
在ES、TS和XEN细胞中检测到H3K4me3位置的许多相似性。特别是，在所有三个细胞系中都检测到类似数量的测序峰，约40%的峰位于转录起始点（TSS）的1kb范围内(). 此外，H3K4me3在每种细胞类型中标记了相似数量的基因()，与TSS位于同一位置()，并且与高基因表达水平相关(图S1C类和D类). 对于所有三种细胞类型，没有CpG岛启动子的基因往往缺乏H3K4me3，并且通常在较低水平上表达(和图S1D类)。
相反，TS和XEN细胞中的H3K27me3与ES细胞不同。最引人注目的是，与ES细胞相比，TS细胞中的测序峰数量低7倍，XEN细胞中的低5倍(). 虽然ES细胞中约40%的峰位于TSS的5 kb范围内，但这一类别仅包括TS和XEN细胞中约10%的峰(). 这些发现影响了H3K27me3显著标记的基因总数：TS细胞为0.6%（104/18025个基因），XEN细胞为0.9%（171/18025），ES细胞为13%（2320/18025）(). H3K27me3在TS和XEN细胞中的总体分布不像ES细胞那样局限于TSS，而是在整个基因组中处于低水平(). 此外，与TS和XEN细胞相比，ES细胞中H3K27me3修饰区域的中位数宽度更大（2.2kb；10%的区域>5kb）（1kb；1%的区域>5 kb）(图S2A类). 这些数据表明H3K27me3存在谱系特异性差异。
我们采取了几个步骤来确认我们在TS和XEN细胞中观察到的低H3K27me3水平不是由于技术伪影。所有样本的测序深度相似(图S1A类)错误检测算法将测序读数的总数纳入阈值计算，这表明低H3K27me3水平不是差异测序深度的伪影。这也不是因为阈值过滤器过于严格，因为我们能够处理来自胚胎成纤维细胞的原始、先前发布的H3K27me3 ChIP序列数据，并获得与已发布报告几乎相同的结果(16). 此外，基因组装箱的替代策略和ChIP测序读数的成对比较证实TS和XEN细胞中H3K27me3峰值较少。该分析还揭示了ES、TS和XEN细胞之间的背景水平和平均峰高高度非常相似，只有当三种细胞系之间的ChIP效率相同时才能预期到这一点(图S2B类——D类). 因此，细胞类型之间H3K27me3水平的差异并不是由于数据处理的假象或ChIP效率的改变，因此ES、TS和XEN细胞在抑制性表观遗传机制的使用方面似乎有所不同。
H3K27me3的低水平也会影响三种干细胞系中检测到的假定二价结构域的数量。因此，与ES细胞中的2033个基因相比，TS细胞中只有56个基因可以被归类为二价修饰基因，XEN细胞中有96个基因可以归类为二级修饰基因(). 相反，TS和XEN细胞中的大多数基因被归类为H3K4me3，而没有H3K27me3；TS细胞为62%（11248/18025），XEN细胞为56%（10135/18025）。TS细胞中的37%基因（6673/18025）和XEN细胞中的43%基因（7719/18025(). 因此，涉及H3K4me3和H3K27me3的二价结构域并不是所有囊胚衍生干细胞系中常见的表观遗传标记。
胚胎外干细胞中H3K27甲基化机制的低水平。
Western blot分析证实，与ES细胞相比，TS和XEN细胞H3K27me3在全球范围内含量较低(). 为了了解胚胎外干细胞H3K27me3水平较低的原因，我们检测了组蛋白甲基化核心机制的转录水平、蛋白质丰度和酶活性。H3K27的甲基化由典型的Polycomb抑制复合物2（PRC2）催化，该复合物包含核心成分Suz12、Eed和Ezh2(28——31). 逆转录-qPCR（RT-qPCR）显示伊德与ES细胞相比，TS和XEN细胞中的mRNA显著减少（约65%）(P（P）<0.02，学生的t吨测试；). 之前已经表明伊德会破坏PRC2的稳定性并导致Ezh2蛋白的损失(32,33). 我们的Western blot分析与此一致，显示与ES细胞相比，TS和XEN细胞中几乎完全没有Eed和Ezh2蛋白(). 类似地，与ES细胞相比，TS和XEN细胞中检测到的非经典PRC2成分Ezh1水平较低，这表明Ezh1的稳定性可能依赖于与功能性PRC2复合物的结合(). 相反，Suz12和Polycomb抑制复合物1（PRC1）成分Rnf2在所有三种干细胞类型中检测到的水平相似(). 此外，与ES细胞相比，TS和XEN细胞中与H3K27总甲基化和H3K27me3相关的组蛋白甲基转移酶活性显著降低2.1至3.4倍(P（P）<0.05，学生的t吨测试；). 总之，这些数据表明，较低的Eed水平可能导致胚胎外干细胞中功能性PRC2水平较低。相反，与ES细胞相比，两种不同组蛋白H3K4甲基转移酶在TS和XEN细胞中的表达水平要么没有变化，要么更高(). 此外，ES、TS和XEN细胞之间H3K4甲基转移酶活性没有显著差异()。
PRC2在胚胎外干细胞中的表达和活性较低。(A类)Western blot分析表明，TS（A4）和XEN（F4）细胞中H3K27me3的整体水平低于ES（R1）细胞。在三种类型的干细胞中检测到H3K4me3和H3K9me3的水平相似。未修饰组蛋白H3用作负荷对照。(B类)PRC2组分水平的qRT-PCR分析鄂尔多斯1,鄂尔多斯2,苏西12、和Eed公司; PRC1部件，雷诺数2和两个H3K4甲基转移酶，M1级和灰烬1数据表示三个生物重复的平均值加SD。对于每种干细胞类型，分析两个独立的系。星号表示与胚胎干细胞相比具有统计学上的显著差异，P（P）<0.05（学生的t吨测试）。(C类)Western blot分析表明，与ES（R1）细胞相比，TS（A4）和XEN（F4）细胞中PRC2组分Eed、Ezh1和Ezh2的表达较低。Suz12和Rnf2的表达水平相似。β-肌动蛋白作为负载对照。(D类)与ES（R1）细胞相比，TS（A4）和XEN（F4）细胞中的总H3K27和H3K27me3-特异性组蛋白甲基转移酶活性显著降低。总H3K4或H3K4me3特异性组蛋白甲基转移酶活性未检测到显著差异。数据表示三个生物重复的平均值加SD。对于每种干细胞类型，分析两个独立的细胞系并将数据合并。星号表示与胚胎干细胞相比具有统计学上的显著差异，P（P）<0.05（学生的t吨测试）。
接下来，我们通过评估TS和XEN细胞中的H3K27me3标记招募适当蛋白质介导转录抑制的能力，来检查其功能是否等同于ES细胞中的H3K27me3标记，尽管其数量有所减少。H3K27me3标记由PRC2沉积，通过招募PRC1在ES细胞的二价结构域发挥作用，PRC1将潜在的启动子维持在稳定的转录状态(34——36). 利用ChIP-qPCR，我们检测了TS和XEN细胞中H3K27me3标记基因背景以上PRC2组分Ezh2和Eed的结合，表明H3K17me3在胚外干细胞中保持活跃(). 相反，在TS和XEN细胞中，PRC1组分Rnf2的结合很低或可以忽略不计()尽管其水平与ES细胞相似()这表明TS和XEN细胞中的H3K27me3标记在功能上并不等同于ES细胞中的二价结构域。TS和XEN细胞中检测到的结构域与ES细胞中的PRC1阴性结构域相似，这表明H3K27me3的保留较差，与功能抑制相关性较差(34). 总之，这些数据表明，H3K27me3不是未分化胚外干细胞的主要标志，这表明替代的表观遗传修饰必须参与转录抑制。
TS/XEN细胞和ES细胞之间PRC1结合的差异。(A类——D类)在一组候选基因启动子上使用ChIP-qPCR研究H3K27me3在TS和XEN细胞中招募下游介质的能力。我们包括H3K27me3修饰和未修饰的启动子，这些启动子是通过全基因组分析确定的。该小组还包含在ES细胞中分类为PRC1阳性的二价启动子(Irx1型,深度x3,Tcfap2a型,长x2,Npas2型,千兆字节1,Msx1型,Tbx2型,Gata6公司、和Sox17系列)和PRC1-阴性(Pik3r3型,Prtg公司、和诺斯特林)(34). 积极的(霍克斯9和磅5f1)和负片(Gapdh公司和Kcnq1其他1)包括H3K27me3的对照启动子(61). 在TS（A4）和XEN（F4）细胞的H3K27me3修饰启动子中检测到Ezh2和Eed结合高于背景水平。然而，无论H3K27me3、Ezh2或Eed状态如何，仅在低水平或可忽略的水平检测到下游介体Rnf2的结合。由于我们无法识别TS和XEN细胞中与Rnf2结合的启动子，我们使用Cdx2ES（R1）细胞中的启动子作为阳性对照（用黑条表示）(34). 数据表示三个生物重复的平均值加SD。虚线表示使用非特异性对照抗体测定的平均背景水平的2倍（背景数据如图S8A类)。
H3K9me3标记TS和XEN细胞中的转录抑制基因。
鉴于H3K27me3修饰启动子在TS和XEN细胞中的普遍性较低，我们接下来采用了一种候选方法来确定胚胎外干细胞中可能的替代性抑制修饰。
我们最初检测了DNA甲基化，但使用两种不同的实验方法，我们发现没有证据表明这种修饰提供了调节TS细胞基因转录的补偿机制。首先，整合全基因组DNA甲基化数据集(26)我们的全基因组组蛋白甲基化数据显示，大多数DNA甲基化水平高的基因缺乏组蛋白甲基标记，并且受到转录抑制：ES细胞67%（746/1108基因），TS细胞66%（1141/1734）(图S3). 经H3K4me3修饰的ES和TS细胞中不到7%的启动子具有较高的DNA甲基化水平(图S3; 锿：n个=4451个基因，TS：n个=6586），并且这些启动子在分化时不是优先诱导的，如果DNA甲基化可以补偿稳定调节基因中H3K27me3的缺失，则可以预测(P（P）> 0.2, χ2测试，1 df；数据集S1). 其次，我们使用焦磷酸测序来量化TS细胞分化时诱导或抑制的基因启动子处的DNA甲基化水平。TS细胞分化后，基因启动子的DNA甲基化水平基本保持不变，与基因表达水平的变化无关(图S3C类). 总之，这些数据表明，DNA甲基化并没有为TS细胞的表观遗传抑制提供一种补偿方法。
接下来，我们检测了与转录抑制染色质相关的四种替代组蛋白修饰，包括H3K9me2、H3K9me3、H3K79me3和H4K20me3。我们通过ChIP-qPCR在TS细胞分化过程中诱导或抑制的基因中检测这些标记。其中，只有H3K9me3与基因表达的变化呈负相关(). 在诱导的九个基因中，有八个在TS细胞分化后H3K9me3降低，这对其中五个基因具有统计学意义(P（P）<0.05，学生的t吨测试，P（P）其他三个基因<0.3；). 此外，在TS细胞分化过程中被抑制的所有五个基因都显示H3K9me3增加，这对其中三个基因具有统计学意义(P（P）<0.05，学生的t吨测试，P（P）<0.08和P（P）其他两个基因<0.3；). 这些结果通过一个独立的TS细胞系得到了证实(图S4A类)。
在TS细胞分化过程中，H3K9me3与基因转录呈负相关。(A类)qRT-PCR分析显示，与未分化TS细胞相比，分化TS细胞中成熟mRNA转录物的表达发生了翻倍的变化（对数2标度；TS细胞系A4）。作为参考，基因根据TS细胞分化时表达状态的变化进行分组：诱导（绿色）、受抑制的胚外因子（红色）和受抑制的胚胎因子（黄色）。Gapdh公司,千立方英尺1、和霍克萨9（蓝色）启动子提供控制区域(46,61). 数据表示三个生物重复的平均值加SD。ChIP实验表明(B类)H3K9me3和(C类)TS（A4）细胞分化期间伴随基因转录的H3K4me3。虚线表示使用非特异性对照抗体测定的平均背景水平的2倍(图S8B类). 星号表示未分化和分化的TS细胞之间存在统计显著差异，P（P）<0.05（学生的t吨测试）。数据表示三个生物重复的平均值加SD。使用另一个TS细胞系（G3）进行了相同的实验，得到了非常相似的结果(图S4). (D类)连续ChIP实验证实H3K4me3和H3K9me3在未分化TS（A4）细胞中共存。Cdx2和Gapdh公司在TS细胞和磅5f1和Gapdh公司已知ES细胞中只被H3K4me3修饰，并作为H3K9me3免疫沉淀特异性的对照。虚线表示平均背景水平的2倍，第一次免疫沉淀中使用抗H3K4me3，第二次免疫沉淀使用非特异性对照抗体测定(图S8C类). 数据表示三个生物重复的平均值加SD。
有趣的是，我们对TS细胞中候选基因ChIP的分析表明，某些启动子可能同时被活性H3K4me3和抑制性H3K9me3组蛋白修饰标记(). 为了测试这些标记是否出现在同一染色质片段上，我们进行了顺序ChIP分析，其中染色质首先用一种抗体进行免疫沉淀，然后用第二种抗体进行额外的免疫沉淀。与对照样品相比，我们检测到富集约10倍，表明在所分析的三个启动子中，TS细胞中大多数含有H3K4me3的染色质也被H3K9me3修饰(和图S4A类). 该富集值与ES细胞中已知二价结构域的序列H3K4me3/H3K27me3 ChIP的富集值相似（约12倍；图S4B类). 与TS细胞相比，我们在ES细胞中没有检测到H3K4me3/H3K9me3共修饰的富集()。
受我们在TS细胞中的观察结果的鼓舞，我们在XEN细胞中的一组候选启动子上检测了H3K4me3/H3K9me3结构域的存在。我们在XEN细胞中转录抑制但在胚胎外内胚层谱系的分化细胞中表达的基因的三个启动子处检测到H3K4me3和H3K9me3均高于背景(图S4C类)(37). 序列ChIP证实这些修饰在XEN细胞的同一染色质片段上共存（约为对照组的11倍；图S4D类). 综上所述，我们发现H3K9me3与TS和XEN细胞中转录抑制的启动子相关，并且使用顺序ChIP表明某些启动子在同一染色质区域被H3K4me3和H3K9 me3修饰。
世系发展中的表观遗传状态。
为了了解ES、TS和XEN细胞的表观遗传状态是在体外选择干细胞自我更新过程中出现的，还是真正反映了体内谱系祖细胞的状态，我们检测了从早期小鼠胚胎显微解剖的组织中候选启动子区的组蛋白甲基化水平。我们将重点放在早期植入后胚胎上，因为这些组织代表了获得来自早期EPI、TE和PE的同质未分化谱系祖细胞的最佳阶段(1,38)足够的数量以允许检查基因特异性组蛋白修饰。由于从这些植入后早期阶段分离谱系祖细胞的技术困难，再加上每个胚胎内的细胞数量较少，这些组织以前没有进行过基因特异性组蛋白修饰的检测。
我们选择使用cChIP进行分析，该分析旨在分析小细胞样品中的组蛋白修饰(39). 我们在胚胎第E5.5天对胚胎进行显微解剖，以分离EPI、胚外外胚层（ExE）和内脏内胚层（VE）(图S5A类)对组织进行基因表达RT-qPCR分析，并进行cChIP-qPCR，以分析基因特异性H3K4me3和H3K27me3。在平行实验中，我们对同等数量的ES、TS或XEN细胞进行相同的分析，为小规模研究提供阳性对照。
多能性EPI的cChIP分析表明，谱系特异性转录活性基因的启动子，如磅5f1（也称为10月4日)，用H3K4me3而不是H3K27me3修改(). 编码发育调节因子的基因，如Cdx2,Gata6公司,霍克萨7、和Sox17系列在ES细胞中二价修饰的，在EPI中似乎是二价的，具有高H3K4me3和H3K27me3(). 此外，我们从这些基因中检测到低或可忽略的mRNA转录(). 总的来说，EPI和ES细胞中大多数被检测基因的组蛋白状态非常相似。一个区别是H3K4me3标记纳米在ES细胞中高表达，在EPI中低表达，这与纳米ES细胞与EPI的比较()。
小鼠早期胚胎谱系祖细胞组蛋白修饰分析。(A类)cChIP实验检测EPI和ES（R1）细胞(左侧); ExE和TS（A4）电池(中部); VE和XEN（F4）细胞(赖特). 基因名称显示在每列的底部，包括已知的谱系特异性转录因子(磅5f1,纳米,Cdx2,脱中胚蛋白,Gata6公司、和Sox7指数)，ES细胞中已知的二价基因(Cdx2,Gata6公司,霍克萨7、和Sox17系列)和具有完全分化细胞类型特征的基因(Gata1公司,项目3b1、和载脂蛋白C2). 使用的抗体针对H3K4me3（绿色）和H3K27me3（红色）。虚线表示使用非特异性对照抗体测定的平均背景水平的2倍(图S8D类). 平均值加SD表示两个生物复制。选择性ES、TS和XEN细胞系的cChIP分析显示出类似的结果(图S5C类). (B类)每种细胞类型对应的mRNA表达水平。值表示相对于参考组织的百分比（在SI方法). 每个值代表两个生物复制的平均值。
在来源于TE的ExE细胞中，磅5f1和纳米笔录上保持沉默。cChIP透露磅5f1启动子被H3K27me3修饰纳米启动子几乎不富集H3K4me3或H3K27me3(). 转录活性基因Cdx2和脱中胚蛋白H3K4me3高而H3K27me3低(). 有趣的是，这些基因在ExE中是沉默的，但在后期发育中由专门的胎盘细胞表达(深度x3,长hx2、和Irx1型)似乎在ExE中标记为二价，高H3K4me3和H3K27me3(). 这与TS细胞中相同的基因启动子形成对比，后者具有高H3K4me3和低H3K27me3()，根据我们的全基因组ChIP分析预测，并使用替代TS细胞系进行证实(图S5C类)。
在VE细胞中，来自PE，磅5f1和Cdx2启动子以H3K27me3标记，这与它们的低表达水平一致(). 已知内胚层基因，Gata6公司,Sox7指数、和Sox17系列虽然与两个XEN细胞系中的相同基因相比，该标记的水平较低(和图S5C类). 与VE相比，这些内胚层基因在XEN细胞中的表达水平更高，这与它们的组蛋白状态一致()。
鉴于TS细胞分化过程中H3K9me3水平的变化，我们接下来使用cChIP来研究体内滋养层细胞分化期间H3K9 me3的基因特异性水平。E6.5的胚胎为该分析提供了理想的材料，因为处于该发育阶段的胚胎外组织在ExE中包含未分化的滋养层细胞，在外胎盘锥（EPC）中包含分化的滋养层细胞。重要的是，这些组织在基因表达水平上显示出可复制的变化，类似于我们的TS细胞分化系统(和图S5B类)。
小鼠早期胚胎滋养层细胞分化过程中H3K9me3的分析。(A类)qRT-PCR分析显示，与ExE（未分化滋养层）相比，EPC（分化滋养层细胞）成熟mRNA转录物的表达发生了翻倍变化（log 2标度）。(B类和C类)cChIP实验揭示了H3K9me3和H3K4me3在(B类)ExE和(C类)EPC。一般来说，在滋养层细胞分化时诱导的启动子(深度x3,Irx1型,Tcfap2a型,诺斯特林、和电子病历1)与EPC和ExE相比，H3K4me3增加而H3K9me3减少。Kcnq1其他1用作阳性对照(46). 平均值和标准差来自两个生物重复。(D类)cChIP实验表明ES细胞中已知的二价基因(Cdx2,Gata6公司、和Sox17系列)或在TS细胞中以H3K4me3/H3K9me3标记(深度x3,长x2,Irx1型、和Prtg公司)EPI中H3K9me3未修改背景水平以上（用虚线表示）。印记基因Kcnq1其他1用作阳性对照(22,23). 平均值和标准差来自两个生物重复。下面显示的是相对于在。
cChIP分析显示滋养层组织中许多启动子的H3K9me3水平高于背景值。检测到H3K9me3水平升高Sox2系统,Cdx2,脱中胚蛋白、和埃斯勒布与ExE相比，EPC中的启动子区域与其在分化滋养层细胞中的低表达水平一致(). 我们还检测了EPC中表达水平高于ExE的基因。一般来说，它们的启动子在ExE中被H3K4me3和H3K9me3修饰()而EPC中相同的启动子往往表现出较高的H3K4me3和较低的H3K9me3水平(). 这些结果概括了TS细胞分化过程中组蛋白甲基化水平的变化，表明组蛋白标记的这种构型可能在体内外滋养层祖细胞之间保持不变。
接下来我们研究了E6.5胚胎组织中的H3K9me3水平。EPI的cChIP分析表明，ES细胞和外胚层中已知的二价基因，以及本研究中显示的TS细胞中标记为H3K9me3的基因，在背景水平以上没有H3K9 me3修饰的组蛋白(). 一个例外是霍克萨7标记为H3K4me3和H3K9me3。作为霍克萨7EPI中未检测到mRNA()，这些表观遗传修饰可能反映了不寻常的表观遗传标记霍克斯多能干细胞中的基因(15,40). 虽然我们在EPI中通过cChIP检测的大多数启动子中没有检测到H3K4me3和H3K9me3，但最近的研究表明，这两种修饰可能在ES细胞中H3K4me3/H3K27me3二价结构域的子集上重叠(41)。
在EPI中的特定基因和ES细胞中检测到双价H3K4me3/H3K27me3标记，表明在小鼠早期发育中存在二价结构域。ES细胞与植入前和植入后阶段胚胎的胚胎谱系之间似乎存在表观遗传连续体，因此在所有这些细胞中，H3K4me3和H3K27me3在全球和基因特异性水平上都非常丰富。此外，我们发现在植入后胚胎的胚外谱系中检测到高基因特异性水平的H3K27me3，但在TS和XEN细胞中检测不到相同的基因启动子。由于全球H3K27me3水平在植入前阶段胚胎的TE和PE中较低(11)(图S6A类)这些数据表明，组蛋白甲基化的囊胚状态可能在TS和XEN细胞中得以保留，但在这些谱系的植入后衍生物中得以重置。总之，我们的结果表明，在胚胎和胚外祖细胞中建立了不同的组蛋白甲基化机制，从而确定了早期胚胎谱系之间表观遗传状态的重要差异。
讨论
我们在此对小鼠胚胎发生过程中形成的前三个谱系的体内祖细胞和体外干细胞进行了详细的表观遗传学检查。
首先，我们证明了H3K4me3、H3K27me3和H3K9me3标记通常与体内外三个谱系中的基因表达状态相关，这与之前的报告一致，该报告检查了培养囊胚内细胞团和TE的其他改变(39)。
其次，我们发现一组编码发育调节因子的特定基因在体内多能干细胞和体外ES细胞中用H3K4me3和H3K27me3进行了二价标记。重要的是，在EPI中没有检测到这些基因的成熟mRNA转录物，这表明与ES细胞类似，二价标记是抑制性的(14,15). 来自EPI（ES细胞和外胚层干细胞）的多能干细胞类型保留二价结构域表明，这种表观遗传构型可能是胚胎祖细胞的保守特征(14——16,42,43). 然而，我们的研究表明TS和XEN细胞是不同的，因为二价H3K4me3/H3K27me3结构域似乎不参与调节其未分化状态或分化。以前的一份报告表明，关键调控基因的H3K4me3/H3K27me3状态可能足以描述发育承诺和潜力(16). 虽然这对某些祖细胞来说可能是真的，但我们的研究现在表明，替代的表观遗传修饰可能在其他早期发育的祖细胞中发挥作用。
第三，H3K27me3囊胚外谱系在全球范围内较低(图S6A类)(11)这反映在TS和XEN细胞中。然而，这与植入后阶段的胚胎外组织形成了对比，我们检测到H3K27me3的高基因特异性水平。我们对这些观察结果提供了两种解释。植入后不久，胚胎外谱系中可能会出现H3K27me3沉积波，TS和XEN细胞代表此事件之前的细胞类型。与此相一致，我们检测了H3K27me3在植入后胚胎中的全局定位，并在胚胎和胚外细胞中检测到H3K17me3(图S6)(44). 这种甲基化事件，与伊德转录(44)可能有助于谱系承诺或建立新的表观遗传标记模式。这类似于植入前发育期间发生的从头DNA甲基化(45). 为了支持这一假设，胎盘印迹基因在E4.5和E7.5之间的滋养层中获得了不同的组蛋白标记，TS细胞在这一事件之前显示出一组表观遗传学标记(46). 另一种解释是，尽管植入前全球H3K27me3在胚胎外谱系中含量较低，但这些组织中仍可能存在H3K17me3标记的基因，并且这些标记在植入后仍然存在。然而，这些标记可能在TS和XEN细胞衍生和繁殖过程中丢失。这种改变类似于ES细胞衍生过程中一些抑制性组蛋白标记的松弛(39)也与滋养层祖细胞和TS细胞之间的表观遗传差异一致(22). 也许表观遗传抑制的丧失是将胚胎中的短暂谱系祖细胞转化为稳定的、自我更新的干细胞系所必需的。
第四，我们确定H3K9me3是早期滋养层发育中的一个抑制性组蛋白标记。结合我们的H3K27me3数据，这些发现为发育过程中存在谱系特异性组蛋白修饰提供了支持。虽然已知H3K9me3和Polycomb蛋白结合之间的拮抗作用表明组蛋白状态可能取决于H3K9 me3和H3K27me3的相对水平，但如何确定这些差异尚不清楚(47,48)。
小鼠功能丧失研究表明，胚胎外组织的形成和功能需要大量的表观遗传修饰物(49). TS细胞中H3K27me3的缺失似乎不会影响其未分化状态，但滋养层细胞严重减少伊德显示次生巨细胞形成缺陷(50,51). 同样，其他H3K27me3通路成分的突变会导致胎盘发育缺陷，尤其是鄂尔多斯2,苏西12、和雷诺数2突变体均显示羊膜和绒毛膜形成异常(52——54). 因此，H3K27me3介导的表观遗传抑制可能对建立专门的转录程序至关重要，而不是维持未分化的滋养层状态。这与我们在未分化TS细胞中检测到的H3K27me3标记基因的低流行率一致。尽管H3K9组蛋白甲基转移酶的靶向性缺失，但胚胎外干细胞中H3K9-甲基化的功能需求尚未见报道公式2(G9a公司)导致绒毛尿囊融合不完全和妊娠中期死亡(55). 此外，Suv39小时-空的成纤维细胞自发变成多倍体(56)提出了一种有趣的可能性Suv39小时-介导的H3K9me3可能参与二倍体滋养层前体多倍体滋养细胞巨细胞的形成。进一步详细描述不含H3K27和H3K9修饰物的胚胎外干细胞类型应有助于解决表观遗传机制在维持未分化状态和向特殊细胞类型过渡中的作用。
总之，我们的研究证实了这样的预测，即每个早期谱系的转录记忆很可能通过对关键调控因子的表观遗传修饰来维持，但表明修饰的特异性可能是谱系特异性的。
方法
组织样本。
使用的小鼠为ICR和B5/EGFP(57). 在适当的时间点从定时自然交配中收集胚胎。按照说明进行组织分离(42). 本研究中使用的ES、TS和XEN细胞系为雄性，低传代（<15），每个细胞核具有40条染色体的模式数，并在没有饲养细胞的情况下培养，如SI方法所有实验均在ES细胞系R1、TS细胞系A4和XEN细胞系F4上进行，并由文中所示的替代细胞系（ES细胞系E14TG2a、TS细胞株G3和XEN电池系F3）提供额外的确认。
炸薯条。
如前所述，执行天然（未固定）ChIP以分析组蛋白修饰(58). 使用ChIP分析试剂盒（Millipore）分析甲醛交联染色质。按说明进行顺序ChIP(59)除第一个洗脱缓冲液含有20 mM DTT外，洗脱的染色质在RIPA缓冲液中稀释50倍，用于第二次免疫沉淀。cChIP按说明执行(39)使用DNA纯化试剂盒（Qiagen）提取结合和未结合样品的DNA，并进行qPCR分析。详细协议如所述SI方法Illumima测序由加拿大温哥华BC癌症机构基因组科学中心进行。对于每种干细胞类型，对每个抗体的一个ChIP DNA样本进行测序。样品处理和初始原始数据处理如所述进行(27)。
基因表达分析。
使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）处理来自细胞系的RNA。使用TRIzol（Invitrogen）从胚胎组织中提取RNA，按照从少量组织中分离RNA的方案，每个样品中含有0.2μg无RNase LPA（Sigma）。使用SuperScript II（Invitrogen）逆转录RNA，并对cDNA进行qPCR。数据标准化为嗯引物靶向cDNA序列中的多个外显子(表S1). 对于微阵列分析，扩增100 ng总RNA，并将其与小鼠基因1.0 ST阵列（Affymetrix）杂交。这项服务由加拿大多伦多儿童医院应用基因组中心提供。
