Activation of Hepatic Stellate Cells After Phagocytosis of Lymphocytes: A Novel Pathway of Fibrogenesis

Nidal Muhanna; Sarit Doron; Ori Wald; Amjad Horani; Ahmed Eid; Orit Pappo; Scott L. Friedman; Rifaat Safadi

doi:10.1002/hep.22413

肝病学。作者手稿；PMC 2010年6月3日发布。

以最终编辑形式发布为：

肝病学。2008年9月；48(3): 963–977.

数字对象标识：10.1002/hep.22413

PMCID公司：项目经理2880478

美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院205538

PMID：18726940

淋巴细胞吞噬后肝星状细胞的激活：一种新的纤维化途径

妮达尔·穆哈娜,萨里特·多隆,¹ 奥里瓦尔德,¹ 阿姆贾德·霍拉尼,¹ 艾哈迈德·艾德,² 奥里特·帕波,^三斯科特·弗里德曼,⁴和里法特·萨法迪⁵

作者信息版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

CD8-T淋巴细胞增加和自然杀伤（NK）细胞减少导致肝纤维化。我们已经确定了调节人类肝星状细胞（HSC）与特定淋巴细胞0020亚群相互作用的途径体内和在体外使用荧光激活细胞分选（FACS）对健康对照组和乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）晚期纤维化患者的人外周血淋巴细胞（PBL）和肝内淋巴细胞（IHL）进行特征分析。用免疫组织化学和共焦显微镜分析肝脏切片。调查在体外相互作用，健康对照组或HCV肝硬化患者的PBL与永生化人HSC系（LX2细胞）或原代HSC共同培养。在IHL中发现了淋巴细胞分布的显著变化，但在PBL中没有发现。HBV/HCV患者的肝脏CD4/CD8比率和NK细胞显著降低。肝硬化患者肝切片中α-平滑肌肌动蛋白的表达以及CD4、CD8和NK细胞的浸润很明显，但在健康对照组中不明显。每个亚群的淋巴细胞主要位于门脉周围区域，靠近HSC，一些直接附着或吞噬。在培养中，HCV衍生CD8亚群刺激HSC活化，但NK细胞减弱HSC活化。共焦显微镜检查发现HSC内的淋巴细胞吞噬作用被阻断细胞内粘附分子1（ICAM-1）和整合素分子或HSC照射完全阻止。Cdc42或Rac1（Rho-guanosine triphosphatase（GTPase）家族成员）的LX2敲低可阻止HCV衍生淋巴细胞的吞噬作用和HSC的激活。

结论

患有晚期人类纤维化的肝脏中CD4/CD8比率和NK细胞显著降低。此外，疾病相关但不健康的淋巴细胞被培养的HSC吞噬，这是由Rac1和Cdc42途径介导的。肝纤维化中HSC吞噬淋巴细胞是调节淋巴细胞在肝纤维化过程中作用的一种新的、潜在的重要途径。（H）人体器官学2008;48:963–977.)

与炎症细胞浸润相关的肝纤维化是乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）持续感染的一个显著特征。肝星状细胞（HSC）在被炎症细胞因子和介质激活后，在这种反应中发挥了核心作用。¹^–⁵病毒性肝炎后的细胞介导免疫反应反映了CD4+辅助性T淋巴细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞的活性。CD4+T细胞通过主要组织相容性复合体（MHC）-II与抗原提呈细胞、枯否细胞、树突状细胞和巨噬细胞的相互作用而被激活。CD8+T细胞受MHC-I限制，是清除感染细胞细胞毒性的主要机制。⁶CD4+T细胞分泌细胞因子，如肿瘤坏死因子α、干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素2。这些细胞因子负责激活巨噬细胞、枯否细胞和自然杀伤（NK）细胞，导致被感染细胞的吞噬和非特异性溶解。HCV感染期间的病毒清除是通过HCV特异性CD4+和CD8+T细胞的强烈反应实现的。⁷据认为，CD4+T细胞激活和启动是CD8+T细胞通过细胞毒效应实现病毒清除的能力所必需的。⁸^,⁹这些过程还可能导致HSC激活以应对损伤，在缺乏病毒清除的情况下，HSC随后会出现基质沉积、纤维化，最终导致肝硬化。¹⁰^,¹¹HCV特异性CD4活性与组织纤维化和门脉炎症相关。¹²^–¹⁴

HSC在病毒感染的炎症反应中的作用是基于其提供抗原和调节淋巴细胞行为的能力。¹⁵^,¹⁶虽然淋巴细胞通过粘附直接与HSC相互作用，¹⁴介导淋巴细胞和HSC相互作用的途径尚不清楚。此外，HSC是吞噬性的，这是基于其对乳胶颗粒、细菌的内化作用¹⁶以及凋亡小体。¹⁷在小鼠模型中，纤维化主要由CD8淋巴细胞直接激活HSC介导，¹⁸过继转移的CD8细胞在幼年小鼠中是成纤维的。此外，NK细胞通过杀死失去自我认知标记物MHC I类的活化HSC而显示抗纤维化活性。¹⁹^–²¹在这项研究中，我们研究了人造血干细胞和淋巴细胞亚群之间的形态学和功能相互作用。我们的结果表明，HSC不仅与淋巴细胞发生物理性相互作用，而且可能通过细胞摄取促进淋巴细胞清除。

患者和方法

研究人群

在哈达萨医院伦理委员会批准后，在知情同意的情况下，获得因慢性HBV和HCV而被转诊进行肝活检的患者的血液和肝脏样本。所有HCV患者的血清HCV抗体（Abbot）和HCV RNA（由罗氏HCV amplicor检测）均呈阳性。同样，HBV患者的血清乙型肝炎表面抗原（Abbot）和HBV-DNA（HBV Monitor，Roche）呈阳性。该队列仅包括晚期但代偿性纤维化患者。晚期纤维化是由脾肿大、血小板减少和不规则肝回声纹理的出现在临床上确定的，并通过肝活检证实Metavir F3或F4，²²由一位病理学家进行评估。没有患者有HBV/HCV、HBV/人类免疫缺陷病毒或HCV/人类免疫缺陷病毒联合感染的证据。在肝胆外科手术中，取HBV/HCV阴性患者的对照肝活检标本，用于切除血管瘤或良性肿瘤，其中使用切除病灶周围的组织学正常肝组织。

淋巴细胞分离

根据哈达萨医院伦理委员会批准的指南，从患者和健康志愿者的肝素化试管中收集人类外周血淋巴细胞（PBL）。据Boyum介绍，通过Ficoll-Hypaque（Pharmacia）离心分离单核细胞。²³在盐水中清洗三次后，细胞重新悬浮在培养基中。为了冷冻，使用了添加50%热灭活胎牛血清（FBS；Gibco）和20%二甲基亚砜的罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基，并将细胞储存在−70°C下。PBL的培养基为罗斯韦尔公园纪念研究所1640，含10%FBS。根据制造商的说明，使用磁性细胞分选试剂盒（Miltenyi Biotec）从PBL中分离出人类NK、CD4和CD8细胞。对于肝内淋巴细胞（IHL），²⁴将从穿刺活检或手术中获得的肝组织在10 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中清洗两次，以去除剩余的PBL。将组织切成1 mm块，并在2 mL罗斯韦尔公园纪念研究所1640（英国吉布科）中用IV型胶原酶孵育15分钟（新泽西州莱克伍德沃辛顿）和脱氧核糖核酸酶I（沃辛顿），温度为37°C。孵育后，将组织通过1mL移液管，然后通过细胞过滤器荧光激活细胞分选（FACS）管过滤（加州山景城Becton Dickinson）。在92℃下清洗细胞并离心克在4°C下保持5分钟。将颗粒重新悬浮在FACS缓冲液中进行流式细胞术分析。每次活检的细胞产量在100000到200000个之间。

体外试验人淋巴细胞与HSC相互作用的分析

人肝星状细胞系LX2用于检测培养中淋巴细胞与HSC的相互作用。该细胞系已在许多研究中得到广泛验证，这些研究确立了其与原发性HSC的相关性。²⁵为了验证结果，使用了主要的人类HSC。

原代人HSC的分离和培养

如前所述，分离HSC。²⁶将分离的HSC在含有10%FBS的M199中培养，在接种后24小时改变，此后每3至4天改变一次。当培养物汇合时，将其胰蛋白酶化（0.05%胰蛋白酶/0.53 mM乙二胺四乙酸）并以1:3的比例传代。随后每7至10天进行一次传代。

PBL激活HSC

健康或肝硬化HCV衍生PBL（10⁶细胞）从每组八名供体中分离。然后将分离的PBL与LX2细胞或原代分离的HSC在18mm培养皿1%FBS（Atlantic Biologicals）培养基中单独共培养。对每个PBL供体进行三重培养。HSC（10⁵细胞）在PBL形成前3天培养（直至接近完全融合）。要么是10⁶混合PBL细胞或单独的亚群（CD4、CD8或NK细胞）用于共培养。24小时后，去除HSC培养基与淋巴细胞的共培养活化，清洗细胞，通过细胞刮片收集细胞，并分析α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白印迹和信使RNA（mRNA）表达。

吞噬作用

共焦成像用于研究HSC使用来自HCV感染肝硬化患者或健康志愿者的混合PBL对淋巴细胞的吞噬作用。HSC/PBL共培养培养0、6、12、24和72小时。在每次共培养中，均使用放置在12孔烧瓶（丹麦Nunc品牌产品）底部的圆形玻璃载玻片（Marienfeld，Laboratory Glasssware，德国）。通过免疫细胞化学分析每个时间点CD4、CD8、NK和α-SMA标记的表达。从每个共培养皿中采集了来自不同领域的36张图像。

使用1µm切片的共焦显微镜进一步评估吞噬作用。此外，来自三个不同供体的PBL与3,3′-二十八烷基氧氯碳菁高氯酸盐（DiOC；Sigma）预孵育。如前所述，将一种菁染料DiOC溶解在二甲基亚砜（2 mg/mL；Sigma）中，以将细胞内脂质染成绿色。²⁷搅拌培养过夜后，将DiOC染色的细胞清洗数次，然后与HSC培养。

为了评估配体/受体介导的吞噬作用的存在，在HSC/PBL共培养的不同修饰中重复共聚焦评估。这些包括用最终浓度为100µg/mL的封闭抗体预孵育HSC 30分钟，然后用HCV衍生PBL培养。HSC用小鼠抗人Ⅰ类（HLA-ABC抗原，DakoCytomation）、Ⅱ类（HLA-DP，DQ，DR抗原，DaKoCytomia）、细胞间粘附分子（ICAM-1）预孵化（CD54，ICAM-1，DakoCytomation）、I型膜糖蛋白粘附分子“整合素αV”（多克隆Intigren，CHEMICON International）、MIC-A或MIC-B（Bio-Legend，6D4）或对照抗体。为了阻断T细胞受体，小鼠抗人T细胞受体抗体在相同条件下共同培养前与淋巴细胞孵育。在单独的实验中照射HSC或PBL细胞以获得细胞凋亡，¹⁶^,²⁸在共同培养之前，以区分HSC是否负责淋巴细胞的吞噬作用。HSC用PBS洗涤两次，胰蛋白酶化，并用6000 rads照射，显示该剂量可抑制增殖，而不会影响细胞活力或膜蛋白表达。¹⁵^,¹⁶使用3000 rads进行辐照非增殖PBL的实验。¹⁵^,¹⁶

荧光激活细胞分类分析（FACS）

简单地说，分离的淋巴细胞被调整为10个⁶/mL在染色缓冲液中（在含有1%牛白蛋白的盐水中；以色列生物工业公司）。50微升细胞悬液与抗体在冰上孵育30分钟，用染色缓冲液清洗，并用2%多聚甲醛固定。Fc受体被1%的人血浆在冰上孵育15分钟而阻断。然后将封闭的淋巴细胞分别与异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）、别藻蓝蛋白或结合了抗CD4、抗CD8、抗CD16和抗CD45蛋白的抗CD4抗体（荷兰格罗宁根IQ Products；抗体稀释1:40）或同型对照物在冰上混合20分钟，并用FACS缓冲液清洗。CD45被用作白细胞的全球标记物。根据制造商的方案（BD生物科学），用抗IFN-γ和转化生长因子β（TGF-β）抗体（分别结合FITC和PE）对淋巴细胞进行细胞内染色。对于HSC内淋巴细胞的凋亡测量，根据制造商的说明，使用片段DNA的碘化丙啶（PI）染色和结合FITC的膜联蛋白V的磷脂酰丝氨酸染色（R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。因此，淋巴细胞凋亡被定义为CD45+，膜联蛋白-V（+），而PI（−）。FACS数据是使用FACS卡尺流式细胞仪（Becton Dickinson）获得的；使用CellQuest 3.3软件对数据进行分析。对于所有分析，使用正向散射与侧向散射图进行淋巴细胞门控。

免疫荧光

将肝活检或细胞培养玻片在室温下与等渗PBS、10%蔗糖和4%甲醛溶液孵育过夜。然后将其在−80°C下冷冻保存，并使用Cryostat（徕卡CM 3000）制备7-µm厚的冷冻切片。使用0.2%Triton（Sigma）渗透细胞。为了阻止非特异性背景染色，使用1%牛血清白蛋白20分钟。PBS清洗后，将载玻片与一级抗体在室温下黑暗中孵育45分钟。肝活检中使用的一级抗体是人类FITC-抗CD4（稀释度为1:100）、抗CD8（稀释度1:70）和抗CD16（稀释度1:100）标记物（荷兰格罗宁根IQ Products）。细胞培养载玻片中使用的主要抗体是人FITC-抗CD4、PE-抗CD8、PE-anti-CD16、FITC或PE-anti-CD45（稀释1:50）、FITC-抗血清Rac1和FITC-抗体Cdc42（稀释1:50%，Santa Cruz Biotechnology，INC.）标记物。对于HSC的鉴定：使用α-SMA（DAKO，猫#M0851）一级抗体（稀释度为1:150）结合Cy-5（稀释度1:40）作为二级抗体（Jackson Immunoresearch）。然后添加Cy-5二级抗体，之前和之后进行三次PBS洗涤。为了保存染色，将切片堆叠起来，并用Fluoromount-G（Southern Biotechnology Associates）覆盖。然后将切片储存在4°C下，等待分析。²⁹^,³⁰

共焦显微镜和图像采集

使用了与蔡司Axiovert 135 M显微镜相连的蔡司LSM 410共焦激光扫描系统（德国蔡司）。采用40×1.4透镜的平面彩色蔡司采集荧光图像。该系统配备了一个用于绿色荧光的氩激光器（488 nm激发线）和两个用于红色荧光的氦氖激光器（543 nm和633 nm线）。用三个激光器对三个标记的样本进行激发，并使用三个探测器和滤光片组合进行同时监测。对激励功率和发射滤波器进行了调整，以使每个通道的重叠最小。在每个实验中，在相同的水平上收集激光强度、背景水平、对比度、光圈和电子变焦尺寸。从每个标本收集50张图像，并转换为tiff格式，然后使用蔡司LSM图像浏览器软件进行处理。使用Adobe Photoshop软件（Adobe Systems UK、Uxbridge和Middlesex，UK）和ImagePro Plus程序（Media Cybernatics，USA）执行图像处理。³¹^,³²

α-SMA免疫印迹

如前所述，对培养的HSC蛋白提取物中的α-SMA进行免疫印迹分析。¹⁸^,¹⁹^,²¹

实时聚合酶链反应分析

如前所述，用刮刀收集洗涤后的LX2细胞进行RNA提取和互补DNA转录。¹⁸^,¹⁹如前所述，互补DNA产物用于实时聚合酶链反应。¹⁸^,¹⁹β-肌动蛋白作为内部控制和H₂O作为阴性对照。β-肌动蛋白的引物如下：

福沃德：闸门GAG ATT GGC ATG GCT TT
反转：AGA GAA GTG GGG TGG CTT TT
对于SMA：
福沃德：TCC TCC CTG GAG AAG AGC TAC变矩器离合器控制间隙
反转：TAT AGG TGG TTT CGT GGA TGC

小干扰RNA转染HSC

将小干扰RNA（siRNA）在无血清培养基中稀释至100:1，浓度最小为5nM，最大为25nM。将三微升HiPerFect转染试剂（Qiagene）添加到稀释的siRNA中并充分混合。将混合物在室温下培养10分钟，以形成转染复合物。然后将复合体添加到10⁵细胞前一天接种在24孔板上。使用Qiagen siRNA人/小鼠启动试剂盒中提供的阳性和阴性siRNA沉默对照进行转染效率。siRNA转染通过免疫荧光验证，基因沉默通过实时聚合酶链反应验证。

Rac1/Cdc42的siRNA沉默

根据制造商说明，使用RNA干扰人/鼠起始试剂盒（HiPerFect转染试剂，QIAGEN），使用商业Rac1或Cdc42 siRNA转染LX2细胞或原代HSC：人类Cdc42和Rac1:5′-GUG UCG GCA UCAUAC UAAAdTdT-3′（Cdc42#1）的互补DNA序列和5′-CAG CAA UGC AGA CAA UUA AdTdT-3′（Cdc42#4）；5′-GGU UGG UAU CAG GAA AdTdT-3′（Rac1#1）和5′-GAC AUA ACA UUG UAC UGU AdTdT-3′（Rac 1#3）。然后将siRNA转染的HSC与肝硬化HCV衍生淋巴细胞共同培养。对于对照组（可在同一试剂盒中获得），在共培养前用对照siRNA转染HSC。非沉默对照siRNA（Alexa Fluor 488 Labeled，QIAGEN）用于阴性对照。作为阳性对照，将特异性阳性siRNA（MAPK1）转染到HSC中，但未与淋巴细胞共培养。前两组各使用来自六名不同患者的六个三倍共培养物。共培养24小时后评估HSC的激活情况。去除含有游离淋巴细胞的培养基，刮取HSC进行α-SMA Western blotting评估。

统计方法

结果显示为平均值±标准偏差。统计显著差异；成对和未成对学生t吨采用方差分析和检验。

结果

慢性丙型肝炎和乙型肝炎患者淋巴细胞亚群分布的改变

累积的数据表明，肝脏炎症中存在几种不同的淋巴细胞亚群，但其相对丰度和重要性尚不确定。³³^–³⁶为了澄清这个问题，将6例对照病例的PBL和IHL的组成与25例HCV和7例HBV晚期纤维化患者进行了比较(表1). 显著差异主要局限于国际人道主义法，而非PBL(图1). 健康对照组肝内CD4细胞占总淋巴细胞的34%±7.5%，而HCV患者仅占22.6%±6.6%(P（P）=0.004）和22%±5.3%的HBV患者(P（P）= 0.04). 健康对照组与HBV或HCV患者之间CD8细胞的差异不显著(图1，上部面板）。然而，CD4/CD8比率显著下降，从健康献血者的0.88%±0.17%降至0.53%±0.12%(P（P）=0.007）（HCV）和0.44±0.12(P（P）=0.02）。如前所述，¹⁸^,¹⁹^,²¹当前研究中NK的显著改变仅限于IHL(图1). 具体而言，肝内NK细胞显著减少(P（P）=0.04），从健康淋巴细胞的24.9%±2.8%分别降至HCV感染者和HBV感染者的17.7%±5%和19.3%±4.1%。

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图1

纤维化患者的淋巴细胞改变。对来自健康供体（黑条）、HCV（开条）和HBV（灰条）纤维化患者的分离肝内和外周血淋巴细胞进行了FACS分析（见患者和方法）。显著差异仅限于肝内淋巴细胞，其中CD4减少，导致CD4/CD8比率增加(图1); 两个纤维化组的NK细胞均减少。

表1

患者特征

	健康	丙型肝炎病毒	乙型肝炎病毒
编号	6	25	7
女性	2	12	2
年龄^*（年）	38.7 ± 5	43.2 ± 14	35.6 ± 10.6
中高音^*（单位）	23.3 ± 5	105 ± 114	56.5 ± 81.8
白蛋白^*	>33克/升 42.8 ± 5.2	35.4 ± 3.9	34.1 ± 2.6
血小板^*	<80 × 10⁹/我 230 ± 65	120 ± 42	118 ± 34
F3得分	METAVIR秤无	20	4
F4得分	METAVIR秤无	5	三
*HCV状态：*
基因型1		21
基因型2		1
基因型3		2
基因型4		1
*HBV状态：*
乙型肝炎病毒eAg+			5
乙型肝炎病毒载量	份数/mL		<100,000

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^*平均值

造血干细胞和淋巴细胞直接相互作用在体内

评估淋巴细胞就地在肝硬化HCV患者的肝脏切片中使用共焦显微镜。对照肝脏中可见分散的弱阳性α-SMA阳性细胞(图2A)但在纤维化肝脏中变得突出(图2B–D). 正常肝脏中淋巴细胞亚群的免疫染色为阴性，表明淋巴细胞在没有损伤的情况下不会粘附到肝实质上(图2A). 相反，纤维化肝脏的CD4、CD8和NK（CD16）细胞呈阳性染色(图2B–D）。淋巴细胞仅位于纤维间隔沿线α-SMA阳性细胞的直接附近，而不是其他地方。（FITC荧光的经典绿色被重新映射为蓝色以便于查看。）因此，当与红色Cy-5α-SMA融合时，具有经典蓝色的FITC共轭子集变为粉红色(图2B–D). HBV肝硬化患者也获得了类似结果（数据未显示）。

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图2

淋巴细胞-肝星状细胞直接粘附现场：肝纤维化HCV患者（B-D）和健康对照组（A）的肝活检用一级抗体染色。用红色Cy-5结合的α-SMA对HSC进行染色，FITC-CD45作为常见的白细胞标记物。共焦激光扫描显微镜用于显示患者和方法中描述的染色切片。HSC（红色箭头）被染色为靠近肝细胞的小红细胞。蓝色/紫色染色的淋巴细胞（白色箭头）仅位于纤维化间隔附近的α-SMA阳性细胞附近，而非其他地方。经典蓝色的FITC-共轭CD45与红色Cy-5α-SMA融合后变成粉红色。

免疫细胞相互作用导致纤维化

与肝纤维化相关的人类淋巴细胞亚群的变化与啮齿动物纤维化模型中的变化相似。¹⁸^–²¹为了评估淋巴细胞与HSC相互作用的功能影响，采用共培养系统，将混合PBL、分离的CD4、CD8或NK细胞与LX2细胞结合48小时，比较正常供体细胞与HCV供体细胞的效果。

图3A显示了从这些共培养物的培养蛋白提取物中通过western blotting评估的α-SMA（上层）和β-Actin（第二层）表达。来自HCV感染患者的CD8和较小程度的CD4细胞（中面板）以及混合HCV淋巴细胞（上面板）均可激活HSC，表现为LX2细胞中α-SMA表达增加。相比之下，NK细胞的作用最小（中间面板）。此外，来自健康对照的混合或分离亚群对LX2 HSC都没有任何影响(图3A，下部面板）。α-SMA mRNA的表达(图3B)与western blot结果一致。特别是，在与LX2细胞共同培养的混合HCV衍生淋巴细胞中，α-SMA mRNA表达增加了两倍±0.8倍(图3B与单独培养的LX2细胞相比。在与CD4细胞混合培养的细胞中表达为1.6±0.9，CD8为3±0.4，在NK细胞中表达0.9±0.7。当CD8-LX2共培养物与含有混合培养物的共培养物进行比较时，发现存在显著差异(P（P）=0.04），CD4(P（P）=0.01）和NK(P（P）=0.004）子集。最初分离的HSC显示出与LX2细胞相同的模式(图3B，下面板）。与小鼠纤维化模型的结果类似，¹⁸^–²⁰与混合淋巴细胞相比，NK细胞减弱HSC活化(P（P）=0.03），加强了这些早期小鼠研究与人类疾病的相关性。使用健康或HCV衍生PBL，通过FACS研究培养淋巴细胞的细胞内细胞因子分析(图3C). 研究结果进一步支持了各亚群对HSC的影响：与健康PBL相比，HCV衍生NK细胞的TGF-β分泌量显著减少，从NK细胞2.3%±1.2%降至1.5%±0.8%(P（P）=0.05），并且显著增加(P（P）=0.03）从0.2%±0.1%到0.5%±0.4%的NK细胞分泌IFN-γ(图3C，左上下面板）。NK细胞TGF-β减少和IFN-γ分泌增加与抗纤维化作用一致。然而，HCV衍生的CD8细胞显示TGF-β分泌显著增加，从9.2%±3.6%增加到46.1%±19.7%(P（P）<0.0001）并显著下降(P（P）=0.009）CD8细胞5%±5.3%至0.6%±0.5%的IFN-γ分泌(图3C中上部和下部面板）。CD8细胞TGF-β的增加和IFN-γ分泌的减少与其促纤维化作用相一致。TGF-β也从122±15.2增加(P（P）=0.04）对于CD4亚群；然而，在健康和HCV衍生CD4淋巴细胞中，IFN-γ分泌相似(图3C，左上和左下面板），表明与CD8细胞相比，促纤维化作用更温和。

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图3

培养中淋巴细胞亚群的促纤维化和抗纤维化作用：LX2细胞与HCV患者或健康对照者的淋巴细胞共培养24小时，无论是混合亚群还是分离亚群。（A）每组两人的结果。评估蛋白质提取物的α-SMA（上层）作为HSC激活的标记，并与β-actin（第二层）进行比较。上面的面板显示了与混合HCV衍生PBL共同培养后LX2细胞的激活。中间的面板显示HCV CD8细胞，以及在较小程度上的CD4细胞和混合HCV淋巴细胞，激活了HSC，这表现为经western blot评估的α-SMA蛋白的更强烈表达。NK细胞几乎不能激活HSC。图中下部的健康淋巴细胞无法激活HSC。α-SMA（B）表达的mRNA分析结果与蛋白质印迹的结果相对应（上图为LX2，下图为原代分离的HSC）。实验重复了三次，结果几乎相同。此外，尽管这一数字来自两名丙型肝炎病毒携带者和两名健康献血者，但当用其他病例的淋巴细胞重复实验时，结果是可重复的（数据未显示）。FACS使用健康或HCV衍生PBL（C）研究培养淋巴细胞的细胞内细胞因子分析。结果显示，NK细胞的TGF-β减少，IFN-γ分泌增加，CD4和CD8细胞的TGFβ减少，仅CD8亚群的IFN-γ增加。

结果与非常相似图3A-C也使用原代HSC而非LX2细胞获得（数据未显示）。

HSC吞噬淋巴细胞后直接接触/附着

我们之前证明了HCV衍生NK细胞与培养的人类HSC直接接触。¹⁹为了扩大这些发现，LX2细胞与来自肝硬化HCV感染供体和健康供体的混合PBL共同培养0、6、12、24和72小时（如详细说明）。LX2细胞被抗α-SMA结合的Cy-5抗体染成红色(图4，红色箭头）。图4显示了三个不同淋巴细胞亚群（白色箭头）与HSC（红色箭头）附近相互作用的代表性图像（共培养6小时）。这包括FITC-共轭CD4(图4A，蓝色），PE-CD8(图4B，绿色），以及PE-CD16（NK）HCV衍生细胞(图4C，绿色）。当LX2细胞与健康淋巴细胞培养时，这些相互作用不存在(图4D). 因此，PBL和LX2细胞之间的直接相互作用可能有助于HCV患者淋巴细胞对HSC的功能影响。与LX2细胞的结果类似，HCV衍生的淋巴细胞亚群(图5A-C)但不是健康的PBL(图5D)也被初级HSC吞没。

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图4

HSC吞噬淋巴细胞的直接接触终点：LX2细胞与HCV或健康淋巴细胞共培养6小时。与α-SMA结合的Cy-5（红色箭头）将LX2细胞染成红色，与HCV淋巴细胞（白色箭头）直接相邻，用于FITC-结合CD4（A；蓝色）、PE-CD8（B；绿色）以及PE-CD16（NK）HCV衍生细胞（C；绿色）。健康PBL对照组（D）未证明这种相互作用。

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图5

类似的结果图4用原代HSC代替LX2细胞。

基于早期淋巴细胞与HSC的直接接近性(图2,图4、和图5)，我们监测HSC/PBL共培养超过6小时。共培养12、24和72小时时，发现HSC吞噬CD45细胞（作为泛白细胞标记物，在与LX2细胞共培养的情况下与FITC结合，在初次分离的HSC情况下与PE结合）。高速列车(图6A–D; LX2英寸图6A–B; 以及主要HSC图6C-D)与α-SMA结合的Cy-5（红色箭头）被染成红色，淋巴细胞被染成蓝色（白色箭头），吞噬作用与摄入淋巴细胞周围的α-SMA阳性包膜有关(图6B和D，绿色箭头）。此外，共焦图像的连续1-µm切片显示HSC位于同一图像平面内，因为两者同时出现和消失，证实HSC内存在吞噬淋巴细胞（白色箭头）（红色箭头；选择性切片显示在图7A–D带有LX2电池和图7G–J带有主隔离HSC）。为了进一步证明两种细胞类型的吞噬作用而不是物理覆盖，HCV衍生的淋巴细胞与DiOC预先孵育，以染色细胞内脂质含量，清洗，然后与HSC培养。图7E-F带有LX2电池和图7K–M原代分离的HSC显示HSC内的淋巴细胞，淋巴细胞衍生的DiOC在HSC的细胞质内扩散。

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图6

共培养12、24和72小时后，所有CD45+细胞在HSC（A-B，含LX2细胞；C-D，含原代分离的HSC）内发生吞噬作用，这也分别在每个淋巴细胞亚群中显示（数据未显示）。此外，吞噬作用与摄入淋巴细胞周围的α-SMA阳性包膜有关（绿色箭头，B和D）。这个实验重复了四次以上。

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图7

共聚焦显微镜记录吞噬作用：1µm系列切片图像显示，HSC和CD45+细胞在同一共聚焦通道出现和消失，证实了吞噬作用（LX2细胞的选择性切片显示在A-D中，原代分离的HSC的选择性切片显示在G-J中）。HCV衍生的淋巴细胞用DiOC预孵育，清洗，然后与HSC细胞培养。（E–F）LX2细胞和（K和L）初级分离的HSC显示HSC内有淋巴细胞，其DiOC释放到HSC细胞质中。每个淋巴细胞亚群的情况也各不相同（数据未显示）。实验重复了四次。

然后使用HCV衍生的PBL单独或与HSC培养48小时来评估淋巴细胞的凋亡(图8). 在与LX2细胞共培养的情况下，仅在洗涤漂浮细胞后的吞噬PBL中评估凋亡。凋亡PBL(图8A)定义为CD45+、Annexin+和PI（−），从PBL培养的19%±4.5%显著增加到吞噬淋巴细胞的25.7%±1.7%(P（P）= 0.002). 有趣的是，死亡的淋巴细胞(图8b)CD45+、Annexin+和PI（+）也分别从7.7%±0.8%显著增加到26.2%±2.2%(P（P）< 0.0001). 数据表明HSC内的淋巴细胞被迅速杀死。与原代HSC共培养的淋巴细胞凋亡呈现相同模式(图8C–D).

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图8

HSC吞噬后淋巴细胞的凋亡和死亡增加：单独或与HSC（A-B组中的LX2以及C-D组中的原始分离HSC）培养48小时后，通过FACS评估淋巴细胞的凋亡。在吞噬淋巴细胞的情况下，凋亡PBL（A）（定义为CD45+Annexin+和PI（−））显著增加。被定义为CD45+膜联蛋白+和PI（+）的染色淋巴细胞（B）也增加，表明HSC内的淋巴细胞被迅速杀死。

接下来，我们重点研究了HSC对淋巴细胞的吞噬作用是否受特定配体-受体相互作用的调节，重点研究了几个分子家族。吞噬细胞受体种类繁多，包括每个典型粘附受体家族中的至少一个成员（整合素、钙粘蛋白等）。³⁷ 图9展示了LX2细胞被结合到α-SMA的Cy-5（红色箭头）染成红色，淋巴细胞被PE-CD45细胞染成红色（白色箭头）。与未经处理的共培养中的淋巴细胞吞噬作用相比(图9A)，当HSC被MHC I类和II类分子的特异性抗体预先阻断时，吞噬作用不受影响(图9B–C)或MHC I类链相关基因A（MIC-A）和MHC I级链相关基因B（MIC-B）配体的自然杀伤组2、成员D（NKG2D）受体（数据未显示）。同样，当淋巴细胞被T细胞受体特异性抗体预先阻断时，吞噬作用也不受影响(图9F). 相反，在共培养前，通过与ICAM-1或整合素αV抗体预孵育阻止吞噬作用(图9D–E). 为了证实LX2细胞负责吞噬淋巴细胞，而不是淋巴细胞穿透LX2细胞(图9G)或LX2电池(图9H)在共培养前，只对两种细胞类型中的一种进行辐照以减弱凋亡。只有当HSC（而非淋巴细胞）受到照射时，吞噬作用才被完全阻断。这一发现与辐射在与HSC共培养时减弱同种异体T淋巴细胞增殖的结果一致。¹⁶原代HSC的反应与LX2细胞相似(图10).

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图9

吞噬作用由配体/受体粘附介导。与非人工共培养和非刺激吞噬作用（A）相比，如患者和方法（分别为D和E）所述，在共培养前阻断HSC相关ICAM1和整合素αV，可预防吞噬作用。与淋巴细胞共培养前阻断HSC相关的I类和II类细胞不会影响吞噬作用（分别为B和C）。与淋巴细胞共培养前阻断淋巴细胞相关的T9细胞受体不会影响吞噬作用（F）。只有当照射HSC（H）而非淋巴细胞（G）时，吞噬作用才被阻断。（一） HSC与健康淋巴细胞共同培养时无吞噬作用。

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图10

原代HSC显示出与LX2细胞相同的反应图9。实验重复了四次。

与HCV衍生PBL共培养前ICAM-1或整合素αV的阻断(图9D–E)伴有HSC活化减少(图11). 特别是，在相同β-肌动蛋白存在的情况下，ICAM-1或整合素αV阻断后，通过western blotting评估的α-SMA表达降低(图11，下部面板）。α-SMA mRNA的表达(图11，上部面板）对应于western blot结果。具体而言，与单独培养的LX2细胞相比，混合HCV衍生淋巴细胞与LX2淋巴细胞共同培养的α-SMA mRNA表达增加了2.8±0.05倍。表达显著下降至1.9±0.09(P（P）=0.005），并达到1.6±0.02(P（P）=0.005）。当ICAM-1阻断与整合素αV阻断进行比较时，也发现显著差异(P（P）= 0.02). ICAM-1或整合素αV阻断后，原代HSC对LX2细胞的反应类似（数据未显示）。

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图11

与HCV衍生PBL共培养前ICAM-1或整合素的阻断在功能上伴随着HSC活化的降低：在等β-肌动蛋白存在下，ICAM-1和整合素阻断后，通过western blotting的α-SMA表达谱带降低（下表）。α-SMA mRNA的表达(图10，上部面板）对应于western blot结果。

Rac1和Cdc42参与HSC对淋巴细胞的吞噬作用

在认识到细胞间粘附分子有助于HSC的吞噬反应后，我们试图确定潜在的细胞内信号通路。调节细胞粘附的信号级联与吞噬过程中激活的信号级联平行。³⁷特别是，Rho家族鸟苷三磷酸酶（GTP酶）在粘附受体下游被激活，并控制粘附事件背后的细胞骨架变化。³⁸因此，我们通过在共培养系统中用特异性抗体表征这两个分子来研究Cdc42和Rac1（作为Rho家族GTPases的一部分）的潜在作用(图12). 这两个分子与Cy-5红α-SMA染色HSC的分子重叠明显(图12)，表明Cdc42和Rac1募集有助于HSC淋巴细胞粘附和吞噬。

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图12

Rac1和Cdc42被招募到吞噬接触区。吞噬作用和细胞间粘附区中的Cdc42和Rac1募集在HSC/HCV衍生的PBL共培养物中得到证实（左侧两张图显示与LX2细胞共培养，右侧两张图显示与原代HSC共培养）。（B和E）FITC-染色的Cdc42和Rac1（分别）为蓝色；（C和F）PE染色的淋巴细胞呈绿色。（A和D）两种染色与LX2细胞的Cy-5红色α-SMA染色重叠（分别）。实验重复了四次以上。

为了揭示Rac 1和Cdc42对HSC粘附和吞噬淋巴细胞的功能重要性，我们使用特定的siRNA进行选择性敲除，³⁸通过使用荧光控制siRNA的共焦显微镜进行确认（数据未显示）。图13文件记录了通过western blotting（下表）评估的特定siRNAs对Cdc42的下调，这与共聚焦显微镜显示的吞噬功能减弱有关（数据未显示，因为它们与图9D–E，H）与通过α-SMA表达评估的HSC活化降低相关（上面板）。Rac1 siRNA沉默的结果与使用Cdc42沉默的结果相同（数据未显示）。Cdc42和Rac 1也参与了原代HSC对PBL的吞噬作用（数据未显示）。

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图13

HSC吞噬淋巴细胞需要Rac1和Cdc42。使用特异性siRNA转染实现了Cdc42相关或Rac1相关LX2细胞的沉默。与阴性siRNA对照组相比，特异性siRNA沉默后通过western blotting证实Cdc42下调（下表）。因此，与阴性siRNA对照组相比，通过α-SMA表达评估HSC的激活降低（上表）。Rac1 siRNA沉默的结果与Cdc42效应一致（数据未显示）。这个实验重复了四次。

讨论

病毒感染期间，细胞毒性CD8⁺T细胞被特异性肽激活，其反应被特异性辅助CD4增强⁺T细胞。活化的T细胞攻击HCV感染的肝细胞可能解释（至少部分）组织损伤。¹²^,³⁹^–⁴⁴我们的研究评估了HBV相关和HCV相关肝纤维化患者PBL和肝内T细胞中T细胞亚群的分布。显著差异仅限于IHL而非PBL，这表明淋巴细胞可能被隔离在感染部位，PBL评估可能不能代表肝脏中的局部相互作用。⁴⁵^,⁴⁶事实上，肝内细胞因子网络的改变可能是肝损伤中T细胞改变的基础。⁴⁷

正如其他人先前报道的炎症性肝损伤，¹⁴^,⁴⁸我们发现，与外周血相比，纤维化肝脏中CD4 T细胞的百分比降低，导致CD4/CD8比率显著降低，尽管CD8细胞丰度没有显著变化。

NK细胞是先天免疫系统的细胞毒性细胞，具有识别I类MHC的抑制性受体和包括NKG2D在内的多种激活性受体。⁴⁹我们和其他人已经报道了NK细胞的抗纤维化作用体内和在体外.¹⁹^,²⁰^,⁵⁰与激活受体相比，随着抑制性杀伤免疫球蛋白受体的表达降低，NK细胞在肝损伤中受到刺激。相反，HSC激活导致I类分子表达减少，导致NK细胞将HSC识别为“非我”，从而引发HSC杀伤。¹⁹纤维化感染患者的NK细胞（CD16+）显著减少(图1)从而减少重要的抗纤维化亚群。为了支持这种可能性，Morishima等人。⁵¹据报道，NK细胞的频率降低，与早期的血液研究类似⁵²^–⁵⁴和肝脏。⁵⁵^,⁵⁶原发性胆汁性肝硬化患者NK细胞功能降低⁵⁷以及在HCV感染的个体中。⁵⁸^–⁶⁰我们目前的研究结果进一步支持NK细胞的抗纤维化作用，部分是通过与HSC的直接相互作用体内和在体外(图4–图7)以及通过改变细胞因子表达来减少其激活(图3C). 此外，病毒感染的肝脏中NK细胞数量减少，从而削弱了重要的抗纤维化途径(图1). NK–HSC直接粘附伴有活化HSC和肝NK细胞凋亡增加的证据就地.¹⁹

虽然淋巴细胞浸润是病毒性肝炎的一个显著特征，但在人类疾病中，淋巴细胞浸润对HSC活化的功能影响尚未得到很好的证实，而动物模型表明其具有直接的成纤维活性。¹⁸^,¹⁹^,²¹在本研究中，共培养结果表明，与直接物理作用和增强的成纤维细胞因子谱相关的成纤维刺激证据，其中CD8+T细胞亚群具有最大的成纤维活性，NK细胞减少HSC的激活(图3). 这一发现大大扩展了早期关于CD8+T细胞参与小鼠移植物抗宿主病相关胆道纤维化的观察³⁴酒精性肝硬化。³⁵

HSC对淋巴细胞的吞噬作用与最近报道的HSC对大分子的吞噬能力一致。¹⁶^,⁶¹^,⁶²此外，由于肝细胞凋亡小体的吞噬是纤维形成的，¹⁷HSC对淋巴细胞的吞噬作用也是如此。在其他纤维生成细胞类型中也描述了细胞外物质的内化能力(即以及肝非专业抗原提呈细胞，如窦内皮细胞。⁶²^,⁶³我们的结果与最近一项研究的结果一致，该研究表明活化的HSC可以吞噬凋亡小体。¹⁷HSC可以吞噬凋亡和非凋亡淋巴细胞(图8)HSC内淋巴细胞凋亡和死亡增加可能是淋巴细胞失活的机制。照射HSC后淋巴细胞吞噬功能的丧失暗示了HSC在这一过程中的吞噬作用。DiOC扩散到HSC细胞质所证明的细胞质淋巴细胞内容物移位到HSC胞质，提供了进一步的证据，并解释了每个淋巴细胞亚群对HSC反应的不同影响。还发现HSC吞噬活化淋巴细胞在体外在没有病毒感染的情况下进行骨髓移植后，因移植物抗宿主病导致的肝损伤（数据未显示）。因此，活化但未感染的淋巴细胞负责在体外HSC激活。因此，我们认为人类淋巴细胞的吞噬作用体内除了公认的旁分泌炎症途径外，设置是激活HSC的额外炎症机制。据报道，吞噬细胞吞噬凋亡细胞是为了防止死亡细胞释放潜在毒性或免疫原性胞内物质。⁶⁵在成纤维细胞和上皮细胞中也发现了类似的结果。⁶³因此，HSC内淋巴细胞的吞噬作用引起细胞内免疫原性细胞内内容物的浓度。在这种情况下，突出的吞噬淋巴细胞亚群将决定HSC的行为。我们之前报道过LX2细胞与NK细胞共培养时发生凋亡，¹⁹这里我们证明这些NK细胞是IFN-γ分泌细胞，它们的吞噬作用导致LX2细胞失活(图3). 相反，在吞噬TGF-β富集的CD8亚群的情况下，LX2增殖和活化增加(图3). 由于健康的淋巴细胞不进行吞噬作用，它们与LX2细胞的共培养不会改变SMA的表达(图3A，下部面板）。

我们进一步探索了特异性介导吞噬作用的潜在途径。吞噬作用在参与淋巴细胞相互作用的不同HSC表面粘附配体/受体之间启动，包括CD11c和ICAM-1。⁶⁵相反，MHC I类和II类以及NK细胞受体-配体相互作用对HSC显示抗原呈递特性都不重要，¹⁶而II类和CD11c都是抗原提呈所必需的。⁶⁶

最近的研究表明Rho-GTP结合蛋白介导的细胞骨架重排。⁶⁷Rho蛋白或其下游效应器可被招募到粘附结构中，例如Rac1和Cdc42，并在细胞-细胞接触处共同定位。⁶⁸事实上，Rac1和Cdc42沉默阻止吞噬作用并阻止HSC激活。Rac1/Cdc42不是参与吞噬作用的唯一途径，也可能涉及其他机制。磷脂酰丝氨酸和磷脂酰丝碱受体相互作用被认为是HSC的另一种机制。凋亡细胞上的磷脂酰丝氨酸促进吞噬细胞的摄取并诱导抗炎反应，包括TGF-β的释放。⁶⁹磷脂酰丝氨酸与磷脂酰丝琳受体的相互作用抑制免疫反应体内.⁷⁰这种相互作用与LX2细胞有关，因为它们表达磷脂酰丝氨酸受体。⁶¹

总之，我们的结果表明，人类淋巴细胞不仅可以介导肝损伤，还可以通过与肝星状细胞的直接调节性相互作用介导纤维化反应。这一发现进一步扩展了越来越多的证据，这些证据定义了肝纤维化过程中特定的淋巴细胞相互作用。

致谢

由NIH（DK 56621）和US-Israel Binational Scientific Foundation Awards（赠款编号8033603、8033605）资助。

缩写

α-SMA	α-平滑肌肌动蛋白
DiOC公司	高氯酸双十八烷氧碳菁
FACS公司	荧光激活细胞分选
FBS公司	胎牛血清
FITC公司	异硫氰酸荧光素
GTP酶	鸟苷三磷酸酶
乙型肝炎病毒	乙型肝炎病毒
丙型肝炎病毒	丙型肝炎病毒
HSC公司	肝星状细胞
ICAM-1公司	细胞内粘附分子1
干扰素-γ	干扰素γ
IHL公司	肝内淋巴细胞
MHC公司	主要组织相容性复合体
信使核糖核酸	信使RNA
NK公司	自然杀手
PBL公司	外周血淋巴细胞
美国公共广播电视公司	磷酸盐缓冲盐水
体育课	藻红蛋白
圆周率	碘化丙锭
小干扰RNA	小干扰RNA

脚注

潜在利益冲突：无需报告。

工具书类

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