SUMO在酵母组成转录和诱导基因激活中的作用

摘要

蛋白质sumoylation涉及小泛素样修饰物（SUMO）肽与受体蛋白质中的赖氨酸侧链的共价可逆连接。在机械上与泛素化类似，这涉及一系列酶活性，包括E1酶（Aos1/Uba2）激活和单一E2酶（Ubc9）与靶蛋白结合，并由SUMO E3连接酶引导至适当底物(约翰逊2004；Geiss-Friedlander和Melchior 2007年). 萌芽酵母表达单一SUMO亚型，由SMT3型基因，而哺乳动物细胞中发现三种主要亚型：SUMO1，以及高度相似的SUMO2和SUMO3。在分子水平上，SUMO肽附着到底物上可以通过识别其SUMO修饰形式促进其与相互作用蛋白质的结合，或者SUMO部分可以通过阻断相互作用位点干扰蛋白质与蛋白质的相互作用。通过琥珀酰化改变蛋白质-蛋白质相互作用的后果是多种多样的，包括亚细胞定位、蛋白质活性和蛋白质稳定性的变化(Geiss-Friedlander和Melchior 2007年).

已在所有真核生物中鉴定出SUMO同源基因，并且sumoylation修饰了参与广泛细胞过程的蛋白质，表明sumoylion的调节广泛存在(赵2007；Makhnevych等人，2009年). 然而，基因表达似乎特别受sumoylation的调控，因为酵母和哺乳动物中大量已知的SUMO结合物是转录因子(吉尔2005；赵2007；Makhnevych等人，2009年). 阻断基因特异性转录因子C/EBP的sumoylation(Kim等人，2002年)，c-6月(Muller等人，2000年)，ELK-1型(Yang等人，2003年)，以及许多其他(Girdwood等人，2004年；吉尔2005)SUMO受体位点的突变导致靶基因的转录增加。因此，sumoyalization通常与转录抑制有关。这也得到了其他研究结果的支持，包括观察到包括组蛋白去乙酰化酶复合物（HDAC）在内的转录共抑制因子优先与sumoylated形式的转录因子相关(Garcia-Dominguez和Reyes，2009年；欧阳和吉尔2009). 例如，辅激活子p300以SUMO依赖的方式与HDAC6关联(Girdwood等人，2003年). 此外，人类组蛋白H4被酰化(Shiio和Eisenman 2003)和酵母中的四种核心组蛋白一样(Nathan等人，2006年). 通过减弱sumoylation的突变，或通过使用组蛋白-SUMO融合蛋白，表明组蛋白sumoylion抑制转录(Nathan等人，2006年). 这被认为是通过SUMO修饰的组蛋白招募HDAC，或通过干扰诸如乙酰化或泛素化等转录诱导的组蛋白修饰来实现的(Shiio和Eisenman 2003；Nathan等人，2006年). 然而，组蛋白sumoylation是否是转录沉默基因抑制的一般机制尚不清楚。尽管有大量研究将SUMO与抑制联系起来，但在少数情况下，基因特异性转录因子的sumoylation与激活转录相关(Lyst和Stancheva 2007；Guo和Sharrocks 2009以及其中的参考文献），表明SUMO在转录中并不是唯一的抑制作用。

除了基因特异性转录因子外，大规模蛋白质组学筛选还确定了两种酵母中作为SUMO靶点的一般转录机制的组成部分(Panse等人，2004年；Wohlschlegel等人，2004年；Zhou等人，2004年；Denison等人，2005年；Hannich等人，2005年；Wykoff和O'Shea 2005；Makhnevych等人，2009年)和哺乳动物(Zhao等人，2004年；Rosas-Acosta等人，2005年)单元格。这些包括通用转录因子（GTF）TFIIA、TFIIF和TFIID（TBP，以及一些TAF）的多个亚单位；调解人；和RNA聚合酶II（RNAP II）本身的亚单位。在发现的RNAP II的多个酵母亚基中，Rpb1的sumoylation是特征性的，似乎是作为紫外线反应的一部分发生的，但阻断Rpb1 sumoylion并不影响转录延长或细胞生长(Chen等人，2009年). 人类TFIID亚单位TAF5的氨酰化作用被证明会损害TFIID与启动子DNA的结合(Boyer-Guittaut等人，2005年)，表明sumoyalization可能也是TFIID的负调节因子。

SUMO修饰了一般转录机制的多个成分，这一发现表明，除了调节几种基因特异性转录因子外，sumoylation还可能有助于控制许多基因的转录。在这里，我们提供的证据表明情况确实如此。我们首先使用染色质免疫沉淀（ChIP）分析，询问SUMO是否与酿酒酵母在正常生长的细胞中或在诱导某些基因转录的条件下。与SUMO与转录抑制密切相关的事实形成明显对比的是，我们发现SUMO存在于所有被测试的转录活性基因中，包括组成型和诱导型启动子，但不存在于被抑制或未诱导的基因中。我们没有在构成基因中检测到Ubc9，这意味着在与这些基因关联之前，这些因子被汇总。相反，我们发现当诱导基因被激活时，Ubc9被招募到启动子中。然而，有趣的是，Ubc9功能受损导致这些基因的转录增加。为了解释这一点，我们发现在诱导的ARG1公司当激活信号消失时，启动子会削弱细胞关闭其转录的能力。我们的结果表明，在诱导转录过程中，活性基因的启动子处发生sumoylation，并通过促进关闭转录来调节转录水平。

结果

SUMO与转录活性基因相关

考虑到将转录因子的sumoylation与转录抑制联系起来的研究占优势，我们希望确定sumoylion是否在抑制沉默基因启动子的转录中起到一般作用。为此，我们使用识别酵母SUMO肽Smt3的抗体，通过ChIP检测酵母细胞中一组受抑制的启动子中是否可以检测到sumoylated蛋白。从在标准条件下生长的细胞中制备染色质，并用Smt3抗体（SUMO）或识别RNAP II最大亚单位的抗体免疫沉淀样品作为对照(图1A). 通过PCR分析免疫沉淀样品中是否存在与V号染色体非转录区相关的启动子DNA（折叠占有率图1B; 参见材料和方法）。分析了五种在正常生长期间被抑制但在不同条件下被激活的诱导基因：加仑1,STL1型,ARG1公司,CUP1大学、和热休克蛋白12假设作为对照，我们还测试了三个组成转录的基因和七号染色体的一个基因间区域，该区域代表转录沉默区域。在正常生长条件下，RNAP II ChIP证实RNAP II仅与转录活性基因（组成性转录PYK1型,ADH1（ADH1）、和项目管理A1)而不是被抑制的基因或基因间区域（RNAP II）(图1A、B). 然而，令人惊讶的是，SUMO-ChIP显示，只有三个组成转录的基因启动子上存在显著水平的SUMO(图1B). 我们没有在基因间区域检测到显著水平的SUMO，也没有在五个受抑制的基因启动子中的任何一个检测到最显著的SUMO(图1B).

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图1。

SUMO与构成活性基因相关。(A类)对显示的转录活性和沉默基因启动子以及第VII号染色体（基因间）的非转录区进行代表性ChIP分析。SUMO和RNAP II的占用通过用Smt3抗体（SUMO）或识别RNAP II的抗体（抗体8WG16；RNAP II）进行的ChIP来确定。PCR反应（*）中包括了识别V号染色体非转录区序列的对照引物，并且输入的染色质也通过PCR进行了比较和定量分析（input）。(B)ChIP分析的量化，如A类量化（如材料和方法中所述）是折叠背景；值为1表示在背景上方未检测到信号，如粗条所示。(C)8xHIS-标记Smt3在指示基因或基因间区域的占有率HIS8-SMT3型应变，由ChIP确定，如A类和B. (D类)基因图PYK1型,ADH1（ADH1）、和项目管理A1指示基因长度、转录起始位点的大致位置（弯曲箭头）以及由指示的ChIP引物扩增的区域。基因和扩增产物的长度是相互衡量的。(E类)在指定的构成基因中，对指定位置的SUMO占用进行详细ChIP分析的量化。(F类,左边)细胞裂解物来自UBC9-6HA用抗HA抗体对一株对照菌株进行Western blot分析，以确认Ubc9的标记。(赖特)6xHA标记的Ubc9在UBC9-6HA应变，由ChIP测定。

我们的ChIP实验中使用的Smt3抗体如前所述(Montpetit等人，2006年)和，当使用酵母全细胞提取物进行Western blot时，给出了多种sumoylated蛋白质的预期模式（参见图2A; 囊性纤维变性。Wohlschlegel等人，2004年). 然而，为了证实ChIP检测到的信号确实是由于sumoylated蛋白的存在，我们使用表达8xHIS表位标记Smt3的菌株重复了ChIP实验(Wohlschlegel等人，2004年). 如所示图1C，ChIP使用抗HIS抗体HIS8-SMT3型菌株产生了与Smt3抗体相同的模式，证实ChIP信号实际上是由于转录活性基因中存在SUMO。HIS8-Smt3在ARG1公司启动子可能反映了在未诱导细胞中检测到该基因的弱激活(Govind等人，2005年). 这些观察结果与基于假设SUMO对转录具有内在抑制作用的模型的预期相反(Chupreta等人，2005年)相反，这表明，在正常生长的酵母中，SUMO存在于活性基因的启动子区域。

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图2。

在ubc9-1细胞与组成基因RNAP II占用减少相关。(A类)全细胞酵母提取物由ubc9-1用Smt3抗体（SUMO）和识别RNAP II大亚单位（Rpb1；抗体8WG16）的抗体作为负荷对照，通过Western blot进行分析。细胞在28°C下生长，或在分析前转移到37°C 30分钟，如图所示。(B)斑点分析比较ubc9-1在指定温度下，在完整的最小培养基上培养细胞和一个等基因野生型菌株。约1.5×10⁴细胞被镀在左边，在每个随后的点向正确的。生长2天。所有ChIP实验均使用ubc9-1使用28°C下生长的细胞进行等基因控制。(C)SUMO和RNAP II的占用是在指定位置确定的（参见图1D)横跨PYK1型,ADH1（ADH1）、和项目管理A1在里面ubc9-1细胞（灰色条）和等基因野生型菌株（黑色条）。统计分析（学生t吨-试验）表明，野生型和ubc9-1数据集(P（P）=0.004（对于SUMO），以及P（P）=0.003（对于RNAP II）。(D类)半定量RT-PCR分析ubc9-1细胞（灰色条）和等基因野生型细胞（黑色条）。野生型和ubc9-1数据集(P（P）> 0.1).

为了确定在组成转录基因中检测到的SUMO是否局限于启动子区域，我们进行了更详细的ChIP分析。引物对表示穿过PYK1型,ADH1（ADH1）、和项目管理A1基因用于确定启动子、内部和终止子区域的SUMO交联水平，如图1D在基因的所有位置都检测到低水平的sumoylated蛋白，但在启动子周围检测到较高水平（大约比其他区域高出两到三倍）。这表明与转录活性基因相关的蛋白质，特别是与启动子相关的蛋白质被酰化。

SUMO在转录活性基因上的存在表明，“假定”蛋白在活性基因上特异性组装，或组装因子在活性基因处发生sumoylation。为了区分这些可能性，我们确定Ubc9是否也可以在测试的活性基因中检测到。我们构建了一株表达6xHA C末端标记Ubc9的酵母菌株(图1F（左），并执行ChIP分析。如所示图1F（右），在PYK1型,ADH1（ADH1），或项目管理A1启动子区域，即使使用该菌株在其他基因中检测到Ubc9-6HA（参见图3A). 尽管有可能低水平的Ubc9与这些基因短暂相关，以催化我们检测到的sumoylation，但我们的数据与在与基因相关之前被sumoylated的蛋白质的招募一致。

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图3。

诱导型基因的激活涉及启动子结合因子的sumoyalization。(A类)诱导型飞机RNAP II、SUMO和Ubc9-6HA的占用加仑1,STL1型、和ARG1公司基因启动子在正常生长条件下，或在其各自的诱导条件下（参见材料和方法）。(B)的基因图加仑1和STL1型如中所示图1D. (C)RNAP II、SUMO和Ubc9-6HA在整个加仑1和STL1型未诱导（黑色条）或诱导条件（灰色条）中的基因。

SUMO和Ubc9在激活期间均被招募为诱导基因的启动子

为了进一步探索SUMO在转录中的功能，我们接下来检查了SUMO是否与激活的基因相关。抑制时与SUMO无关的三个诱导基因(图1A、B)在诱导状态下进行检测。加仑1当半乳糖是生长介质中的碳源时诱导，STL1型，通过向培养基中添加NaCl诱导的渗透反应基因，以及ARG1公司ChIP检测了由氨基酸饥饿条件诱导的氨基酸生物合成基因。RNAP II ChIP位于加仑1,STL1型、和ARG1公司启动子在各自的激活条件下表现出RNAP II对基因的强烈募集(图3A，左）。引人注目的是，对SUMO水平的分析表明，sumoylated蛋白的出现与基因的诱导一致(图3A，中间），其水平大约是测试的构成基因的两倍（参见。图1B和3A；数据未显示）。SUMO在三个诱导基因上的出现，在不同的诱导条件下，强烈地支持了我们的断言，即SUMO与酵母中转录活性位点相关。

接下来，我们希望研究在诱导基因中检测到的高SUMO水平是否反映了启动子中的活性sumoylation。为此，我们在诱导和未诱导条件下检测了Ubc9与这些启动子的关联。由于上述实验是在UBC9-6HA我们使用HA抗体进行了ChIP分析。与上述分析的构成基因相比(图1F)，激活期间每个诱导基因上都存在显著水平的Ubc9-6HA(图3A，右侧）。各职位的详细ChIP分析加仑1,STL1型、和ARG1公司证明诱导后检测到的强烈SUMO信号仅限于基因的启动子近端区域(图3C,4A、B类). Ubc9-6HA沿途招募的类似分析加仑1和STL1型基因表明Ubc9-6HA也主要定位于启动子近端区域(图3C，右；请注意加仑1启动子元件与上游共调控基因共享镀锌10基因）。SUMO和Ubc9在诱导启动子上的同时出现强烈表明，启动子结合因子在基因激活过程中被sumoylated。因此，虽然SUMO与组成表达基因相关，可能是由于sumoylated因子的招募，但Ubc9介导的启动子结合因子的SUMO修饰发生在诱导基因的激活过程中。这代表了酵母中基因激活的一个以前未被重视的方面。

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图4。

氨酰化对诱导基因的转录有负面影响。(A类,B)SUMO的占用(左边)和RNAP II(中间的)在未诱导和诱导条件下测定（如所示图3A)对于STL1型(A类)和ARG1公司(B)英寸ubc9-1细胞（黑条）和等基因野生型细胞（灰条）。(赖特)稳定状态STL1型(A类)和ARG1公司(B)野生型和ubc9-1如图所示，通过RT-PCR检测未处理或诱导细胞中的细胞。诱导后野生型细胞中的转录物丰度值显示为100。统计分析表明，野生型和ubc9-1数据集(P（P）<0.03STL1型数据，以及P（P）<0.008ARG1公司数据）。野生型和ubc9-1单元格，具有P（P）-值0.02和0.03STL1型和ARG1公司分别是。(C)野生型和ubc9-1富含培养基中0、0.4和0.6 M NaCl中的细胞(左边)或缺乏Val和Ile的最小培养基，以及添加0.5μg/mL SM的相同培养基(正确的). 按中所述进行现场分析图2B。在28°C下生长2天。

诱导ARG1完全失活需要Sumoylation

我们在ubc9-1细胞可能以两种不同的方式产生：聚合酶向激活的启动子的募集增加，或者诱导信号不再存在后诱导基因的长期激活。鉴于我们的发现，sumoylation对组成基因的RNAP II募集有积极影响，我们假设sumoylion对诱导转录的负面影响是由于终止诱导启动子的激活，这一过程我们称之为失活。为了研究磺酰化是否真的在失活中起作用，我们设计了一种方法，通过该方法激活ARG1公司基因可能会很快被阻断。暴露于SM后，Val和Ile的耗竭导致Gcn4激活蛋白的有效翻译和稳定，其结合ARG1公司启动子并激活其转录(邱等人，2004,2005；Govind等人，2005年). Gcn4的短半衰期（正常生长条件下为～5分钟）(Kornitzer等人，1994年)允许对氨基酸水平的变化作出快速反应。我们发现，添加高浓度的Val和Ile（五倍于其正常浓度，称为“停止混合”）到经SM处理的ubc9-1或等基因野生型细胞导致Gcn4快速消失（加入停止混合物5分钟后，Western blot中无信号）(图5A)，并且，如下所述，在RNAP II从ARG1公司野生型细胞中的启动子。

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图5。

需要进行磺酰化以使诱导的ARG1公司基因。(A类)ubc9-1用pGcn4-Flag质粒转化的等基因野生型细胞在28°C下生长，并从诱导前（未诱导）、添加SM后25分钟、添加五倍浓缩Val和Ile组成的停止混合物后5分钟的等分液中制备细胞裂解物。Western blot显示使用Flag抗体和8WG16抗体进行负载控制（Rpb1）的Gcn4-Flag表达。(B)SUMO和RNAP II在ARG1公司启动子（位置A图4B)在用SM诱导25分钟后测定，在向野生型（黑条）添加停止混合物5分钟后测定ubc9-1（灰色条）单元格。相关RNAP II水平的统计分析ARG1公司添加停止混合物后，表明在ubc9-1细胞，在野生型细胞中未检测到显著水平(P（P）<0.04和P（P）>与褶皱占有率等于1的零假设相比，分别为0.1）。(C,左边)成绩单丰度ARG1公司通过RT-PCR对添加SM后0和20分钟以及添加停止混合物后20和40分钟从指示样品中分离的总RNA进行测定。RNAP I转录25S RNA分析显示为对照。三次RT-PCR分析的量化显示了添加停止混合料后0、20和40分钟的值，如所示正确的，归一化为丰度ARG1公司野生型和ubc9-1细胞（停止后0分钟）。

我们使用刚才描述的策略来确定ubc9-1细胞影响失活ARG1公司为此，野生型和ubc9-1细胞用SM处理25分钟，然后用停混液处理5分钟，或用SM简单处理25分钟而不进一步处理。RNAP II占用率分析ARG1公司野生型染色质样品中的启动子表明，停止混合在失活方面非常有效ARG1公司; 添加RNAP II 5分钟后，该基因上不再检测到RNAP II(图5B，RNAP II ChIP）。带有野生型染色质的SUMO-ChIP表明，在ARG1公司启动子失活(图5B，SUMO ChIP）。因此，SUMO与ARG1公司只有当它是转录活性的。事实上，检查ARG1公司激活和失活后的启动子显示，Ubc9、SUMO和RNAP II在激活过程中表现出与启动子相似的募集模式，并且在失活后都能有效地从启动子中清除（补充图S1）。引人注目的是，在添加停止混合之前和之后对RNAP II占用的分析表明ARG1公司启动子受损ubc9-1细胞与野生型细胞进行比较。RNAP II的显著水平保持在ARG1公司启动子ubc9-1细胞加入停止混合液后5分钟，而野生型细胞此时已完全失活(图5B，右侧）。我们还检查了Gcn4是否从ARG1公司启动子受到表达Flag-tagged Gcn4的细胞中减少的全局sumoylation的影响。事实上，如补充图S2所示，Gcn4-Flag的显著水平与ARG1公司启动子ubc9-1加入停止混合液5分钟后，细胞与野生型细胞进行比较。这强烈表明，诱导基因启动子上的sumoylation通过促进启动子结合因子的清除，在转录失活中起着重要作用。

基因长时间激活ubc9-1消除激活信号后的细胞会导致转录延长和转录清除延迟。为了确定转录是否在ubc9-1与野生型细胞相比，我们测量了细胞的稳态水平ARG1公司（半衰期约为18–21分钟）(Crabell等人，1990年)添加停止混合物后，每隔20分钟进行RT–PCR(图5C，右侧显示了三个实验的量化）。衰退ARG1公司野生型细胞中的mRNA信号与预期一致，每20分钟出现约一半的信号。形成鲜明对比的是ubc9-1细胞，无减少ARG1公司在添加停止混合物后的前20分钟内观察到mRNA水平(图5C). 事实上，检测到一个轻微的增加，可能反映了RNA的积累，而转录在失活之前持续了很短时间。在第二个20分钟的时间间隔内，失活很可能完成，衰变是正常的，大约检测到一半的RNA，这表明ARG1公司mRNA半衰期不受ubc9-1突变。结合RNAP II占用的分析，这些结果表明ARG1公司转录受损ubc9-1细胞，反映启动子处的sumoylation减少。

讨论

先前的研究支持了SUMO在转录中发挥固有抑制作用的观点。例如，将人类细胞中的SUMO亚型或Ubc9靶向荧光素酶报告基因（通过融合到Gal4 DNA-结合域）导致荧光素酶活性的显著降低(Holmstrom等人，2003年；Shiio和Eisenman 2003；Chupreta等人，2005年). 事实上，在所有人类SUMO亚型和酵母Smt3中都发现了SUMO部分的一个特殊表面，在荧光素酶报告分析中具有抑制作用(Chupreta等人，2005年). 令人惊讶的是，我们的数据显示，SUMO标记了酵母中的转录活性基因，特别是当构成基因和诱导基因被激活时。此外，由于构成基因中SUMO水平的降低导致RNAP II密度有所降低，因此有效的sumoylation对优化转录至关重要。因此，虽然SUMO在某些情况下能够抑制转录，但在构成转录的自然情况下，SUMO的其他属性必须发挥作用，可能是在转录机制的组装或组织中(图6A). 例如，琥珀酰化在人类多聚腺苷化复合物在RNA底物上的适当组装中发挥作用(Vethantham等人，2007年). 此外，一些核蛋白依赖于sumoylation进行有效的核定位(Pichler和Melchior 2002). 因此，在组成转录基因中检测到的sumoylated蛋白可能是早期修饰的结果。

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图6。

酵母中SUMO在活性转录中的作用模型。(A类)在构成基因中，转录相关因子（灰色）在招募到启动子之前的sumoylation（如包围的S所示）促进启动子复合体组装或RNAP II（Pol II）的招募。(B)对于诱导基因，当激活物（Ac）以足够的浓度存在时，它与启动子结合（步骤1），并招募通用转录因子（灰色）和Ubc9（步骤2）。请注意，对于组成基因，一些转录相关因子可能在启动子招募之前被酰化。（步骤3）然而，激活期间诱导基因中Ubc9的存在和SUMO的检测表明启动子结合因子的sumoylation是激活过程的一部分。虽然还没有在诱导启动子中确定sumoylation的靶点，但激活物本身可能是靶向的，这有助于其从启动子中去除，可能是通过26S蛋白酶体对SUMO靶向泛素介导的降解（未显示）。（步骤4）当RNAP II参与转录时，SUMO介导的激活物（或其他转录因子）丢失导致启动子失活。（步骤5）如果存在足够的激活剂，清除的启动子现在可以再次被诱导；否则，转录被关闭。不能通过破坏sumoylation使启动子失活导致诱导基因的长时间激活，并降低了关闭转录的能力。

我们的分析表明，SUMO的出现和Ubc9的募集表明，诱导基因中的启动子相关因子随着激活而发生sumoylated，当激活信号不再存在时（至少对于ARG1公司). 我们没有检测到两种酵母SUMO蛋白酶Ulp1和Ulp2在ARG1公司启动子在其激活或失活过程中（E Rosonina和JL Manley，未解释），表明sumoylated启动子结合因子从失活的启动子中清除，而不是在该过程中简单地去氨酰化。在非常不同的条件下诱导的基因中观察到激活-偶发性sumoylation：添加NaCl(STL1型)，存在半乳糖(加仑1)，氨基酸饥饿(ARG1公司)和添加Cu(CUP1大学)（E Rosonina和JL Manley，未解释）。因此，我们表明启动子上的sumoylation仅在基因激活时发生，这可能是基因激活过程中以前未被认可的一个方面。因为我们发现不同类型的诱导型基因都表现出相同的sumoylation模式，所以可以合理地假设存在于所有激活基因中的一般转录机制的成分都会发生sumoylation。然而，如下文所述，基因特异性转录因子（其中许多已知为sumoylated）也可能通过涉及sumoylation的共同机制在诱导启动子处受到调控。

我们的分析支持一种模型，即SUMO在酵母中的活性转录基因中具有多重作用。以前的sumoylated蛋白在活性基因上组装，对RNAP II募集有积极影响(图6A). 这些因子在组成转录基因中检测到，但可能也有助于在激活的诱导基因中检测出SUMO信号(图6B). 在诱导基因中，启动子结合因子发生sumoylation，这有两个结果。首先，我们发现诱导启动子上的琥珀酰化对转录有抑制作用。以前已经证明转录阻遏物对激活基因的招募（例如，Mot1和NC2）(Geisberg等人，2001年,2002；赞顿和帕格2004；van Werven等人，2008年)这表明，在某些情况下，抑制因子在活性转录过程中发挥作用。其次，sumoylation在适当的时候关闭诱导基因的转录。如果可能在每一轮转录启动后，琥珀酰化作用使启动子失活，则可以解释琥珀酰化对诱导转录的两种影响。也就是说，我们的模型假设，在转录启动后，某些因子的sumoylation对于有效清除启动子是必要的，因此，如果存在足够的激活信号（激活物），它可以对另一轮激活作出反应，如果没有，则关闭(图6B). 如我们在ubc9-1细胞。在酵母核提取物中进行的固定化模板实验表明，一旦RNAP II清除启动子并启动转录，启动子中仍保留有因子支架，包括GTF和介体的子集(Yudkovsky等人，2000年). 我们认为，sumoylation是启动子清除这些因子和/或激活物的一般机制，从而调节转录水平并促进诱导基因的关闭。

启动子在每一轮转录后被清除，从而使细胞对细胞核中的激活物丰度作出反应的想法得到了一些支持，特别是对具有酸性激活域的激活物来说(Chi等人，2001年；坦西2001；Bhaumik和Malik，2008年). 泛素介导的这些激活物“耗尽”后的蛋白水解被认为可以在诱导的启动子处实现激活物的转换。这得到了检测酵母中占据大多数基因的26S蛋白酶体成分的研究的支持(Auld等人，2006年；Sikder等人，2006年). 有趣的是，这方面最有力的证据来自对Gcn4的研究，Gcn4通过RNAP II介体复合物Srb10的激酶组分留下的磷酸化标记进行泛素化，这意味着Gcn4降解与转录激活有关(Chi等人，2001年). 启动子相关因子，如酵母中的阻遏物Mot1和与人类相关的PARP-1热休克蛋白70.1启动子（见下文）是泛素化的靶点，通过SUMO靶向泛素E3连接酶（STUbL）的功能，通过先前的sumoylation实现泛素化(Martin等人，2009年；Wang和Prelich 2009). 因此，泛素介导的启动子相关因子（包括激活剂）的蛋白水解是SUMO促进诱导启动子处启动子清除/失活的一种可能机制(图6B).

我们在酵母中检测到的活性转录和sumoylated蛋白之间的联系在真核生物进化中是保守的吗？在人类细胞中，热休克导致Ubc9和SUMO2亚型补充到热休克诱导的热休克蛋白70.1启动子，其中许多与启动子相关的因子被认为是sumoyated(Martin等人，2009年)这表明我们的发现可能会被外推到更高级的真核生物。然而，在小鼠视网膜细胞中，ChIP分析表明SUMO存在于激活和抑制的光感受器特异性基因中(Onishi等人，2009年). 尽管这种现象可能是视网膜中这类基因特有的，但它与我们在酵母中的发现形成了对比，在酵母中我们没有发现证据表明SUMO与受抑制的基因有关。因此，尽管sumoylation在激活基因中的作用可能在进化上是保守的，但在高等真核生物中，SUMO似乎在维持转录抑制方面起着额外的作用。通过进化，高等真核生物可能利用了SUMO抑制转录的能力，我们在激活基因中检测到了这种能力，在保持被抑制基因沉默方面起到了额外的作用。

我们的发现有几个有趣的含义。例如，我们的分析表明，如此多的转录因子是SUMO底物的一个原因是SUMO酰化是基因激活的一个普遍方面，它调节诱导启动子的转录。此外，我们的结果表明，转录因子的sumoylation通常会对转录产生负面影响，因为sumoylion可能是清除启动子中转录因子的常见机制，因此阻断sumoyl化会导致靶基因的转录明显增加。最后，尽管已经广泛研究了激活启动子中因子的协同招募，但尚不清楚当激活信号消失且不再有效需要基因产物时，组装因子是如何从启动子中移除的，以及基因是如何被关闭的。我们的模型假设启动子结合因子的sumoylation是转录失活的一般机制，并建议关闭许多基因或单个基因的转录是一个受调控的过程。无论如何，与SUMO主要在转录抑制基因中起作用的观点相反，这里的数据表明，sumoylation是一种重要的通用机制，通过它可以在转录活跃的基因中调节基因表达。

材料和方法

致谢

脚注

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