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《公共科学图书馆·病理学》。2010年6月；6（6）：e1000947。
2010年6月10日在线发布。 数字对象标识：10.1371/日志.ppat.1000947
预防性维修识别码：PMC2883597型
PMID：20548953

耗尽型HCV特异性CD8+T细胞上PD-1、2B4、CD160和KLRG1的共表达与抗原识别和T细胞分化相关

伯特伦·本奇,#1,2,三 比安卡·塞格尔,#1,2,三 玛丽安·鲁尔,4 约格·蒂姆,4 马丁·昆茨,1 休伯特·E·布鲁姆,1 汉斯彼得·皮尔彻,5和罗伯特·蒂姆1,*
克里斯托弗·沃克，编辑器
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补充资料

摘要

慢性病毒感染期间耗尽的CD8+T细胞反应由抑制性受体的复杂表达模式定义。然而，目前关于这些受体在人类病毒特异性CD8+T细胞上的共表达模式及其与抗病毒功能、T细胞分化和抗原识别的相关性的信息很少。我们在38名慢性HCV感染患者的队列中研究了这些重要方面，发现在大约一半的HCV特异性CD8+T细胞反应中，抑制性受体（如2B4、CD160和KLRG1）与PD-1共同表达。重要的是，这种详尽的表型与CD127表达的低水平和中等水平、增殖能力受损、T细胞分化处于中间阶段以及相应表位内没有序列变异有关，表明抗原触发正在进行，剩余HCV特异性CD8+T细胞的抑制性受体低表达与CD127hi表型、早期T细胞分化阶段以及相应表位内存在病毒序列变异一致。总之，这些结果表明，T细胞衰竭导致大约一半的HCV特异性CD8+T细胞应答失败，这是由免疫学（如T细胞分化）和病毒学（如持续抗原触发）因素的复杂相互作用决定的。

作者摘要

大约1.7亿人感染了丙型肝炎病毒（HCV），这可能导致严重的肝病和肝癌。急性感染后，只有大约30%的患者能够自发消除病毒，而大约70%的患者会发生慢性感染。众所周知，对丙型肝炎病毒的成功免疫反应依赖于病毒特异性CD8+T细胞。然而，在慢性感染期间，这些细胞的抗病毒功能受损。在本研究中，我们发现衰竭以多种抑制性受体的表达为特征，如PD-1、2B4、CD160和KLRG1。值得注意的是，这些受体的共表达取决于对病毒抗原的持续识别和T细胞的成熟阶段。由于病毒突变，其余未耗尽的病毒特异性T细胞反应不再识别患者体内的病毒，表明病毒逃逸。因此，尽管它们具有完全功能记忆T细胞的特征，但它们不能发挥抗病毒活性。总之，我们发现T细胞衰竭导致大约一半的HCV特异性CD8+T细胞应答失败，这是由免疫学和病毒学因素的复杂相互作用决定的。在设计新的抗病毒疫苗接种策略时，这些发现将是重要的考虑因素。

介绍

病毒特异性CD8+T细胞在HCV感染结果中起着重要作用。事实上，几项人类和动物研究表明，强烈和多特异性T细胞反应与病毒清除之间存在关联[1]在慢性HCV感染期间，病毒逃逸和HCV特异性CD8+T细胞抗病毒功能受损，例如增殖或分泌干扰素-γ（IFN-γ）等抗病毒细胞因子的能力，都会导致病毒特异性CD8+T细胞衰竭。尽管缺乏CD4+T细胞的帮助、调节性T细胞的作用和免疫调节性细胞因子（如Il-10）的表达被认为与HCV特异性CD8+T细胞功能受损有关，但其潜在机制尚未详细阐明[1]此外，抑制性受体PD-1的表达被假定为与慢性病毒感染的小鼠模型类似，以表征慢性HCV感染中HCV特异性CD8+T细胞的衰竭状态[2]的确，对慢性HCV感染患者的分析发现血液和肝脏中HCV特异性CD8+T细胞PD-1表达水平较高[3]PD-1信号通路的阻断导致慢性感染中血源性HCV特异性CD8+T细胞反应的功能恢复[3],[4]然而，PD-1在定义耗尽的HCV特异性CD8+T细胞方面的相关性并没有受到质疑。例如，单独阻断PD-1不能恢复肝源性HCV特异性CD8+T细胞的功能[5]同时靶向额外的抑制性信号通路，使抗病毒功能恢复活力[6]此外，在人类急性HCV感染期间，PD-1的表达并不一定能识别耗竭的HCV特异性CD8+T细胞[7]和黑猩猩[8]因此，仅PD-1表达可能不足以确定HCV感染期间HCV特异性CD8+T细胞的耗竭。在这方面，值得注意的是，最近的一项研究确定，在慢性病毒感染小鼠模型中，PD-1旁边的额外抑制受体的共表达是CD8+T细胞耗竭的关键决定因素。例如，在严重的LCMV感染中，在极度耗竭的病毒特异性CD8+T细胞上发现了PD-1旁边的几个抑制性受体的表达，包括2B4和CD160[9].2B4是SLAM受体家族的协同调节受体，能够在配体CD48结合上介导激活和抑制信号[10]高水平的2B4表达与2B4抑制受体功能相关[10]事实上，2B4和CD160是一种糖基磷脂酰肌醇锚定的受体，在配体HVEM结合上共同抑制T细胞[11]，两者在基因表达分析中与PD-1表达高度相关[12]其他抑制性受体也与PD-1表达呈正相关，如与CD4密切相关的蛋白LAG-3和CD28受体家族成员CTLA-4[9]值得注意的是，抑制性受体Killer-cell-lectin-like受体G1（KLRG1）的表达与严重LCMV感染时的衰竭无关[9]KLRG1通过配体E-钙粘蛋白结合介导分化CD8+T细胞的增殖功能障碍[13],[14],[15]其上调被认为是由持续的抗原触发介导的[16].

尽管对CD8+T细胞上的抑制性受体表达有了这些见解，但目前关于慢性人类感染（如HCV）期间这些受体在病毒特异性CD8+T细胞上的共表达及其与T细胞功能、分化和抗原识别的关系的信息很少。在此，我们表明，抑制性受体（如PD1、2B4、CD160和KLRG1）的共表达发生在大约一半的HCV特异性CD8+T细胞反应中，并且与低或中等水平的CD127表达、增殖能力受损、中间T细胞分化阶段和持续的抗原再认识有关。相反，抑制性受体表达的缺失与CD127高表型和相应表位中存在病毒序列变异有关，表明病毒逃逸。这些结果表明，慢性HCV感染中HCV特异性CD8+T细胞池的功能障碍有两种不同的机制。这些结果还表明，不同的因素参与了HCV特异性CD8+T细胞衰竭的发展。

结果

HCV特异性CD8+T细胞上抑制性受体的表达

在第一组实验中，我们在10名慢性HCV感染患者的队列中筛选了HCV特异性CD8+T细胞，以检测大量抑制性受体的表达，如PD-1、2B4、CD160、KLRG1、LAG-3和CTLA-4。我们比较了HCV特异性CD8+T细胞上这些受体的表达与代表记忆群体的FLU特异性CD8+T细胞的表达。如所示图1，我们发现HCV特异性CD8+T细胞PD-1、2B4、CD160和KLRG1的表达升高，但未观察到LAG-3和CTLA-4的表达显著增加。基于这些结果，我们重点分析了38例表现出HCV特异性四聚体反应的慢性HCV患者中HCV特异CD8+T细胞PD-1、2B4、CD160和KLRG1的表达(表1). 如所示图2A，我们发现PD-1在我们的队列中高表达（中位数：88.9%）。尽管PD-1在大多数HCV-特异性CD8+T细胞反应中表达较高，但在所有HCV-特异性CD8+T细胞上均未检测到PD-1的表达(图2). 2B4由一些HCV特异性CD8+T细胞表达，中位表达率为62.0%(图2A和B)而CD160仅在部分病毒特异性CD8+T细胞上检测到（中位数：7.4%）(图2A和B). KLRG1的表达变化很大，中位数为40.8%(图2A和B).

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HCV特异性CD8+T细胞表达各种抑制性受体。

对连续10名患者针对多个免疫显性HCV表位的HCV特异性CD8+T细胞反应监测PD-1、2B4、CD160、KLRG1、CTLA-4和LAG-3的表达，并与针对免疫显性流感基质表位的病毒特异性CD8+T细胞上这些受体的表达进行比较。显示了病毒特异性CD8+T细胞上每个抑制受体的平均表达和扫描电镜。

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PD-1、2B4、CD160和KLRG1在HCV特异性CD8+T细胞上的表达。

（A） HCV特异性CD8+T细胞上抑制性受体表达的频率。每个点代表表位特异性CD8+T细胞上的抑制受体表达。研究队列中抑制性受体的中位数表达为88,9%（PD-1）、62,0%（2B4）、7,4%（CD160）和40,8%（KLRG1）。（B） 选择具有代表性的四聚体染色，以大致描述整个队列中抑制性受体表达的中位数。使用双指数变换（FlowJo 8.8.6）显示绘图。

表1

研究人群的特征。
病人性别年龄gt公司病毒载量（IU/ml）高度（单位/升）肝组织学
1米671亿不适用。90°2/°2
2（f）701亿 7208937 60 °2/°3–4
三米521亿140930085不适用。
4米30第1页8123039°1/°0
5米462亿400288249°2/°3
6米25第1页72965880°1/°1
7米42第1页4679963235°2/°3
8（f）655155885665°2/°2
9（f）541亿 208729 45°1/°2
10米533a年 2096500 147°2/°2
11米383a年43860741°2/°1
12米32 3a年 7691548 515 °2–3/°2–3
13（f）401亿140000035°1/°0
14（f）691亿 297000 60°1/°2
15米51第1页120168098°2/°2–3
16（f）44第1页68591062不适用。
17（f）70第1页 1887862 219°2/°2
18（f）631亿2568188104°1/°2
19（f）553a年81929368°3/°3
20米31第1页791341287°1/°1
21（f）571亿3160130101°1/°3
22（f）251亿50658112°1/°0
23（f）671亿42722034°1/°2
24（f）301亿3749954°0/°0
25米58第1页3802978177 °1/°3
26（f）48第1页36363643不适用。
27米281亿7894733°2/°1
28米40第1页382481163°2/°1
29米54第1页3185390133°2/°3
30（f）611亿1537679184°2/°1
31（f）551亿99500040°3/°1
32（f）431亿17180334 °0/°0
33（f）56第1页93811491°2/°1
34米36第1页499991075°1/°2
35米40第1页401123143°2/°2
36米41第1页136002065°3/°2
37（f）541亿29732265°1/°1
38（f）45第1页131676025 °0/°1
根据METAVIR评分，对肝脏活检的炎症程度/纤维化程度进行评级。阿伯丁。f、 女性；gt，HCV基因型；m、 雄性；不适用。

抑制性受体的表达与HCV特异性CD8+T细胞上CD127的低水平表达有关

以前，我们已经证明HCV特异性CD8+T细胞由具有不同表型和功能特性的子集组成，这些特性可以通过CD127表达来定义[17]因此，我们询问CD127的表达是否与HCV特异性CD8+T细胞的抑制性受体PD-1、2B4、CD160和KLRG1的表达有关。为了解决这个问题，我们对HCV特异性CD8+T细胞上的抑制受体和CD127进行了协同分析。取决于CD127的表达水平(图S1)，我们定义了三组HCV特异性CD8+T细胞，如图3A：CD127高（hi）组有80%以上的表位特异性CD8+T细胞表达CD127，CD127中间（mid）组有50-80%的CD127表达，以及CD127低（lo）组CD127的表达低于50%。重要的是，我们发现CD127的表达与HCV特异性CD8+T细胞上抑制性受体的表达之间存在明确的关联。事实上，CD127lo细胞高度表达PD-1（中位数97.5%）、2B4（中位数80.0%）和CD160（中位数19.3%）(图3B). CD127mid细胞表达PD-1（中位数86.7%）、2B4（中位数66.4%）和CD160（中位数8.9%）水平略有降低。相反，CD127hi细胞PD-1（中位数48.3%）、2B4（中位数35.7%）和CD160（中位数3.3%）的表达显著降低(图3B). 与CD127mid和CD127hi表型相比，KLRG1在具有CD127lo表型的HCV特异性CD8+T细胞上的表达也更高（67.1%对40.8%对25.0%）(图3B). 然而，与PD-1、2B4和CD160相比，两组之间KLRG1表达的范围差异更大。接下来，我们用多抑制性受体染色法分析了10例患者中HCV特异性CD8+T细胞在单细胞水平上抑制性受体的共表达(图S2). 如所示图3CCD127lo表型与HCV特异性CD8+T细胞共存多个抑制受体的高频率相关。与CD127hi细胞相比，CD127mid HCV特异性CD8+T细胞的抑制性受体共表达谱降低。例如，在我们的队列中，超过80%的CD127lo细胞共表达2个或更多的抑制性受体，而在不到55%的CD127mid细胞中发现共表达(图3C). 相反，CD127hi表型与低水平或无水平的抑制性受体共表达相关。这些结果清楚地表明，HCV特异性CD8+T细胞共表达多种抑制性受体与CD127表达水平低有关。

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抑制性受体表达与CD127表达水平呈负相关。

（A） 根据CD127表达水平可以区分三组HCV特异性CD8+T细胞反应。CD127的高表达水平（>80%）以黑色圆圈显示，CD127中等表达水平（50-80%）以灰色圆圈显示和CD127低表达水平（<50%）以白色圆圈显示。（B） CD127hi（黑色圆圈）、CD127mid（灰色圆圈）和CD127lo（白色圆圈）HCV特异性CD8+T细胞显示出抑制性受体PD-1、2B4、CD160和KLRG1的表达。在PD-1表达（p＜0.0001）、2B4表达（p＜0.0001）、CD160表达（p＜0.05）和KLRG1表达（p＜0.0001）方面，CD127亚组之间的抑制性受体表达存在显著差异。（C） HCV特异性CD8+T细胞上抑制性受体在单细胞水平上的共表达。显示了给定表位中HCV特异性CD8+T细胞表达0（白色）、1（浅灰色）、2（灰色）、3（深灰色）或4（黑色）抑制受体的频率。显示了CD127hi表位（pt.4-NS3-1406）、CD127mid表位（pt.26-NS3-1406）和CD127lo表位（pt.4-NS5-2594）的代表性图表。抑制性受体的共表达与CD127的表达呈负相关。

CD127lo HCV特异性CD8+T细胞上抑制性受体的共表达与增殖能力受损相关

接下来，我们询问CD127lo CD8+T细胞上多个抑制性受体的共表达是否定义了功能受损的HCV特异性CD8+T细胞，表明其功能衰竭。我们通过刺激CD127lo、CD127mid和CD127hi HCV特异性CD8+T细胞抗原一周来解决这一问题，并通过分析存在或不存在PD-L1阻断的后续增殖。值得注意的是，我们发现这些组之间在增殖能力和PD-L1阻断作用方面存在显著差异(图4). 事实上，与CD127mid和CD127lo-HCV特异性CD8+T细胞相比，CD127hi-HCV特异性CD8+T细胞在抗原刺激后的增殖能力要高得多。如所示图4A和4E表达多种抑制受体的CD127lo HCV特异性CD8+T细胞在抗原刺激后增殖不良。然而，阻断抑制性PD-1/PD-L1信号通路后，这些细胞可以部分恢复活力，表明它们处于功能性可逆衰竭状态。CD127mid HCV特异性CD8+T细胞在抗原刺激后表现出更强的增殖能力(图4B). 与CD127lo和CD127mid细胞相比，CD127hi HCV特异性CD8+T细胞增殖旺盛(图4C)仅用肽刺激。额外的PD-L1封锁只导致扩散略有增加。在随后对15名患者进行的分析中，我们发现PD-L1阻断导致HCV特异性CD8+T细胞的增加是CD127lo细胞的2.2倍。与CD127mid（1.5倍）和CD127hi细胞（1.2倍）相比，这种增加明显更高（p<0.01）(图4D). 这些结果表明CD127lo HCV特异性CD8+T细胞功能受损体内并且在功能上依赖于抑制性受体阻滞剂，表明疲劳。

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增殖能力和衰竭与CD127表达呈负相关。

通过15名患者短期培养中PBSE荧光的减少来测量在PD-L1阻断剂存在或不存在的情况下肽刺激后HCV特异性CD8+T细胞的增殖。显示了（A）CD127lo（pt.4-NS5-2594）、（B）CD127mid（pt.13-NS3-1073）和（C）CD127hi（pt.32-NS5-2594，HCV-特异性CD8+T细胞的代表性染色。（D） 比较依赖PD-L1阻断的增殖增加。描述了比率的平均值和SEM（肽刺激后HCV特异性CD8+T细胞的频率和肽刺激后PD-L1阻断/HCV特异性CD8+T细胞的频率）。该比率反映了除肽刺激外PD-L1阻断的效果。在分析的队列中，PD-L1阻断对肽刺激的CD127lo细胞（平均2.2）比CD127mid（平均1.5）和CD127hi细胞（平均1.2）更有效（p<0.01）。（E） PD-L1阻滞存在（右侧）和不存在（左侧）时肽刺激HCV特异性CD8+T细胞的增殖指数。增殖指数（PI）通过公式（培养后HCV特异性CD8+T细胞的频率/HCV特异性CD8+T细胞的离体频率）计算，并反映细胞的增殖能力，与CD127mid和CD127lo细胞相比，CD127hi HCV特异性CD8+T细胞的增殖能力最高。

特异性抑制受体的表达与T细胞分化阶段有关

以前已经证明，抑制性CD8+T细胞受体（例如PD1）的表达与T细胞分化阶段有关[18],[19]因此，我们询问CD127和我们研究中分析的所有抑制性受体的共表达是否与T细胞分化的某些阶段有关。为了进行该分析，我们使用基于CD27、CCR7和CD45RA表达的线性模型评估了胸腺后人类CD8+T细胞分化，如图5A [18]CD127在幼稚和早期T细胞亚群（亚群1和2）中表达最高，但在晚期分化的CD8+T细胞中表达降低，表明CD127的表达与T细胞分化的早期阶段有关(图5B). 与之前的研究一致，PD-1在中分化CD8+T细胞（亚群3）上的表达最高，在初分化和晚分化CD8+T细胞上的表达最低[19](图5C). 有趣的是，2B4、CD160和KLRG1的表达模式并不反映PD-1的表达模式，但显示出独特的个体特征。2B4在幼稚CD8+T细胞上的表达最低，但随着分化亚群的增加而逐渐增加，在晚期分化的CD8+T细胞上几乎达到100%的表达(图5D). CD160在原始T细胞中表达最低，在进一步分化的亚群中表达增加，在中间亚群3和晚期分化的T细胞亚群5中有两个表达高峰(图5E)而KLRG1的表达模式与2B4相似，在幼稚和早期亚群中低，但在晚期分化亚群中丰富(图5F). 总的来说，这些结果表明，进一步分化的CD8+T细胞表达了越来越多的抑制性受体。然而，由于每个标记的表达模式都非常不同，一个抑制性受体的表达并不一定表示其他受体同时表达。因此，我们询问抑制性受体2B4、CD160和KLRG1与PD-1是否在特定的T细胞分化亚群中同时表达。的确，如所示图6，我们发现中间T细胞亚群3中所有标记物的共表达水平最高。这些结果表明，抑制性受体表现出与T细胞分化相关的独特表达模式，并且2B4、CD160和KLRG1与PD-1的共表达表明在中分化而非晚分化的CD8+T细胞亚群中发生衰竭。

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受体表达谱与T细胞分化有关。

（A） 通过CD27、CCR7和CD45RA差异表达评估CD8+T细胞分化阶段的示意图概述。（B–F）CD127和抑制性受体PD-1、2B4、CD160和KLRG1在单个CD8+T细胞分化亚群中的表达。每个点代表CD127或抑制性受体在CD8+T细胞上的表达频率，这些细胞属于单个患者的特定分化子集。

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2B4、CD160和KLRG1与PD-1的共表达与中间分化阶段有关。

CD8+T细胞与PD-1相邻的抑制性受体2B4、CD160和KLRG1共存的频率取决于分化阶段，如图5A通过将共表达CD8+T细胞总数除以共表达CD8+T细胞所分析的5个分化亚群中共表达CD8-T细胞的数量来计算值。共分析了5名患者。

最后，我们询问是否在HCV特异性CD8+T细胞群中也能发现相同的关联。如所示图7与之前的研究结果一致，我们观察到HCV特异性CD8+T细胞主要由早期和中期分化的T细胞组成。有趣的是，HCV特异性CD127hi、CD127mid和CD127lo细胞的分化差异显著（p<0.0001）。大多数CD127hi细胞属于早期分化亚群2，而CD127mid细胞在亚群2和亚群3中的分布水平相当。相反，在中间亚群3中显著发现HCV特异性CD127lo细胞。记住，中间亚群3中抑制受体的共表达最高，并且与CD127lo表型相关，这些结果清楚地表明CD127表达、T细胞分化和T细胞衰竭之间存在复杂的联系。

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HCV特异性CD8+T细胞分化的差异取决于CD127的表达。

HCV特异性CD8+T细胞在分化亚群中的频率图5A描述了CD127hi（黑圈）、CD127mid（灰圈）和CD127lo（白圈）响应。CD127亚组之间的分化亚组2（p<0.0001）和亚组3（p<000001）存在显著差异。大多数CD127hi反应在亚群2中发现（中位数为64,8%），而大多数CD127lo细胞在亚群3中观察到（中位数为68,1%）。CD127mid细胞在亚组2（中位数38,7%）和亚组3（中位数45,7%）中的分布水平相当。

CD127lo CD8+T细胞上抑制性受体的表达依赖于持续的抗原识别

在最后一组实验中，我们着手确定抑制性受体在表型和功能上不同的HCV特异性CD8+T细胞群中的差异表达是否与特定患者的自身病毒序列有关。为了解决这个问题，我们对与识别的CD8+T细胞表位相对应的基因型1患者的自体病毒序列进行了测序(表2). 重要的是，在抑制性受体低表达的CD127hi HCV特异性CD8+T细胞靶向的表位中，基因型一致序列的序列变异明显更为普遍（p<00001）(图8A). 我们证实，这些序列变异通过用与自体序列和共有序列相匹配的肽刺激HCV特异性CD8+T细胞，在一些患者中代表病毒逃逸。事实上，正如在图8B，HCV特异性CD8+T细胞在用共有序列肽刺激时产生高水平的IFN-γ，但在用变体自体肽刺激时不产生。此外，这些HCV特异性CD8+T细胞的增殖在变异自体肽刺激下显著降低，表明病毒逃逸（数据未显示）。这些结果表明，病毒逃逸突变与CD127hi表型相关，而CD127mid或CD127lo表型与自体病毒序列的持续抗原识别相关。为了进一步验证这一假设，我们分析了来自多个免疫显性T细胞反应患者的HCV特异性CD8+T细胞，这些反应在不同的表位中包含一致序列和变异序列。事实上，根据病毒序列（患者4，图8C,表2). 事实上，尽管两种免疫显性反应的检测频率相当(图S3)，所有NS3-1406特异性CD8+T细胞均表达CD127，但PD-1（14.3%）、2B4（4.17%）、CD160（2.09%）和KLRG1（25.0%）水平较低，而NS5-2594特异性CD8+T细胞则表现出相反的表型，其中只有9.09%的CD127表达，而PD-1（86.7%）、2C4（81.8%(图8C、8D). 这些结果强调了抑制性受体共表达的机制以表位特异性的方式运作，这取决于自体病毒序列。为了进一步验证抑制性受体的低表达和CD127的高表达确实是由缺乏抗原触发引起的假设体内，我们用共识肽刺激CD127hi HCV特异性CD8+T细胞在体外重要的是，这种肽特异性刺激在培养7天后诱导CD127下调和抑制性受体表达上调（如图9). 总之，CD127表达的下调和抑制性受体在抗原刺激后的上调表明，缺乏抗原触发体内导致CD127hi表型的抑制性受体低表达。与此假设一致，我们发现病毒特异性CD8+T细胞靶向表位而无序列变异，CD127低表达，抑制受体高表达，表明正在进行抗原识别(图8A). 这些结果也强调了在旨在研究病毒特异性CD8+T细胞衰竭机制的研究中评估自体病毒序列的重要性。

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抑制性受体的表达与病毒抗原的识别有关。

（A） HCV特异性CD8+T细胞的CD127表达取决于自体病毒序列。交叉再认识被定义为与先前已被证明是交叉认识的共识的序列变异[39]（B）具有不同自体序列患者的PBMC（参见表2)用不同浓度的共识肽（黑线）或变异自体肽（虚线）短期培养后刺激IFN-γ表达。所示为pts的代表图。4、24–27和32。IFN-γ表达频率显示在y轴上，肽浓度（µM）显示在x轴上。自体肽序列刺激后IFN-γ的产生显著减少表明病毒逃逸。（C） 针对NS3-1406和NS5-2594表位的单个个体（第4部分）的两个表位上HCV特异性CD8+T细胞的CD127差异表达。（D） 叠加患者4的NS3-1406特异性CD8+T细胞（CD127hi）和NS5-2594特异性CD8+T细胞上PD-1、2B4、CD160和KLRG1表达的直方图。

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抗原刺激后CD127hi细胞抑制性受体表达上调。

代表性患者24（总n=14）的叠加直方图显示了刺激前和刺激后7天HCV特异性CD8+T细胞上CD127、PD-1、2B4、CD160和KLRG1表达的比较。

表2

表位序列分析及其与CD127表达的相关性。
铂gt公司NS3-1073型%CD127型NS3-1406型%CD127型NS5-2594型%CD127型第5-2841页%CD127型
1 1亿 CVNGVCWTV公司 0.06 洛
2 1亿 CVNGVCWTV公司 0.01 洛
三 1亿 不适用。 0.07 洛
4 第1页 KLVALG公司V（V）资产净值 0.02 你好 ALYDVVSKL公司 0.03 洛
6 第1页 CINGVCW公司硅 0.02 洛
7 第1页 CINGVCWT公司A类 0.01 你好
9 1亿 KLSGLGLNAV公司 0.17 你好
13 1亿 不适用。 0.03 中间
14 1亿 CVNGVCWTV公司 0.02 洛
15 第1页 CINGVCWTV电视台 0.12 洛
16 第1页 CINGVCWTV电视台 0.05 洛 ALYDVVSKL公司 0.03 洛
17 第1页 不适用。 0.02 洛 不适用。 0.02 洛
18 1亿 CINGVCWTV电视台 0.01 洛
20 第1页 CINGVCWTV电视台 0.01 中间
21 1亿 C我NGVCWTV公司 0.02 中间
22 1亿 CL（左）NGVCWTV公司 0.10 中间
23 1亿 CVNGVCWTV公司 0.02 洛
24 1亿 V（V）RMIL公司A类四氢呋喃 0.18 你好
25 第1页 CINGVCW公司S公司V（V） 0.03 你好
26 第1页 CINGVCWTV电视台 0.03 洛 KLVALG公司V（V）资产净值 0.04 中间
27 1亿 V（V）RMI公司M（M）MTHF公司 0.16 你好
28 第1页 CINGVCWTV电视台 0.04 洛
29 第1页 CINGVCWTV电视台 0.27 洛
30 1亿 CVNGVCWTV公司 0.10 洛
31 1亿 CVS公司全球价值链电视 0.13 你好
32 1亿 C我NGVCWTV公司 0.01 中间 吉隆坡V（V）GLGLNAV公司 0.02 你好 ALYDVVS公司K（K）L（左） 0.20 你好
33 第1页 扣带A类 0.05 你好 克伐吉纳夫 0.07 中间 ALYDVVSKL公司 0.06 洛
34 第1页 CINGVCWTV电视台 0.02 中间
35 第1页 CINGVCWTV电视台 0.12 洛
36 第1页 CINGVCWTV电视台 0.01 中间
37 1亿 CVNGVCWTV公司 0.03 洛
38 第1页 CINGVCWTV电视台 0.03 洛
反对的论点 第1页 CINGVCWTV电视台 KLVALGINAV公司 ALYDVVSKL公司 ARMILMTHF公司
反对的论点 1亿 CVNGVCWTV公司 KLSGLGLNAV公司 ALYDVVSTL公司 ARMILMTHF公司
从基因型1的患者中获得自体病毒序列，这些患者具有针对免疫显性表位的可检测到的HCV特异性CD8+T细胞反应。识别这些表位的T细胞上的CD127水平显示在四聚体频率和相应序列的旁边（高：>80%CD127表达，中：50-80%CD127表示，低：<50%CD127表现）。基因型1a和1b的一致序列如下所示。与变异自体序列不同的氨基酸以粗体突出显示。缩写：Con，共识序列；gt，HCV基因型；不适用；患者Pt。

讨论

在这里，我们研究了慢性HCV感染期间病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达及其与CD127表达、增殖能力、T细胞分化和抗原识别的关系。我们发现HCV特异性CD8+T细胞表达抑制性受体的特定模式。事实上，在我们的队列中检测到的HCV特异性CD8+T细胞应答的很大一部分在PD1旁边共存2B4、CD160和KLRG1。鉴于Blackburn等人最近的一项研究，这些结果令人感兴趣。该研究表明，抑制性受体（包括PD-1旁边的2B4、CD160、LAG-3和CTLA-4）的特定表达模式与LCMV感染小鼠中病毒特异性CD8+T细胞的严重耗竭之间存在明确的关联[9]有趣的是，在我们的研究中，我们没有观察到HCV特异性CD8+T细胞上LAG-3和CTLA-4的显著表达。然而，这些结果并不令人惊讶，因为先前已经表明，HCV特异性CD8+T细胞的CTLA-4表达仅在一定程度上在肝脏中可检测到，而在慢性感染患者的血液中不可检测到[5]此外，对小鼠耗尽的CD8+T细胞的基因表达分析表明，与2B4和CD160共表达相比，LAG-3和CTLA-4共表达与PD-1的相关性较弱[12]因此，这些综合结果表明，耗尽的CD8+T细胞具有抑制性受体表达的动态层次模式，其中2B4和CD160发挥着显著作用[12]因此，我们的结果表明，HCV特异性CD8+T细胞中有很大一部分显示典型的衰竭标志。重要的是，几组研究人员报告了HCV特异性CD8+T细胞衰竭，即CD8+T细胞功能丧失，例如增殖和细胞因子分泌[4],[5],[20],[21],[22]我们的研究结果表明，在慢性丙型肝炎病毒感染期间，靶向耗尽的CD8+T细胞可能不仅需要阻断一条抑制性受体通路，还需要靶向多种抑制性通路的抗体混合物[6]与这些发现一致，我们观察到PD-1/PD-L1阻断后耗尽的CD127lo HCV特异性CD8+T细胞增殖仅增加2.2倍(图4D). 在CD127hi HCV特异性CD8+T细胞中，PD-1/PD-L1阻断导致的增殖增加甚至更小，然而，这可以通过发现这些细胞在没有阻断的情况下剧烈增殖来解释，这表明它们没有被显著抑制(图4C–E和[17]). 显然，一旦有合适的阻断剂可用，其他研究应解决2B4、CD160和KLRG1受体阻断对衰竭T细胞的影响。

2B4是一种协同调节受体，能够介导CD8+T细胞中的激活和抑制信号[23]它以前被认为是人类主要的激活受体[24]然而，最近的一项研究探讨了小鼠和人2B4受体信号的双重作用，发现人和小鼠2B4都可以发挥抑制或激活受体功能[10]重要的是，高水平的2B4表面表达与抑制2B4功能有关，而低水平的2B4表面表达促进激活2B4信号[10]根据我们研究中分析的数据，我们不能排除在HCV特异性CD8+T细胞上结扎2B4可能导致共刺激信号。然而，我们使用严格的门控策略，仅在表面高表达水平为2B4的细胞上确定2B4阳性(图2B以及未显示的数据），表明2B4可能在这些细胞上起抑制受体的作用。需要进一步的研究来阐明病毒特异性CD8+T细胞上2B4的表达是否确实促进了抑制信号。

值得注意的是，我们观察到HCV特异性CD8+T细胞上KLRG1表达水平显著(图1,​,2).2). 重复抗原刺激后，病毒特异性CD8+T细胞上调KLRG1，并经常用作T细胞分化的标记[16],[25]虽然KLRG1的表达与小鼠耗尽CD8+T细胞的PD-1共表达无明显相关性，但在大量耗尽CD8+T细胞上发现了这一点[9],[12]由于KLRG1的上调是由重复的抗原刺激诱导的，因此很可能KLRG1的表达并不直接反映T细胞的耗竭，而是反映正在进行的抗原识别，然而，这本身被认为是CD8+T细胞耗竭发展的先决条件[26],[27].

我们的结果还表明，抑制性受体PD-1、2B4、CD160和KLRG1的表达水平与细胞分化的特定阶段有关。最近，人类CD8+T细胞分化的线性模型被开发出来，用于区分原始、早期、中期和晚期分化细胞[28]CD8+T细胞的分化状态受抗原刺激史、克隆细胞分裂、端粒长度和CD8+T细胞增殖能力的影响[18]在这里，我们发现PD-1在具有中间T细胞分化表型的CD8+T细胞上的表达最高。相反，晚分化CD8+T细胞对2B4、CD160和KLRG1表达有差异(图5). 然而，在中间T细胞分化阶段，所有抑制性受体的共表达水平最高(图6)表明CD8+T细胞的耗竭很可能与该特定亚群有关。目前尚不清楚，在缺乏PD-1的情况下，晚分化细胞共同表达抑制性受体2B4、CD160和KLRG1是否也可以定义耗尽的CD8+T细胞的特定亚群。然而，这是不太可能的，因为晚期T细胞分化的T细胞共同表达抑制性受体2B4和CD160已被证明定义了功能性细胞毒性CD8+T细胞群[24],[29].

我们研究的另一个重要发现是，HCV特异性CD8+T细胞上抑制性受体的共表达与CD127的表达水平有关。我们之前描述过HCV特异性CD8+T细胞亚群的存在，这些细胞具有不同的功能特性，可以通过CD127表达水平来区分[17]这里，我们根据CD127表达水平将HCV特异性CD8+T细胞分为三组：CD127lo、CD127mid和CD127hi细胞。CD127lo HCV特异性CD8+T细胞表达与效应细胞相关的标记物，在增殖方面功能失调，而CD127hi细胞在表型和功能上与记忆性CD8+T细胞相似[17]抗凋亡分子的表达增加也反映了这些类似记忆的特性[30],[31](图S3). 在这里，我们发现，PD-1旁边的抑制性受体的高共表达仅限于增殖能力受损的CD127lo HCV特异性CD8+T细胞，PD-1/PD-L1信号传导阻断后可使其恢复活力，因此，与这些细胞受损的功能状态密切相关。我们还发现，HCV特异性CD8+T细胞并不代表同质分化的CD8+T细胞群。这一新发现是通过使用多色流式细胞术实现的，该细胞术使我们能够同时对HCV特异性CD8+T细胞进行染色，以获得Appay等人推荐的一组分化标志物。[18]并扩展了以前关于使用常规4色流式细胞术分化HCV特异性CD8+T细胞的报告[18],[28]值得注意的是，对于CD127hi、CD127mid和CD127lo细胞，HCV特异性CD8+T细胞的分化阶段存在显著差异(图7). 此外，HCV特异性CD8+T细胞的中间分化以多种抑制性受体的共表达为特征（如CD127lo细胞所显著观察到的），与在普通CD8+T细胞群中观察到的中间分化亚群中的抑制性受体共表达相关。由于这些结果强调了慢性HCV感染期间存在表型和功能上非常不同的HCV特异性CD8+T细胞群，这可以分别通过CD127和抑制性受体的差异表达来定义，在未来分析HCV特异性CD8+T细胞的研究中，区分这些人群将非常重要。

我们研究的另一个重要发现是，病毒特异性CD8+T细胞抑制受体的表达与持续的抗原识别和病毒逃逸的缺失有关。由于我们无法分析最初感染患者的病毒序列，因此我们无法观察到逃逸突变的发展，正如最近对急性丙型肝炎病毒感染的纵向研究所显示的那样[32],[33]，我们假设大多数患者感染了基因型一致序列(表2). 这种方法有一些局限性，例如，不能排除先前感染的残余物与替代基因型或不同表位序列混淆了我们的分析（例如，自体表位序列与一名CD127hi患者的基因型一致序列相匹配（受试者9的NS3-1406表位））。此外，不可能分析与CD127hi T细胞反应靶向的异源基因型序列相匹配的变异表位是否代表病毒逃逸，或者T细胞反应是否代表先前用替代基因型（例如受试者32中的NS5-2594表位）解决感染的残余物。显然，这些问题只能在HCV感染患者的队列中解决，其中接种顺序和感染前T细胞反应的信息是已知的。然而，CD127在病毒特异性CD8+T细胞上的高水平表达与共有表位的自体序列变异存在明显关联，在大多数情况下，使用变异体肽而非共识肽刺激后，IFN-γ生成减少和CD8+T细胞增殖减少支持我们的方法。值得注意的是，我们还发现PD1旁边的抑制性受体的表达水平与不存在表明正在进行抗原识别的序列变异之间存在明显关联。这些结果与最近的研究一致，研究表明高水平的特异性抗原会导致CD8+T细胞衰竭[27]CD8+T细胞的衰竭可以通过病毒逃逸突变的出现来阻止，这种突变会破坏表位识别[34]与这些发现一致，病毒序列变异的出现与急性和慢性HCV感染中PD-1表达减少和CD127表达上调相关[32],[33]和HIV感染[35]值得注意的是，我们在大约一半的靶向T细胞表位中观察到序列变异。虽然我们研究中分析的HCV特异性CD8+T细胞表位数量有限，因此很难对HCV特异的CD8+T细胞表位中病毒逃逸的一般频率得出确切的结论，我们的结果与最近的研究一致，这些研究也表明，约50%的靶向CD8+T细胞表位中存在病毒逃逸突变[36],[37]因此，CD8+T细胞衰竭、病毒逃逸和T细胞耗竭的两种机制（由多个抑制性受体共同表达定义）似乎对病毒的无效控制起着重要作用，并且它们可以通过特定的表面表达模式很容易识别。

总之，我们的结果表明，耗尽的HCV特异性CD8+T细胞共同表达抑制性受体与CD127表达、增殖能力、T细胞分化阶段和持续的抗原识别有关。因此，免疫学和病毒学因素的复杂相互作用决定了人类慢性病毒感染中T细胞的耗竭。这些发现对于合理设计慢性HCV感染的免疫治疗策略也具有重要意义，因为只有耗尽的CD8+T细胞仍能识别当前的病毒抗原，因此应以免疫调节策略为目标。

材料和方法

研究小组

在获得患者书面知情同意并经弗莱堡阿尔伯特·卢德维格斯大学伦理委员会批准后，38名在弗莱堡大学医院肝病门诊就诊的慢性HCV感染患者被纳入研究，这些患者可检测到HCV特异性CD8+四聚体反应。所有调查都是根据《赫尔辛基宣言》中表达的原则进行的。研究人群的特征包括表1.

丙型肝炎病毒载量和测序

如前所述，检测HCV病毒载量和表位测序[37].

淋巴细胞分离

如前所述，对患者血液中的淋巴细胞进行分析[17].

肽和四聚体

与免疫显性HLA-A2-和HLA-B27-表位（序列CINGVCWTV、KLVALGINAV、ALYDVVTKL、ARMILMTHF）和变异自体患者序列相对应的肽来自德国柏林Biosynthan。这些肽在100%二甲基亚砜（Sigma-Aldrich，德国）中溶解20 mg/ml，并在使用前用RPMI 1640（Gibco）进一步稀释至1 mg/ml。HLA-A2和HLA-B27四聚体是从亚特兰大埃默里大学的国家四聚体核心设施获得的。含有免疫显性GILGFVFTL肽的流感特异性五聚体购自英国牛津ProImmune。

抗体

以下试剂用于多色染色：抗2B4-FITC、抗CD27-APC-eFluor780、抗CD45RA-PerCP-Cy5.5、抗PD-1-PE、抗CD127-APC Alexa-Fluor 750、抗CD124-APC-eFluor 780、反CD127-Pacific Blue、抗IgM-PerCPeFluor710、链霉亲和素-eFluor V450（Ebioscience）、抗Bcl-2-PE、抗CCR7-PE-Cy7、抗CD28-FITC、，抗CD38-PE、抗CD8-APC H7、抗CD8 AmCyan（BD Biosciences）、抗CD127-PE、抗CD160-PE、反CD57-FITC（Beckman Coulter）、抗CTLA-4-FITC、抗CD3-PerCP、抗CD160-FITC，纯化抗CD160（BioLegend）、抗LAG-3-Atto488（Alexxis）、抗LA G-3 FITC（LifeSpan Bioscies）、抗L AG-3-PE（R&D）。Viaprobe（7-AAD，BD Biosciences）用于死细胞排除。如前所述，产生抗KLRG1-AlexaFluor488和抗KLRG1-生物素抗体[16].

多色流式细胞术

如前所述进行四聚体和抗体染色[17]对于多抑制性受体染色，细胞首先用CD160 IgM纯抗体染色，然后用抗IgM-PerCP二级抗体染色，然后用KLRG1生物素抗体染色，然后用链霉亲和素-eFluorV450抗体染色。然后用四聚体孵育细胞，然后用荧光团缀合的抗体（CD8-AmCyan、2B4-FITC、PD-1PE、CD127-APC-eFluor780）染色。每个染色步骤的培养时间为15分钟，细胞在添加染色试剂之间清洗两次。

样品在FACS Canto II流式细胞仪（BD Biosciences）上采集，并使用FlowJo v8.8.6软件（TreeStar Inc.）进行分析。根据建议，通过荧光减一对照染色确定多色面板中的阳性门[38].

扩散和阻断分析

用40µM太平洋蓝琥珀酰亚胺酯（PBSE，Invitrogen）标记2*10∧6新鲜分离的PBMC，并在1 ml完整培养基（含有10%胎牛血清、1%链霉素/青霉素和1.5%Hepes缓冲液1 mol/L的RPMI 1640）中加入20 IU/ml rhIl-2（Roche），用10µM肽刺激。在37°C下，在有或无10µg/ml抗PD-L1（Ebioscience）的条件下培养细胞一周，然后通过多色流式细胞仪进行染色和分析。PD-L1阻断依赖性增殖增益由以下比率决定：肽刺激和PD-L1阻滞后HCV特异性CD8+T细胞的频率除以肽单独刺激后的频率。通过将刺激后HCV特异性CD8+T细胞的频率除以频率计算增殖指数体外.

统计分析

使用GraphPad Prism 5软件（GraphPad-Prism software，Inc.）进行统计分析。使用的统计检验是方差分析1法，然后是纽曼-凯尔斯多重比较检验(图3,​,44,​,7),7)和Mann-Whitney U测试(图8).

支持信息

图S1

评估CD127频率的选通策略。病毒特异性CD8+T细胞通过四聚体染色测定，CD127阳性阈值由FMO对照确定。显示了（A）CD127hi HCV-特异性CD8+T细胞（pt.4-NS3-1406）和（B）CD127lo HCV-特定性CD8+T细胞（pt.4-NS5-2594）的代表性假彩色图。

（0.43 MB畅通节能法）

图S2

HCV特异性CD8+T细胞的多抑制受体分析。PD-1、2B4、CD160和KLRG1在CD8+四聚体+T细胞上的共表达测定如下：A）四聚体+HCV特异性CD8+T细胞群在淋巴细胞门的CD8+T细胞上进行门控。与FMO对照组相比，在CD8+人群中测定CD127和抑制性受体表达的门限。B） 这些门应用于四聚体+群体和布尔矩阵，用于确定单个HCV特异性CD8+T细胞表达的抑制受体数量。

（0.80 MB畅通节能法）

图S3

Bcl-2表达分析。在总共8名患者中，分析了HCV特异性CD8+T细胞上Bcl-2的表达。在总共8名患者中，在细胞渗透后分析HCV特异性CD8+T细胞上Bcl-2的表达。显示患者4的原始数据图，并显示四聚体阳性细胞的MFI。Bcl-2表达与CD127表达水平相关。显示的HCV特异性CD8+T细胞的抑制受体共表达如图3C.细胞渗透后。显示患者4的原始数据图，并显示四聚体阳性细胞的MFI。Bcl-2表达与CD127表达水平相关。显示的HCV特异性CD8+T细胞的抑制受体共表达如图3C.

（0.29 MB畅通节能法）

致谢

我们衷心感谢所有为本研究献血的患者。

脚注

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

这项研究得到了德国研究院海森堡教授TH-719/3-1对RT的支持，并得到了德国研究基金会卓越倡议（GSC-4，斯佩曼研究生院）对BB和BS的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定，或准备手稿。

工具书类

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