美国国家科学院院刊。2010年6月1日；107(22): 10109–10114.
初级纤毛调节胰腺中Gli/Hedgehog的激活
加利福尼亚大学医学系糖尿病中心，加利福尼亚州旧金山，94143
已编辑*作者：Kathryn V.Anderson，纽约州斯隆-凯特琳研究所，2010年4月20日批准（2009年9月6日收到审查） 作者贡献：S.C.、J.L.、D.A.C.和M.H.设计的研究；S.C.、J.L.、D.A.C.和C.B.-A进行了研究；S.C.、J.L.、D.A.C.和M.H.分析数据；S.C.、J.L.、D.A.C.和M.H.撰写了这篇论文。
2现住址：西班牙塞维利亚大学Virgen del Rocío医院内分泌学与营养服务塞维利亚生物医学研究所，邮编：41013。
- 补充资料
支持信息
GUID:10F6A518-6777-47A5-8578-08C180567DE1
GUID:4EBE6210-A085-4B46-92E8-50B5470CE400
摘要
先前的研究表明，由Hedgehog（Hh）信号通路激活引起的胰腺上皮缺损是继发于周围间质分化状态的改变。然而，最近的结果描述了该途径在胰腺上皮发育和肿瘤转化过程中的作用。为了确定胰腺发育过程中上皮Hh激活的后果，我们采用了一种转基因小鼠模型，在该模型中，GLI2（该通路的转录介质）的激活版本在胰腺上皮中特异性过度表达。令人惊讶的是，在这些转基因小鼠中没有观察到有效的Hh激活，这表明胰腺上皮内存在阻止Hh完全激活的生理机制。其他研究表明，初级纤毛调节Hh激活水平，并且这些细胞器的消融足以导致过表达GLI2的小鼠胰腺中Hh通路的显著上调。由于Hh的明显激活，我们观察到胰腺外分泌和内分泌的深刻形态学变化。Hh活性的增加还导致表达祖细胞标记的未分化细胞群的扩大。因此，我们的研究结果表明，Hh信号在调节胰腺上皮可塑性中起着关键作用。
关键词：祖细胞、胰管、胰岛、胚胎发育、去分化
刺猬（Hedgehog，Hh）信号通路在胰腺发育和功能中起着关键作用。小鼠功能丧失和获得的研究表明，Hh活性的放松调节会影响胰腺的形态发生和功能（参考文献。1). 在这些研究中，Hh活性通过操纵Hh配体（可以向胰腺上皮和间质发出信号）或通过使用常规突变小鼠来解除调控(1–5). 因此，这些研究没有区分上皮和间叶Hh信号传导。已知Hh信号转导介导相邻组织之间的通讯，最近的几份报告已经解决了胰腺上皮和间质对Hh的不同需求。上皮细胞特异性激活Hh信号似乎对胰腺发育没有任何主要影响(6,7)上皮细胞中Hh的清除不会导致胰腺形成过程中的深刻变化(8,9). 相反，胰腺间质似乎是Hh信号的主要接收组织，不适当的刺激干扰了胰腺器官形成所必需的上皮-间质串扰(2,5). 与胚胎发育类似，上皮细胞中Hh传感器失活（Smoothened，Smo）对Hh信号的抑制并不影响胰腺癌的形成(8)而基质细胞中Smo的失活会导致胰腺癌异种移植模型中的生长抑制(10). 因此，这些观察结果表明间充质Hh信号在胰腺发育和胰腺癌中起主要作用，并表明发育中的胰腺上皮对Hh信号的解除不敏感。
然而，我们小组以前的研究表明，缺乏N-末端阻遏物结构域（GLI2ΔN）的GLI2在胰腺上皮祖细胞中的胰腺特异性过表达Pdx1-芯；CLEG2电缆小鼠导致未分化肿瘤的形成(7). 这些发现表明成熟胰腺上皮内激活的Hh信号具有额外的细胞自主作用。为了确定胰腺上皮中Hh信号的激活是否也影响胰腺的形成，我们分析了胰腺的器官发生Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。
令人惊讶的是，我们发现GLI2ΔN的异位表达未能有效上调胰腺上皮内的Hh通路。这一观察表明，胰腺上皮细胞中存在阻止该通路不适当激活的机制。最近的研究表明，初级纤毛（细胞器）是胚胎发育、器官功能和癌症中Hh途径的关键调节器(11–15). 具体而言，在髓母细胞瘤和基底细胞癌（BCC）形成过程中，纤毛消融增加了GLI2ΔN介导的Hh激活(11,15). 我们的研究结果表明，GLI2ΔN在小鼠体内同时消除纤毛会导致胰腺上皮中Hh的明显激活，从而损害胰腺的形成。这些胰腺显示出外分泌和内分泌组织的显著缺失，并伴有表达胰腺祖细胞标记物的未分化上皮细胞的出现。因此，我们的研究揭示了初级纤毛在胰腺形成过程中调节Hh信号的作用，并证明Hh过度激活导致胰腺中的独特表型，强调了Hh信号在调节胰腺细胞分化状态中的潜在作用。
结果
初级纤毛阻止GLI2ΔN过度表达时Hh的完全激活。
我们最近表明Pdx1-芯；CLEG2电缆转基因小鼠GLI2ΔN在胰腺上皮内以镶嵌方式积聚。在CLEG2小鼠中表达的活化GLI2ΔN与其N末端的myc标记融合，从而允许通过抗myc抗体进行免疫检测（以下简称myc-GLI2△N）(7). myc-GLI2ΔN的限制性表达模式令人惊讶，因为CLEG2电缆由于前体基因的有效消除，转基因应该在所有胰腺细胞中转录液氧-GFP停止-液氧放置myc-GLI2ΔN强普遍CMV早期增强子/鸡β-肌动蛋白（CAG）启动子直接控制的转基因(7). 要确定CLEG2电缆我们认为，胰腺中的转基因确实会激活Hh信号通路Pdx1-芯；CLEG2电缆带有第1部分lacZ公司/+老鼠。第1部分是Hh信号转导的直接转录靶点，并且第1部分lacZ公司/+携带β-半乳糖苷酶（β-gal）基因的小鼠(LacZ公司)内生的第1部分基因座是Hh途径活性的准确报告者(16). 3周龄婴儿β-半乳糖活性分析Pdx1-芯；CLEG2；第1部分lacZ公司/+小鼠发现胰腺内几乎没有细胞显示出可检测的活性()表明胰腺上皮细胞中存在的控制机制阻止Hh信号的完全激活Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。
初级纤毛阻止myc-GLI2ΔN过度表达小鼠胰腺中Hh的完全激活。(A类)3周龄婴儿β-半乳糖活性分析Pdx1-芯；CLEG2；第1部分lacZ公司/+小鼠发现胰腺内几乎没有细胞显示出可检测的活性。(B类)初级纤毛消融Kif3a型失活导致胰脏中阳性细胞的β-半乳糖染色面积和强度显著增加Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+老鼠。(C类)Myc-GLI2ΔN蛋白在Pdx1-芯；CLEG2电缆胰腺（箭头）。(D类)相反，以myc-GLI2ΔN融合蛋白强表达为标志的胰腺细胞数量在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。注意基质室增加（星号）和上皮细胞巢穴积聚高水平myc-GLI2ΔN（概述）。(电子和F类)Myc-GLI2ΔN融合蛋白定位于乳腺导管细胞的初级纤毛Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。请注意Pdx1-芯；CLEG2电缆样本对应于少数几个转基因活跃的导管区域之一。
初级纤毛在小鼠不同器官和组织发育过程中调节Hh信号水平(17,18)因此也可能调节胰腺中的Hh信号。重要的是，最近研究表明，在髓母细胞瘤和基底细胞癌形成期间，纤毛可以抑制myc-GLI2ΔN介导的Hh激活(11,15). 为了解决纤毛在胰腺上皮Hh信号传导中的作用，我们生成了化合物Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+以myc-GLI2ΔN异位表达为特征的小鼠(CLEG2电缆)，通过消除Kif3a型基因(Kif3a型液氧/液氧)是纤毛发生所需的驱动蛋白-2复合物的关键成分之一(19)，和的表达式Ptch1-lacZ公司作为Hh活性的标记(第1部分lacZ公司/+). 在胰腺中观察到阳性细胞的β-半乳糖染色面积和强度均显著增加Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+与…相比Pdx1-芯；CLEG2；第1部分lacZ公司/+出生后的小鼠()和胚胎期(图S1). 有趣的是，Hh活性主要局限于胰腺纤毛细胞类型之一的主要导管分支(20)，在e15.5和e17.5时，英寸Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+老鼠。值得注意的是，纤毛消融Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+与对照组相比，小鼠胚胎期β-gal活性降低第1部分lacZ公司/+控件(图S1)因此，提示初级纤毛在调节内源性Hh活性中发挥作用。重要的是，胚胎期使用的β-半乳糖测定条件比3周龄小鼠更敏感(SI方法). 因此，出生后胰腺中的Hh信号在导管细胞和胰岛中处于低水平活跃状态(21). Hh靶基因在整个胰腺中表达的定量测量显示Gli1公司和第1部分表达略微增加Pdx1-芯；CLEG2电缆组织、纤毛消融Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠出生后早期Hh靶基因显著增加(图S2).
为了确定Gli/Hh活性的增加是否与myc-GLI2ΔN蛋白的积累相关，我们通过转基因小鼠中myc标签的免疫组织化学分析来评估其水平。如前所述(7)，myc-GLI2ΔN蛋白仅在少数细胞中积累Pdx1-芯；CLEG2电缆产后胰腺(). 相反，Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠的细胞数量显著增加，表现为myc-GLI2ΔN蛋白的广泛表达(). 此外，我们确定纤毛消融与myc-GLI2ΔN积累以及Hh活化增加相关（通过β-gal在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+老鼠；图S3). 重要的是，我们发现，尽管myc-GLI2ΔN进行了修饰，但它能够定位到初级纤毛().
我们的研究结果表明，纤毛调节myc-GLI2ΔN在Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。在其他情况下，纤毛已被证明通过特异性调节加工的Gli3阻遏物（Gli3R）的形成来控制Hh信号传导活性。为了确定这种调节是否发生在胰腺中，我们分析了来自Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧产后胰腺。令人惊讶的是，我们发现两种药物的总Gli3水平（全长和加工后）都显著增加Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧胰脏与对照窝鼠的比较(图S4). 因此，与最近对大脑和皮肤的研究相比(11,15)这些数据表明纤毛具有抑制胰腺中Gli3水平的功能。
Cilia调节Hh信号下游的平滑。
接下来，为了确定纤毛是否在信号通路的不同水平上调节胰腺上皮细胞中的Hh活性，我们使用了一只含有组成活性Smoothened的转基因小鼠(烟雾2)表达于C介导的上游肿瘤切除液氧-停止-液氧顺序(22). 使用这种小鼠模型激活Hh信号已在多种情况下广泛实现(23,24). 与最近的报告一致(7)，我们发现Hh活性在Pdx1-芯；烟雾2；第1部分lacZ公司/+与对照组相比第1部分lacZ公司/+胰腺(图S5). 为了确定纤毛是否在Smo水平阻止Hh激活，我们在烟雾2表达式。我们发现Ptch1-lacZ活性在Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧;烟雾2；第1部分lacZ公司/+，与在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+老鼠(图S5和). 为了证实这些观察结果，我们有条件地消除了纤毛和Hh阻遏物补丁1，其通过抑制Smo转导活性来阻断Hh信号传导。我们在Pdx1-芯;Kif3a型液氧/液氧;第1部分液氧/乳酸小鼠，Hh活性与其他携带Gli2上游Hh激活突变的小鼠相似(图S5). 因此，我们的研究结果表明，初级纤毛调节胰腺上皮中Ptch1和Smo下游的Hh信号，可能在Gli水平。
胰腺中Hh的完全激活导致胰腺组织的丢失Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。
纤毛消融的发现Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠Hh信号的公开激活使我们能够评估胰腺上皮细胞自主性Hh信号调节的解除是否影响胰腺的形成。三重转基因Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠以预期的孟德尔比率出生，看起来非常正常。然而，在2-3周大的时候，Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小白鼠体型较小，生长迟缓，并表现出出生后的致命性。观察到胰腺组织在外分泌室和内分泌室都发生了严重的丢失Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧动物(). 严重的腺泡细胞丢失伴随着导管样上皮和基质室的扩张(). 此外，在三重转基因中存在导管样上皮Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠由不同于正常立方管形态的高柱状细胞组成( 插入). 这些细胞可能来源于导管样上皮，因为它们与导管标记物CK19和黏蛋白染色的组织相邻。然而，异常细胞完全失去了这些标记物的表达，并且积累了高水平的myc-GLI2ΔN蛋白，这表明Hh信号水平与导管标记物表达呈负相关(). 在导管内或导管附近，我们还发现纤维间质基质中嵌入了固体上皮细胞巢(和 D类和H（H）). 上皮细胞巢穴中myc-GLI2ΔN呈强阳性，不表达三种成熟胰腺细胞谱系（淀粉酶、腺泡、突触素、内分泌、粘蛋白、导管；和 H（H）和L（左）和图S6)，表明存在一定程度的脱分化。因此，Pdx1Cre；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠发育成熟胰腺组织的急剧丧失伴随着细胞分化的丧失和异常细胞的扩张。与此相反，正如之前报道的那样(7,25)，胰腺形态在Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠()而腺泡细胞轻度扩张和减少Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧2-3周龄的小鼠().
Hh完全激活导致胰腺形态紊乱。(A–D)3周龄小鼠的苏木精/伊红染色切片显示Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。注意增加的基质室Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧鼠标（星号位于D类). (E–H（E–H）)淀粉酶染色减少和CK19染色标记的导管样结构扩张增加所示的广泛腺泡细胞丢失Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。(G公司)导管轻度扩张Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧老鼠。(I–L型)在表达高水平myc-GLI2的细胞中，导管标志物黏蛋白-1的表达缺失Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠（箭头）。(J型)Myc-GLI2ΔN在胰腺细胞亚群中积聚Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。上皮细胞巢概述于D类和H（H）.
Hh-活性胰腺上皮细胞中祖细胞标记物的表达。
从导管出芽的异常上皮巢Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠没有表达成熟胰腺细胞类型中通常存在的标记物，因此我们决定对其进行更详细的描述。细胞粘附蛋白E-钙粘蛋白的表达证实了高myc-GLI2ΔN表达细胞的上皮性质(). 虽然三种成熟胰腺细胞类型的典型标记缺失，但我们确实检测到FoxA2和Sox9的表达()在出生后阶段，蛋白质通常局限于胰岛或导管(). 然而，这些转录因子也在二次转化前祖细胞的胰腺器官发生过程中表达(26–28)，表明高myc-GLI2ΔN表达细胞可能已经获得了祖细胞样状态。
Hh信号的激活导致祖细胞标记物在乳腺癌导管样上皮中的表达Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。(A类和B类)胚胎胰腺标记物Sox9在2-3周龄未分化细胞中的表达Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。E-cadherin的表达证实了这些细胞的上皮性质。(C类和D类)FoxA2在未分化细胞中表达Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。(电子和F类)Myc-GLI2ΔN表达细胞Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧通过用磷酸氢istone H3染色测定，小鼠具有高度增殖性。(G公司和H（H）)未分化细胞中Notch信号的激活Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧Hes1表达测定的小鼠。(我和J型)Pdx-1的表达被排除在表达高水平myc-GLI2ΔN的未分化细胞外Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧胰腺。(K（K）和L（左）)未分化细胞首次出现在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧胰腺。(M（M）和N个)P0未分化细胞中黏蛋白-1异常表达Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧胰腺。在myc-GLI2ΔN表达细胞中，黏蛋白-1的表达降低，且不局限于顶端膜Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧鼠标（箭头）。粘蛋白-1正确定位于心尖膜Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。注意，在Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。(O（运行）和P（P）)P0的myc-GLI2ΔN表达细胞外分泌（淀粉酶）和导管标志物（Mucin-1）的共表达Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。用箭头标记的区域在P的插图中以较高的放大倍数显示。
这一假说的进一步证据来自异常细胞高度增殖的观察()并显示活跃的Notch信号，如Hes1免疫荧光染色所示()，一种在胚胎祖细胞中表达的Notch靶基因(29). Hes1仅在对照小鼠成年胰腺的着丝粒细胞和少数导管细胞中发现(30) (). 有趣的是，胚胎胰腺转录因子和β细胞标记物Pdx-1的表达(31,32)，被排除在表达高水平myc-GLI2ΔN的未分化细胞外Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧胰腺(). 因此，这些发现表明，胰腺上皮中Hh信号的细胞自主激活可诱导表达祖细胞标记子集的细胞去分化和扩增。
时间分析显示，这些未分化细胞首次出现在P0。此时，在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧胰腺(). 这些结构显示了丰富的myc-GLI2ΔN，并表达了低水平的导管粘蛋白-1，而该粘蛋白-1并不适当地定位于顶端膜，进一步表明Hh激活干扰了导管细胞的分化状态(). 此外，我们还发现异常细胞积聚myc-GLI2ΔN，淀粉酶和CK19共存于扩张的导管结构中(). 外分泌和导管标记物的同时表达提示细胞处于转分化的中间阶段，这可能有助于在老年人中观察到导管结构的扩张Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。早在年e15.5检测到表现出高Hh活性的畸形导管Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧;第1部分lacZ公司/+老鼠(图S1)因此，提示在Hh信号上调的情况下，胚胎发生期间导管形成受损。
内分泌缺陷Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。
除了外分泌和导管缺陷外，我们还观察到Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。内分泌区域减少75%Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧在出生后第5天（P5）发现小鼠，而在Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠(). 此外，其余胰岛中α和β细胞的结构在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠().
Hh活性增加导致胰岛形成中断Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。(A–D)岛屿数量减少，其建筑受到影响Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧P5小鼠。胰岛形态在插图中以较高放大倍数显示。(E–H（E–H）)在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠P0。(I–K型)E15.5胚胎和P0、P5小鼠胰岛面积的定量。注意胰岛面积在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧P5小鼠。(L（左）和M（M）)E15.5胚胎中ngn3阳性细胞和上皮面积的定量。上皮面积和神经生长素3内分泌前体在Pdx1-芯；CLEG2电缆和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。(N个和O（运行）)基于P0和P5处磷酸化-胆固醇H3表达的内分泌细胞增殖定量。(P（P）和问)根据在P0和P5的裂解caspase-3表达定量内分泌细胞死亡。请注意Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。所有数值均与对照同窝者相关，其平均值为1。样本编号代表n个≥ 3. （请参见表S1样品编号。）误差条代表SD*P（P）<0.05和**P（P）< 0.005.
为了评估内分泌细胞丢失的时间，我们分析了胰岛面积，从e15.5开始，当内分泌细胞新生高峰时，到P0，当胰岛细胞开始重组以实现最终的胰岛结构时。内分泌区域大幅减少50%Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧在e15.5和P0时观察到小鼠，与在Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠(). 因此，这些数据表明Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠偏离Pdx1-芯；CLEG2电缆出生后的小鼠。
为了进一步研究e15.5检测到的内分泌细胞减少Pdx1-芯；CLEG2电缆和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧在小鼠中，我们对标记所有内分泌前体的神经3（ngn3）进行了免疫荧光染色，发现它们的数量在这两种情况下都类似地减少Pdx1-芯；CLEG2电缆和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠(). 此外，e15.5的上皮面积量化显示Pdx1-芯；CLEG2电缆和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧与对照小鼠相比(). 因此，尽管内分泌前体与上皮面积的比值正常，但由于胰腺上皮扩张受损，内分泌前体的数量减少。有趣的是，CLEG2电缆转基因表达在有无纤毛的情况下导致了类似的胚胎缺陷，表明Hh激活水平在Pdx1-芯；CLEG2电缆胰腺足以损害胚胎胰腺上皮的扩张。
与通过新生实现内分泌细胞的胚胎扩增相反，出生后胰岛细胞的扩增主要通过增殖实现。为了解决出生后内分泌组织丢失是否可归因于胰岛细胞增殖和/或凋亡率的变化的问题，我们分别对出生后胰腺中的磷酸化H istone 3和裂解caspase-3阳性细胞进行了定量。我们发现转基因胰岛的增殖能力出现短暂变化，其增殖能力增加了2倍Pdx1-芯；CLEG2电缆和Pdx1-芯；Kif3a型液氧/液氧P0时的胰腺和Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧P5胰岛(). 相比之下，在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧P0和P5之间的胰岛()这表明出生后的内分泌细胞不能维持被解除调控的Hh信号。
讨论
为了确定上皮Hh信号在胰腺形成中的作用，我们过度表达了GLI2的激活版本，以细胞自主方式激活Hh信号，特别是在胰腺上皮中。尽管该Hh激活等位基因被强制表达，但我们没有观察到有效的Hh激活。为了确定初级纤毛是否能够调节胰腺上皮细胞中的Hh信号，我们在具有明显Hh获得功能突变的小鼠中消除了这些细胞器。切除原发纤毛导致携带甲状旁腺病毒的小鼠体内Hh强烈激活GLI2型-激活突变但不在烟雾2和第1部分lox/LacZ公司突变小鼠，表明初级纤毛调节胰腺Smo下游的Hh活性。
Gli2上游Hh激活突变（即SmoM2）不能有效激活Hh信号，这一有趣的事实表明胰腺上皮细胞具有阻止Hh激活的调节机制。我们的研究表明，原发纤毛没有发挥这一作用，因为它们在SmoM2或Ptch1缺失的情况下被消融不会导致胰腺异常Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠。我们的发现表明GLI2ΔN在CLEG2电缆小鼠绕过这些额外的调节剂，但GLI2ΔN活性仍受纤毛介导的调节。因此，消除纤毛Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠是Hh通路完全激活所必需的。如前所述，在Smo激活的情况下，存在抑制信号传导活性的额外调节物也可能部分解释胰腺上皮细胞对Hh配体的弹性反应(8,10). 这些观察结果与髓母细胞瘤和基底细胞癌的最新报道形成对比，后者中SmoM2的表达足以以纤毛依赖性的方式诱导肿瘤(11,15). 胰腺与这些组织的进一步区别在于CLEG2的表达Pdx1-芯；CLEG2电缆小鼠只会导致Hh信号活性的适度增加，而纤毛消融则会显著提高Hh信号的活性。在小脑和皮肤中，CLEG2电缆尽管纤毛消融加速了肿瘤的形成，但有或无纤毛消融术的表达导致了类似水平的Hh激活。此外，纤毛调节小脑和皮肤中Gli3R的生成(11,15)，它们调节胰腺中的总Gli3蛋白水平。总之，这些差异表明，除纤毛外的调节机制以组织特异的方式调节Hh活性。
Hh活性增加Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠揭示了上皮Hh信号在胰腺发育和分化过程中的未知作用。观察到的最有趣的畸形之一Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠是具有异常形态的细胞的形成，显示出高myc-GLI2ΔN水平。这些细胞表达胰腺祖细胞标记物，如Hes1、FoxA2和Sox9，表明Hh的激活会损害胰腺细胞维持分化状态的能力。有趣的是，已有研究表明，由于化生细胞无法再分化回外分泌细胞，上皮细胞Hh信号的失活阻碍了胰腺损伤后的再生，进一步支持了Hh信号在调节胰腺细胞可塑性中的作用(9).
我们以前的研究表明，尽管myc-GLI2ΔN在Pdx1-芯；CLEG2电缆小鼠，myc-GLI2ΔN的延长表达导致未分化胰腺肿瘤的形成。这些未分化肿瘤显示上皮标记物（如E-cadherin）丢失，提示上皮-间充质转化。虽然在Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠表达E-钙粘蛋白，我们不能排除这些细胞向老年人肿瘤细胞早期过渡的可能性Pdx1-芯；CLEG2电缆老鼠。虽然这些小鼠的未分化肿瘤与胰腺癌不同，但有趣的是，腺癌前病变和肿瘤细胞中也没有初级纤毛(33)与髓母细胞瘤和基底细胞癌（纤毛肿瘤）的另一个区别(11,15). 不幸的是Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧老鼠妨碍了年长动物的分析。纤毛的局灶性/暂时性失活和GLI2ΔN的过度表达将需要阐明未分化细胞是否存在于Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠代表胰腺肿瘤的早期阶段。
Hh信号的增加也会导致内分泌细胞形成的严重缺陷，包括胰岛面积的显著减少，主要发生在出生后阶段。与我们在外分泌室观察到的结果相反，转分化似乎在产后内分泌区域的丢失中没有起作用。相反，我们的研究结果表明，细胞凋亡的增加很可能是这一过程的原因，这表明对Hh信号的放松调控会损害内分泌细胞的健康。以前的胰岛素瘤细胞报告显示，该途径在调节β细胞功能中具有积极作用(34,35). 不幸的是Pdx1-芯；CLEG2；Kif3a型液氧/液氧小鼠使我们无法分析增加的Hh信号对成熟内分泌细胞功能的影响，这些问题有待于对成年胰岛细胞的途径进行操作。
总之，我们已经表明，初级纤毛调节Smo下游的Hh活性，可能在胰腺上皮中的Gli转录因子水平上。我们的研究结果还表明，胰腺上皮细胞中Hh信号的增加导致分化状态的丧失以及胚胎前肠和胰腺祖细胞标记物的激活。这些发现表明，上皮Hh信号的调节控制分化表型，因此可能对成熟外分泌细胞的重新编程、胰腺肿瘤形成过程以及胰岛素分泌细胞的潜在来源具有重要意义(36).
方法
根据加州大学旧金山分校动物研究委员会批准的方案，本研究中使用的小鼠被保存在屏障设施中。Pdx1-芯,CLEG2电缆,第1部分lacZ公司/+,第1部分液氧/液氧,烟雾2、和Kif3a型液氧/液氧之前已经描述过老鼠(7,16,22,32,37,38).
有关试剂和程序的详细说明，请参见SI方法.
致谢
我们感谢Doug Melton博士（马萨诸塞州剑桥哈佛大学）、Andrzej A.Dlugosz博士（密歇根大学医学院，密歇根州安娜堡）、Brandon Wainwright博士（澳大利亚布里斯班昆士兰大学）和Lawrence S.Goldstein博士（加州大学圣地亚哥分校，拉霍亚）为我们提供鼠标线。我们感谢Baolin Wang博士（纽约州纽约市康奈尔大学威尔医学院）提供的抗Gli3抗体。我们感谢Young-Goo Han博士对手稿的批判性阅读，感谢Ramya Sundararajan博士的技术支持，感谢加州大学旧金山分校（UCSF）Helen Diller家庭综合癌症中心的基因组分析核心提供自定义Taqman分析序列。S.C.接受了国家胰腺基金会的研究资助。D.A.C.得到了加州再生医学研究所（CIRM）博士后奖学金的支持。J.L.被加州大学旧金山分校生物医学研究生项目录取。M.H.实验室的工作得到了国立卫生研究院DK6053和CA112537以及布雷姆联盟的支持。图像采集得到了加州大学旧金山分校糖尿病和内分泌学研究中心显微镜核心（P30 DK63720）的支持。
工具书类
1Lau J，Kawahira H，Hebrok M.Hedgehog在胰腺发育和疾病中的信号传导。细胞分子生命科学。2006;63:642–652. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Apelqvist A、Ahlgren U、Edlund H.Sonic hedgehog指导肠道和胰腺的中胚层分化。当前生物量。1997;7:801–804.[公共医学][谷歌学者] 三。Hebrok M，Kim SK，St Jacques B，McMahon AP，Melton DA。通过刺猬信号调节胰腺发育。发展。2000;127:4905–4913.[公共医学][谷歌学者] 4Kawahira H等。刺猬信号抑制剂的联合活性调节胰腺发育。发展。2003;130:4871–4879.[公共医学][谷歌学者] 5Kawahira H、Scheel DW、Smith SB、German MS、Hebrok M.Hedgehog信号调节胰腺上皮细胞的扩张。开发生物。2005;280:111–121.[公共医学][谷歌学者] 6Tian H等。在胰腺癌发生期间，刺猬信号仅限于基质室。美国国家科学院程序。2009;106:4254–4259. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Pasca di Magliano M等人。Hedgehog/Ras相互作用调节胰腺癌的早期阶段。基因发育。2006;20:3161–3173. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Nolan-Stevaux O等。GLI1通过肿瘤性胰腺导管中的平滑独立机制进行调节，并调节PDAC细胞的存活和转化。基因发育。2009;23:24–36. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 9Fendrich V等人。刺猬信号是有效再生外分泌胰腺所必需的。胃肠病学。2008;135:621–631. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Yauch RL等。癌症中刺猬信号的旁分泌需求。自然。2008;455:406–410.[公共医学][谷歌学者] 11Han YG等。原发纤毛在髓母细胞瘤发展中的双重和对立作用。自然医学。2009;15:1062–1065. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Haycraft CJ等。Gli2和Gli3定位于纤毛，需要鞭毛内转运蛋白极化子进行加工和功能。公共科学图书馆-遗传学。2005;1：e53。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 13皇甫D，安德森KV.Cilia和刺猬在小鼠中的反应性。美国国家科学院程序。2005;102:11325–11330. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Liu A，Wang B，Niswander LA。小鼠鞭毛内转运蛋白调节Gli转录因子的激活和抑制功能。发展。2005;132:3103–3111.[公共医学][谷歌学者] 15Wong SY，等。初级纤毛可以介导和抑制Hedgehog路径依赖性肿瘤的发生。自然医学。2009;15:1055–1061. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Goodrich LV，MilenkovićL，Higgins KM，Scott MP。小鼠补缀突变体中神经细胞命运和髓母细胞瘤的改变。科学。1997;277:1109–1113.[公共医学][谷歌学者] 17Wong SY，Reiter JF。哺乳动物刺猬信号十字路口的初级纤毛。当前最高开发生物。2008;85:225–260. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 18Huangfu D，Anderson KV。从Smo到Ci/Gli的信号传递：从果蝇到脊椎动物的刺猬途径的保护和分化。发展。2006;133:3–14.[公共医学][谷歌学者] 19Goldstein LS。激动素分子马达：运输途径、受体和人类疾病。美国国家科学院程序。2001;98:6999–7003. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Cano DA、Murcia NS、Pazour GJ、Hebrok M.Orpk多囊肾病小鼠模型揭示了初级纤毛在胰腺组织组织中的重要作用。发展。2004;131:3457–3467.[公共医学][谷歌学者] 21Lau J等。胰腺上皮中的Hedgehog信号调节胚胎器官形成和成人β细胞功能。糖尿病。2010;59:1211–1212. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22.Mao J等。一种用于研究Hedgehog通路致瘤潜力的新型体细胞小鼠模型。癌症研究。2006;66:10171–10178. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23.Han YG等。刺猬信号和初级纤毛是成人神经干细胞形成所必需的。自然神经科学。2008;11:277–284.[公共医学][谷歌学者] 24Jeong J、Mao J、Tenzen T、Kottmann AH、McMahon美联社。神经嵴细胞中的刺猬信号调节面部原基的模式和生长。基因发育。2004;18:937–951. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Cano DA，Sekine S，Hebrok M。胰腺上皮细胞中原发性纤毛缺失导致囊肿形成和胰腺炎。胃肠病学。2006;131:1856–1869.[公共医学][谷歌学者] 26Seymour PA等。维持胰腺祖细胞池需要SOX9。美国国家科学院程序。2007;104:1865–1870. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Lynn FC等。Sox9协调胰腺祖细胞中的转录网络。美国国家科学院程序。2007;104:10500–10505. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Lee CS、Sund NJ、Behr R、Herrera PL、Kaestner KH。Foxa2是胰腺α细胞分化所必需的。开发生物。2005;278:484–495.[公共医学][谷歌学者] 29Lammert E，Brown J，Melton DA。胰腺器官发生过程中Notch基因的表达。机械开发。2000;94:199–203.[公共医学][谷歌学者] 30.Stanger BZ等。Pten抑制胰腺中心泡细胞的扩张和恶性转化。癌细胞。2005;8:185–195.[公共医学][谷歌学者] 31Ohlsson H，Karlsson K，Edlund T.IPF1，胰岛素基因的一种含同源域的反式激活剂。EMBO J。1993;12:4251–4259. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Gu G，Dubaskaite J，Melton DA。胰腺谱系的直接证据：NGN3+细胞是胰岛祖细胞，与导管祖细胞不同。发展。2002;129:2447–2457.[公共医学][谷歌学者] 33Seeley ES、Carrière C、Goetze T、Longnecker DS、Korc M。胰腺癌和前体胰腺上皮内瘤变病变缺乏原发纤毛。癌症研究。2009;69:422–430. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Thomas MK，Rastalsky N，Lee JH，Habener JF。胰腺β细胞胰岛素生成的Hedgehog信号调节。糖尿病。2000;49:2039–2047.[公共医学][谷歌学者] 35.Thomas MK，Lee JH，Rastalsky N，Habener JF。胰腺β细胞中同源结构域蛋白胰岛十二指肠同源盒-1表达的Hedgehog信号调节。内分泌学。2001;142:1033–1040.[公共医学][谷歌学者] 36周强，布朗J，卡纳雷克A，拉贾戈帕尔J，梅尔顿DA。成年胰腺外分泌细胞体内重编程为β细胞。自然。2008;455:627–632. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Marszalek JR等。哺乳动物光感受器中驱动蛋白II选择性转运视蛋白和抑制素的遗传证据。单元格。2000;102:175–187.[公共医学][谷歌学者] 38Ellis T等。在小鼠中修补1个条件无效等位基因。起源。2003;36:158–161.[公共医学][谷歌学者] 
