美国国家科学院院刊。2010年6月15日；107(24): 10996–11001.
来自封面
大脑中Ndufs4缺失导致的复合物I缺乏导致类似Leigh综合征的进行性脑病
,a、，1 ,a、，1 ,b条 ,c（c）和a、，2
阿尔伯特·金塔纳
一华盛顿大学霍华德·休斯医学院和生物化学系，西雅图，WA 98195；
谢恩·克鲁斯
一华盛顿大学霍华德·休斯医学院和生物化学系，西雅图，WA 98195；
拉杰·卡普尔
b条西雅图儿童医院实验室，西雅图，华盛顿州98105；和
埃里森达·桑兹
c（c）华盛顿大学药理学系，西雅图，WA 98195
理查德·帕米特
一华盛顿大学霍华德·休斯医学院和生物化学系，西雅图，WA 98195；
一华盛顿大学霍华德·休斯医学院和生物化学系，西雅图，WA 98195；
b条西雅图儿童医院实验室，西雅图，华盛顿州98105；和
c（c）华盛顿大学药理学系，华盛顿州西雅图98195
理查德·帕尔米特（Richard D.Palmiter）撰稿，2010年5月5日（2010年4月22日送审稿）
作者贡献：A.Q.、S.E.K.和R.D.P.设计的研究；A.Q.、S.E.K.、R.P.K.和E.S.进行研究；A.Q.、S.E.K.、R.P.K.和E.S.分析数据；A.Q.、S.E.K.和R.D.P.撰写了这篇论文。
1A.Q.和S.E.K.对这项工作做出了同等贡献。
- 补充资料
支持信息
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摘要
为了探索Ndufs4敲除（KO）小鼠中复合物I缺乏的致死性共济失调表型，我们选择性地灭活了神经元和神经胶质细胞中的Ndufs4（NesKO小鼠）。NesKO小鼠表现出与KO小鼠相同的症状，包括生长迟缓、运动能力丧失、呼吸异常和~7周死亡。随着疾病的发展，特定大脑区域的进行性神经元退化和胶质增生与行为变化相对应，早期涉及嗅球、小脑和前庭细胞核。神经元，尤其是这些脑区的神经元，线粒体形态异常。受影响脑区caspase 8而非caspase 9的激活暗示着外源性凋亡途径的启动。有限的caspase 3激活和坏死细胞死亡的超微结构特征表明受影响神经元从凋亡转变为坏死。这些数据表明，特定脑区的功能失调复合物I导致胶质细胞的渐进性激活，从而促进神经元死亡，最终导致死亡。
关键词：小脑、线粒体、胶质增生、神经变性、前庭核
神经病理通常由功能失调的线粒体引起，Leigh综合征（LS）是一种常见的临床表现型(1). LS或亚急性坏死性脑病是一种进行性神经退行性疾病(2)影响40000名活产中的1名(三). LS被认为是最常见的婴儿线粒体疾病，大多数患者在1个月前出现症状(4,5). 最近还报道了几例成人型LS病例(6–10). MRI等体内成像技术显示LS患者基底节、丘脑、黑质、脑干、小脑白质和皮层、脑白质或脊髓的双侧高信号病变(6,11–14). 病变通常与胶质增生、脱髓鞘、毛细血管增生和/或坏死有关(10,15). LS患者的行为症状可能包括（具有多种临床表现）发育迟缓、张力减退、共济失调、痉挛、肌张力障碍、虚弱、视神经萎缩、眼球或眼睑运动缺陷、听力障碍、呼吸异常、构音障碍、吞咽困难、发育不良、，和胃肠道问题(4–6,16,17). 大多数LS病例的死亡原因尚不清楚，缺乏研究疾病进展和死亡原因的遗传模型阻碍了适当治疗的发展。LS（以及大多数由线粒体功能障碍引起的疾病）的预后很差；没有治愈方法，治疗往往无效(5). 因此，这种疾病的小鼠模型应能更好地研究脑病的潜在机制，并能更容易地研究潜在的治疗方法。
结果
神经系统中缺乏Ndufs4的小鼠类似于完全敲除。
所有细胞中均缺乏Ndufs4（Ndufs4KO）的小鼠发展出复杂的表型，并在出生后第50天死亡（P50）(18). 至少有一只完整的老鼠恩杜夫斯4等位基因与WT小鼠无明显区别，有时可与WT作为对照（CT）互换使用。为了检查中枢神经系统在病理学中的作用，我们限制了恩杜夫斯4通过将基因杂交到神经元和星形胶质细胞恩杜夫斯4液氧/液氧表达Cre重组酶的小鼠雀巢基因座(19)创建我们称之为NesKO鼠标的鼠标。我们确认了雀巢Cre通过将小鼠与Rosa26-reporter系杂交以及对从不同器官分离的DNA进行PCR分析，主要在中枢神经系统中导致重组(图S1A类). 这些数据与已知的雀巢在小鼠大脑中，心脏、肾脏、肺、胰腺和睾丸中的一些细胞类型的水平较低(19).
NesKO小鼠脑内复合物I活性降低。
从肝脏和大脑中制备丰富的线粒体，以测量呼吸能力。NesKO或CT小鼠肝脏分离的亚线粒体颗粒（SMP）中检测到正常的鱼藤酮敏感复合物I活性；然而，与CT相比，NesKO脑组织中SMP的复合物I活性很低或不存在(图S1B类). 复杂I相关O2与CT小鼠相比，NesKO小鼠脑组织的消耗量降低了约50%，而复杂II和IV活性未受影响(图S1C类和D类). 复合物I活性的丧失与小鼠的年龄无关。NesKO小鼠的这些结果与在全部KO小鼠大脑中观察到的结果相同(18).
KO和NesKO小鼠几乎相同的表型。
NesKO小鼠的表型与总KO小鼠相似(18). 到出生后第21天（P21），大多数NesKO小鼠小于对照同窝小鼠，在~P30时达到最大体重~12 g(图S1E类). NesKO小鼠的静息体温为~2o（o）P30后C低于控制(图S1F类). NesKO小鼠偶尔会出现白内障、上睑下垂或视神经萎缩。即使它们的眼睛看起来正常，通过莫里斯水迷宫、视觉悬崖测试和视觉定位测试，这些小鼠的视力也经常有缺陷(图S1克). 然而，即使是视力有缺陷的KO小鼠也能区分光明和黑暗(图S1H（H）). 从P35开始，NesKO小鼠出现了严重的共济失调：它们的腿张开，对有力的轻推反应迟钝，扶正缓慢且笨拙，有时会变得非常不稳定，以至于失去平衡并摔倒。与CT小鼠相比，大于P40的NesKO小鼠无法在7 mm宽的壁架上保持平衡，阴性趋地性试验失败，试图用尾巴悬吊后腿，并很快从旋转杆上跌落(图S1我). NesKO小鼠非常顺从，即使在因处理、剪尾进行基因分型或对脚趾捏夹做出反应而受到压力时，也很少发声（脚趾捏夹试验中的发声百分比：WT，91.7%，n个= 12,P（P）< 0.0001; NesKO和KO，18.0%，n个= 50,P（P）< 0.0001). 一些NesKO小鼠出现自发性强直-阵挛性癫痫发作（约1/20 NesKO和KO小鼠），而其他小鼠则因处理而出现癫痫发作（大约1/10 NesKO和KO鼠），且癫痫发作频率随疾病进展而增加。早在第14页就检测到间歇性呼吸异常，包括换气不足或过度换气，但最常见的是呼吸活动。在P35和P50之间，NesKO小鼠开始减肥，共济失调加剧，不久后死亡。NesKO小鼠和完全KO小鼠的表型之间唯一的显著差异是，后者表现出球杆毛生长的外源期和下一个毛发周期的生长期之间的滞后时间，导致约7天的时间内没有毛发或色素(18)NesKO小鼠的毛发周期正常。KO和NesKO小鼠表型的广泛总结见表S1.
行为表型的进展。
在确定Ndufs4 KO病理学的主要特征是神经起源后，我们开始定义受Ndufs丢失影响的大脑区域，并将大脑中的病理变化与行为表型的进展相关联。根据体重增加、体温、运动技能和活动的各种测量值、触觉反应和躯干卷曲（而不仅仅是年龄）建立评分系统，以解释不同小鼠表型的异步进展。我们的12分计分系统(表S2)将KO或NesKO小鼠分为疾病进展的早期（1-4分）、中期（5-8分）或晚期（9-12分）。这些研究是用KO和NesKO小鼠进行的。处于疾病早期（P18–P26）的KO小鼠体重和体温接近正常，没有出现后肢紧抱，只出现轻度共济失调。中年小鼠（P26–P38）的静息体温通常下降约2°C（Tb条)自发低温（>10°C Tb条减少）事件，共济失调增加，在尾部悬吊期间躯干和后肢弯曲，体重停止增加。晚龄小鼠（通常>P38）表现出严重的共济失调，嗜睡，T降低>2°Cb条自发低温（>10°C Tb条减少）事件和体重不稳定，并且对操控反应变弱。
KO小鼠神经病理学研究进展。
H&E染色的脑切片显示，在疾病早期（<P26），CT和KO小鼠之间没有任何明显差异。然而，晚期（>P38）NesKO和KO小鼠脑干前庭核（VN）内有明显的空泡化（海绵状变性），而CT小鼠没有这种现象(). 下橄榄（IO）、顶核（FN）、小脑蚓部尾侧（结节和悬雍垂）和嗅球（OB）也有类似变化。此外，如层粘连蛋白免疫染色所示，KO和NesKO小鼠的VN和小脑后部血管与CT小鼠相比显著增加(). 伴随血管增殖，在一些晚期KO小鼠的脑干和偶尔的中脑中检测到出血灶，更常见的是在NesKO小鼠中(图S2A–C).
NesKO和KO小鼠的真空化和血管增殖。(A类)CT动物脑切片H&E染色未见病理改变(n个= 5). (B类和C类)相比之下，两款新款NesKO(B类,n个=5）和KO(C类,n个=5）小鼠VN出现明显空泡化（黑色箭头；插入显示指示区域的放大倍数较高），小脑深部核（白色箭头）的放大倍数较小。(D–F型)通过层粘连蛋白染色评估，NesKO中VN周围的血管增殖增加(E类)和KO(F类)小鼠与CT的比较(D类). （比例尺，A–F，125微米；插入，25微米）
星形胶质细胞和小胶质细胞反应性是神经病理学的早期共同特征；因此，我们用GFAP抗体进行免疫荧光(图S2A类–C类)和电离钙结合分子1（Iba-1），以评估受影响地区的疾病进展，并将其与所描述的行为评分相关联(表S2). NesKO冷冻脑切片(n个=5）和KO小鼠(n个=5）在不同阶段，以及CT小鼠(n个=5），进行了分析。NesKO和KO小鼠的大脑中同时出现了类似的星形胶质细胞和小胶质细胞激活模式，H&E染色切片中检测到空泡化的区域出现明显损伤。NesKO小鼠中脑出血、小脑前部胶质增生和海绵状病变的频率高于KO小鼠。CT动物没有显示星形胶质细胞活化，小胶质细胞保留了典型的非反应状态的分支形态(图S2D类和E类). 相反，在早期KO小鼠的OB和VN中检测到肥大的Iba-1阳性小胶质细胞，前者数量更多(). 中期，OB和VN中大量存在活化的小胶质细胞，具有高度反应性的形态学改变（肥大、增厚、短突起），并出现在小脑蚓部的后小叶（尤其是小叶VIII-X）、小脑深部核和IO/巨细胞/外侧网状区（IO/Gi/LRt）中(). 在晚期动物中观察到强化的小胶质细胞活化，那里有密集的浸润，特别是在OB的球周外丛状层()、小脑后蚓部和检测到明显组织损伤的内侧/外侧VN(). IO和周围区域（巨细胞区、锥体旁区；)以及小脑深部核团（FN和插入核团；，箭头）。
KO小鼠大脑中的渐进性炎症反应。(A–C)KO小鼠OB早期小胶质细胞活化(A类)，中间(B类)，或晚(C类)使用抗Iba-1抗体确定疾病的分期(D-F公司)KO小鼠小脑早期钙结合蛋白和Iba-1染色(D类)，中间(E类)，或晚(F类)疾病的阶段。(G–I型)KO小鼠早期前庭和小脑深部核团的Iba-1染色(克)，中间(H（H）)，或后期(我)疾病的严重程度。(J–L型)KO小鼠早期IO的Iba-1染色(J型)，中间(K（K）)，或后期(L（左）)疾病的严重程度。KO小鼠在疾病不同阶段（早期、中期和晚期；n个=5个）显示局部和进行性炎症反应。在早期动物中(A、 D、G、，和J型)，OB中已经存在明显的小胶质细胞激活(A类)，越南(克)和小脑深核(克，箭头）。然而，在小脑中没有可见的小胶质细胞反应(D类)或IO附近(J型). 在中期动物中(B、 E、H、，和K（K）)，在OB中观察到小胶质细胞积聚增强(B类)，越南(H（H）)小脑深部核团(H、，箭头），小脑叶(E类)、和IO(K（K）). 在晚期动物中(C、 F、I和L)，嗅叶中观察到严重的小胶质细胞激活(C类)和小脑深部核(我，箭头）。在小脑叶观察到广泛的小胶质细胞反应以及局部组织破坏(F类在受影响的肺叶中可见钙结合蛋白染色缺失）和VN(我). 相反，IO周围仅存在中度激活(L（左）). （比例尺，A–I类.125微米；J–L型，50微米）
由于小胶质细胞在炎症过程中既有积极作用，也有有害作用，因此我们利用CD11b作为吞噬性小胶质细胞的标记物，进一步阐明了小胶质细胞反应性在疾病进展中的相对贡献(图S3). 早期动物中没有CD11b阳性细胞(图S3A、 D、G、，和J型)但在中年动物的OB、小脑和VN中可见(图S3B、 E、，和H（H）). 晚期动物在所有受影响区域都表现出丰富的CD11b表达(图S3C、 F、I、，和L（左）).
KO小鼠的氧化应激、Caspase-8激活和神经细胞死亡。
神经胶质反应通常是神经细胞死亡的结果。为了证实受影响区域存在神经元丢失，在对照组和晚期KO小鼠的切片中进行了NeuN（神经元标记物）的免疫组织化学。共聚焦显微镜显示所有受累区域的NeuN阳性细胞显著减少。支持这些数据的是，量化每一区域的NeuN-阳性细胞数证实了KO小鼠小脑、OB和VN中神经元的消失().
KO小鼠受影响脑区的神经元丢失。(A–C)CT小脑NeuN标记（绿色）和Topro-3复染（红色）(A类)和后期KO(B类)老鼠。两个标签的共定位显示为黄色。(C类)NeuN-阳性细胞的定量分析；晚期KO小鼠病灶（KO病灶，代表性区域用白色矩形表示）以及小脑邻近区域（KO，黑色矩形）的细胞数量减少(B类)与CT小鼠比较(A类). *P（P）< 0.05,***P（P）与CT相比<0.001。KO小鼠受损区域Topro-3阳性/NeuN阴性细胞（可能是小胶质细胞）增加(B类) (D–F型)KO小鼠VN中NeuN-阳性细胞显著减少(E类)与CT小鼠比较(D类和F类用于量化）*P（P）与CT相比<0.05(G–I型)失去NeuN-晚期KO小鼠OB中的阳性细胞(H（H）)与CT小鼠比较(克，量化我). 在KO小鼠的OB中观察到Topro-3阳性/NeuN阴性细胞的增加(H（H）). **P（P）与CT相比<0.01。（比例尺，A–H，100μm）
为了探讨神经元死亡的机制，我们在OB（最早和最严重的受累区域）评估了蛋白质的氧化状态和两种主要凋亡途径的启动子的活性。通过羰基化合物与2,4-二硝基苯肼的衍生化以及抗体检测（Oxyblot分析），在蛋白裂解物中评估CT和中期KO小鼠的蛋白质氧化。与CT小鼠相比，KO小鼠的样品显示蛋白质氧化增加(). 未在非衍生控制中检测到信号。通过Western blot分析评估外源性和内源性凋亡途径启动子半胱天冬酶的激活。与CT小鼠相比，KO小鼠的裂解caspase-8（外源性途径的起始caspase）水平显著增加，而裂解caspase-9（内源性线粒体途径的起始caspase）的水平没有改变(). 活性caspase-8水平的增加与胶质标记物GFAP和Iba-1的显著增加相关，这表明caspase-8的激活可能是受影响区域存在炎症状态的结果。
KO小鼠的氧化应激和caspase-8 OB。(A类)CT和KO小鼠OB中蛋白质羰基化（Oxyblot）、活性caspase-9、活性caspase-8、GFAP和Iba-1水平的Western blot分析。(B类)蛋白质印迹图像的密度分析A类将每条车道的综合密度值归一化为β-actin，并相对于CT中的最低值进行表达**P（P）< 0.01, ***P（P）与CT相比<0.001。
有趣的是，除了OB的外丛状层外，几乎没有观察到caspase-3激活(图S4A类和E类)，在研究的任何时间点。此外，在KO小鼠的VN和小脑叶中仅观察到分散的caspase 3阳性细胞(图S4B、 C、F、，和克)尽管小脑蚓部VIII-X小叶和其他小叶中Purkinje细胞明显缺失（DAPI染色很容易观察到，钙结合蛋白免疫反应性缺失，伴有大量小胶质细胞浸润）(图S4D类和H（H）). 我们还通过高尔基染色检查了受累区域神经元的数量和形态，发现FN、小脑蚓部和VN中高尔基染色神经元明显减少(图S4I–N型). 晚期KO小鼠中残留的浦肯野细胞表现出异常的树突轴(图S4对和S公司)与CT小鼠比较(图S4问). Gallyas银染是神经原纤维缠结和其他包涵体的标志，在VN的大神经元中显示出显著染色(图S4O（运行）和P（P）); 同样，小脑X叶的颗粒细胞和一些浦肯野细胞也被强烈染色(图S4T型和U型). 这些结果通过另一种神经退行性变标志物——荧光翡翠染色得到了证实(图S4V–Y). Purkinje细胞死亡可能继发于小脑回路中的失调，因为选择性失活恩杜夫斯4Purkinje细胞（如方法)在8个月龄的小鼠中未导致明显的病理或行为异常。
Luxol Fast Blue染色、抗环核苷酸磷酸二酯酶或髓磷脂碱性蛋白抗血清未检测到脱髓鞘或少突胶质细胞病理学证据(图S5A–C和E–G公司). 同样，用抗外周素进行正常标记表明脑神经未受影响(图S5D类和H（H）). 在使用Fos抗血清的KO小鼠切片中未观察到明显的神经元激活。由于线粒体功能障碍可能导致ATP减少和AMP积累，我们对两只KO小鼠大脑中的磷酸化AMP激酶和磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（一种AMPK底物）进行了免疫标记，但我们没有检测到任何一种酶的激活。
KO小鼠受累脑区线粒体异常和神经元变性。
在VN、FN、OB、小脑后蚓部以及海绵状变性前的其他区域（即小脑前蚓部），KO小鼠的神经末梢中发现线粒体异常，嵴致密和/或肿胀(和图S6). 在小脑中，异常线粒体主要位于分子层中间神经元的突触前末端，包括Purkinje细胞体周围的篮形细胞()颗粒层的苔藓纤维(图S6A类). 在外侧VN和FN中，嵴塌陷的线粒体不太常见，但在神经末梢、一些有髓轴突（主要在看似健康的轴突末梢）和偶尔的神经元细胞体中观察到(图S6B、 C、，和我).
KO小鼠小脑皮质和OB的光学显微镜和EM变化。(A类和B类)光学显微镜显示颗粒（gc）、Purkinje（PC）和分子层（m）(A类)前部和(B类)后蚓部。海绵状变性（箭头）仅见于后小叶以及两个区域的血管间隙。(C类)线粒体异常，嵴致密（箭头；高倍放大D类)存在于Purkinje细胞（PC）胞体附近的突触前篮细胞神经终末。(E类)OB肾小球周围外丛状层变性的神经元细胞体（N，细胞核）明显出现细胞内水肿，胞质细胞器肿胀和溶解。(F、 插入)在更高的放大倍数下，肿胀的线粒体（m）和细胞核的一部分（N）。（比例尺，A类，35微米；B类，35微米；C类，1μm；D类0.5微米；E类，1μm；F类，1微米）
光镜下观察KO小鼠VN、FN和小脑后蚓部海绵状病变(和B类和图S6D类)与退化神经末梢的超微结构相对应(图S6B类). 在小脑蚓部，大多数病灶位于结节和悬雍垂的分子层和表面颗粒细胞层。大多数类似于肿胀的树突，树突与突触前神经末梢接触并含有退化的细胞器，或透明的细胞外间隙，充满退化神经元突起留下的颗粒和膜碎片。在小脑结节罕见的高尔基细胞中发现了细胞体变性的超微结构证据，这些高尔基细胞是FN中分散的神经元(图S6F类和克)以及OB外丛状层丰富的神经元(和图S6J型)含有膜状和颗粒状碎屑()或线粒体崩溃(图S6K–M公司). OB中与caspase-3激活和小胶质浸润部位相对应的退化神经元伴有充满溶酶体碎片的小胶质细胞(图S6N个).
恩杜夫斯4成年小鼠的基因失活。
为了确定KO小鼠发生的致命性脑病是否取决于中枢神经系统发育过程中Ndufs4的缺失，我们将其灭活恩杜夫斯4成年小鼠的基因。我们繁殖恩杜夫斯4液氧/液氧携带Cre重组酶基因的小鼠(Ubc-核心ER2)这是由三苯氧胺在大多数细胞中诱导的。这些小鼠还表达了G（t）罗莎26Sor-lacZ被Cre重组酶激活的基因。在~ P60下接受三苯氧胺治疗后，大多数（但不是全部）脑区显示报告基因的广泛表达(图S7A类和B类). 我们使用Southern blot分析来确定恩杜夫斯4基因重组：>80%恩杜夫斯4在大多数脑区重组的等位基因(图S7C类). 蛋白质印迹显示Ndufs4蛋白的丰度也大幅下降(图S7D类). 三苯氧胺治疗7个月后，小鼠出现低活性(图S7E类)在旋转木马上表现不佳(图S7F类)有时紧抱后肢，有时喘息，对缺氧没有正常反应。这些行为表型类似于完整KO小鼠的早期阶段，并与轻度胶质增生症相关(图S7B类).
讨论
Ndufs4-null小鼠的表型与线粒体基因或编码复合物I亚单位、对线粒体复合物组装重要的蛋白质或丙酮酸脱氢酶亚单位的核基因突变的人类相似。所有这些基因的突变都会损害线粒体呼吸，并导致LS的发展。LS中的复合物I缺乏症不仅限于大脑，通常也会在其他组织中检测到(4,14,20). 然而，LS患者主要经历中枢神经系统功能障碍，这反映在MRI实验和特征性症状中。同样，Ndufs4 KO小鼠出现生长缺陷、发育迟缓、体温过低、共济失调、呼吸异常和视力缺陷，所有这些都可归因于中枢神经系统紊乱。虽然有许多相似之处，但这里研究的小鼠和LS的CNS表型的显著差异是，KO小鼠的基底神经节似乎未受影响。Ndufs4基因仅在中枢神经系统失活，证实了中枢神经系统在KO小鼠表型中的主要作用。由于NesKO小鼠表现出与全身KO小鼠基本相同的表型，我们为这些小鼠的表型的神经起源提供了有力证据，并延伸至LS。然而，作为一个警告，雀巢Cre激活包括肌神经束和骨骼肌在内的其他器官中少数细胞的报告基因表达。因此，我们不能排除外周血Ndufs4缺乏对观察到的表型的微小贡献。我们尚未在KO小鼠的脊髓中观察到胶质增生，我们之前对KO小鼠进行的分析显示，肌肉组织学、生理学和代谢方面的变化很小(18); 这些结果支持脑病是KO小鼠死亡的主要原因。
缺乏Ndufs4（线粒体复合物I的45个亚单位之一）的小鼠和人类无法茁壮成长，但死亡原因尚不明确。Ndufs4不直接参与络合物I内的电子传输，但被认为在络合物的组装和/或稳定性中起着重要作用(18)并且可能发挥调节作用，因为它可以被磷酸化(21). 在没有Ndufs4的情况下形成的表型是复杂的，正如预期的那样，蛋白质可能在所有细胞中表达。假设小胶质细胞的激活是异常神经元功能的可靠标志，为什么神经病理学仅限于少数脑区，仍然是一个谜。小脑蚓部OB、VN和后小叶的神经元似乎最脆弱。虽然小脑小叶VIII、IX和X中的许多Purkinje细胞最终会死亡，但主要缺陷似乎不是Purkinje细胞本身，因为Purkinja细胞中的线粒体看起来正常，而撞击它们的神经元突起中的许多线粒体往往会皱缩嵴。此外，Purkinje细胞中选择性缺乏Ndufs4的小鼠表现出轻微的行为和神经病理学后果。这些观察结果使我们得出结论，Purkinje细胞死亡要么是因为小脑回路的失调，最有可能是小脑颗粒细胞或VN和IO的投射，要么是因为它们对缺氧过敏(22). 小脑缺陷本身就足以导致共济失调，但很少导致死亡(23–25).
我们在KO和NesKO的大脑中寻找LS样神经病理学，并将这些发现与疾病表现和进展相关联。小鼠特定脑区的光学显微镜和EM变化与行为和生理测试中表现的恶化相对应。胶质增生的程度与疾病的严重程度密切相关。随着脑干和小脑内小胶质细胞的激活和病变的出现，共济失调、体温过低和一般发病率增加。在小脑、延髓背内侧（FN和VN）以及偶尔在延髓腹侧观察到越来越严重的胶质增生，这表明这些区域的失调是KO小鼠共济失调加剧的原因。
胶质细胞激活的存在可以代表细胞死亡的原因或后果。因此，我们对KO小鼠病理学的细胞机制进行了表征。我们观察到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8在KO小鼠受累区域的激活；这种caspase启动外源性（死亡受体介导的）凋亡途径(26)提示活化的胶质细胞释放的细胞因子在神经病理学中的作用。缺乏激活的caspase-9，这是内在（线粒体）凋亡途径的主要启动子(27)进一步表明，KO小鼠的神经元死亡是由活化的胶质细胞引起的。羰基的增加表明蛋白质被活性氧物种（ROS）氧化，这可能是由胶质细胞激活引起的。然而，复杂I功能障碍本身可能有助于ROS的存在，ROS可以激活胶质细胞(28). caspase-8的激活提示细胞凋亡被启动；然而，我们在KO小鼠中没有发现caspase-3（主要效应物caspase）的显著激活。正常的ATP水平被证明是凋亡细胞死亡达到顶点所必需的(29,30)ATP耗竭导致从凋亡到坏死的转变(29–32). 因此，线粒体复合体I功能障碍导致的低ATP产生可能会消除细胞凋亡，反而导致坏死性死亡。KO小鼠受累区域的超微结构分析显示大量坏死细胞死亡迹象，而很少检测到凋亡细胞死亡。因此，我们的工作假设是，复杂I功能障碍会触发激活胶质细胞的细胞信号的释放。这种激活导致氧化应激，小胶质细胞释放细胞因子，并激活神经元中的外源性凋亡途径，如果ATP不足，就会导致坏死细胞死亡。
我们还证明，KO小鼠的LS-like表型严格来说并不是一种发育现象，因为它证明了恩杜夫斯4成年动物的基因也会导致早期表型。我们怀疑，与KO或NesKO小鼠相比，尽管接受了10天三苯氧胺治疗，但由于重组不完全（80-90%），其表型轻微。基于Xgal染色，一些大脑区域实际上没有重组（例如OB和小脑中的颗粒细胞层），这与Southern和Western印迹结果一致。然而，在缺乏Ndufs4的发育过程中，也可能发生更严重的神经元损伤。
我们的结果验证了条件的有用性恩杜夫斯4以KO小鼠为模型，研究线粒体功能障碍所致神经退行性变的机制。该结果对理解LS症状的进展具有明显的意义恩杜夫斯4在特定的神经元群或特定脑区的恢复中，有望为这一复杂的综合征提供更多的解决方案。
方法
动物。
Ndufs4-null小鼠（KO）的产生如其他地方所述(18). NesKO小鼠是通过将条件Ndufs4小鼠与雀巢Cre老鼠。Pcp2-Cre公司小鼠和Ubc-核心ER2分别用小鼠通过三苯氧胺灭活Purkinje细胞或成人中的Ndufs4(SI方法). 所有动物实验都得到了华盛顿大学动物护理和使用委员会的批准。给小鼠喂食啮齿动物食物（5053；吡考拉布），并在22°C下自由饮水，进行12小时的光-暗循环。
行为分析。
有关视觉放置/触控响应、光/暗探索和旋转木马测试的详细信息，请参阅SI方法。行为测试列于表S1（详细信息可根据要求提供）。
线粒体分析。
如前所述进行线粒体活性测定(18)和在SI方法.
组织学、免疫荧光和EM。
用过量的戊巴比妥麻醉处于疾病不同阶段的小鼠，然后灌注PBS，再灌注4%多聚甲醛（PFA）。切下组织切片，用标准方法进行H&E、Luxol Fast Blue、Gallyas银、高尔基、X-Gal或FluoroJade C染色。使用8-μm石蜡切片或30-μm自由漂浮切片进行免疫荧光，主要抗体如下：GFAP、层粘连蛋白、CNPase或caspase 3或8、磷酸化AMPK或乙酰-CoA羧化酶、Iba-1-cfos、外周蛋白、髓鞘碱性蛋白、钙结合蛋白；CD11b或NeuN。抗体来源、稀释液和可视化细节可在SI方法.EM是通过标准技术进行的(SI方法).
西式、Oxyblot和Southern Blot。
Ndufs4、裂解caspase-9、裂解caspase-8和GFAP的蛋白质印迹如其他地方所述(33)和中SI方法使用Oxyblot检测试剂盒评估蛋白质氧化。对于恩杜夫斯4来自小脑、脑干或前/后脑的基因、DNA用BspHI消化，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳，转移到尼龙膜上，并与一种独特的探针杂交，该探针可以区分恩杜夫斯4+,恩杜夫斯4液氧、和恩杜夫斯Δ等位基因。
致谢
我们感谢Glenda Froelick的组织学研究和Nora Meneses帮助维护小鼠群体。这项研究得到了西雅图儿童线粒体研究协会（R.D.P.）和西班牙科学与创新部（A.Q.和E.s）的部分支持。
工具书类
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