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生物化学杂志。2010年5月28日；285(22): 16748–16756.
在线发布2010年3月1日。 数字对象标识：10.1074/jbc。M109.092999
预防性维修识别码：项目经理2878061
PMID：20194501

人类GLUD2公司谷氨酸脱氢酶在神经和睾丸支持细胞中表达*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

清洁Spanaki,‡,1 Ioannis Zaganas公司,‡,1 Kleopas A.Kleopa公司,§和安德烈亚斯·普拉塔基斯‡,2
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补充资料

摘要

哺乳动物谷氨酸脱氢酶（GDH）是一种广泛表达的变构调节酶。它的活性被GTP有效抑制，并被认为是由细胞对ATP的需要控制的。除了这种家政人类（h）GDH1外，人类（通过复制事件）还获得了一种对GTP具有耐药性的高度同源同工酶（hGDH2）。尽管GLUD2公司，编码hGDH2的基因，已在人类神经和睾丸组织中检测到，缺乏有关内源性蛋白的数据。在这里，我们开发了一种针对hGDH2的抗体，并将其用于研究人体组织。令我们惊讶的是，蛋白质印迹分析显示，内源性hGDH2在睾丸中的表达比在大脑中更为密集。在亚细胞水平上，hGDH2定位于线粒体。用免疫细胞化学和免疫荧光方法对睾丸组织的研究表明，支持细胞被我们的抗-hGDH2抗体强烈标记。在人类大脑皮层，检测到星形胶质细胞的强烈标记，神经元显示微弱的hGDH2免疫反应。众所周知，星形胶质细胞和支持细胞分别支持神经元和生殖细胞，为它们提供乳酸，而乳酸主要来源于谷氨酸转化为α-酮戊二酸的三羧酸循环（GDH反应）。由于hGDH2不受GTP控制，即使在三羧酸循环产生足以使家政hGDH1蛋白失活的GTP量时，该酶也能代谢谷氨酸。因此，星形胶质细胞和Sertoli细胞选择性表达hGDH2可能通过促进对这些细胞的支持作用至关重要的代谢再循环过程而提供显著的生物优势。

关键词：脱氢酶，酶纯化，酶，免疫化学，线粒体，星形细胞，谷氨酸脱氢酶，hGDH2抗体，支持细胞

介绍

谷氨酸脱氢酶（GDH三; 酶代码EC1.4.1.3）使用NADP（H）和NAD（H）作为辅因子，催化谷氨酸与α-酮戊二酸和氨的可逆相互转化，从而使氨基酸和碳水化合物代谢相互连接。哺乳动物GDH是变构调节的，GTP和ADP分别是主要的负调控因子和正调控因子(1,2).

虽然哺乳动物的GDH长期以来被认为是由单个基因编码的，但对人体组织的研究表明存在两种GDH活性，它们的调节特性和对热失活的相对抗性不同(三). 这些观察结果导致了两个编码人类GDH的基因的克隆：一个内含子总账1位于第10条染色体上并广泛表达的基因（家政）(4)和一个X链接的内嵌GLUD2公司主要在视网膜、大脑和睾丸中表达的基因(5). 有证据表明GLUD2公司基因起源于23000000年前的一次复制事件，与保守基因高度同源总账1基因(6). 因此，由总账1和GLUD2公司基因（分别为hGDH1和hGDH2）在其505个氨基酸残基中除15个外均以成熟形式共享。重组hGDH1和hGDH2异丙蛋白，通过表达相应的总账1和GLUD2公司发现Sf21细胞中的cDNA分别具有热稳定性和热不稳定性，并且在变构调节方面存在显著差异(7,–9).

虽然hGDH1的调节特性（ADP激活和GTP抑制）表明其活性受细胞对ATP的需要控制(1)hGDH2的功能已从GTP控制中分离出来(7,–9). 相反，hGDH2已经开发出独特的分子机制来调节其活性(9)有证据表明，这种酶已经适应了神经组织中普遍存在的条件(10). 此外，最近的观察表明，hGDH2在神经系统生物学中的重要性GLUD2公司可能通过加速疾病的神经退行性变来改变帕金森病的发病(11).

尽管从重组hGDH2的结构/功能分析中获得了见解，但关于内源性hGDH2酶的数据在很大程度上是缺乏的。由于hGDH1和hGDH2具有高度同源性，并且将两种人类同工酶分开的少数残基分散在505-氨基酸长肽中，因此检测人体组织中的hGDH2是一个真正的挑战。崔等。(12)此前，已提出针对两种牛脑GDH活性的单克隆抗体，它们与重组人GDH发生交叉反应，但这些单克隆抗体均不能区分hGDH1和hGDH2(13).

以前的调查表明GLUD2公司人类视网膜、大脑和睾丸中的基因特异性mRNA转录物(5). 另一方面，源于人类组织的表达序列标签库丰富了总账1-相关序列。只有少数表达序列标签克隆由GLUD2公司基因保存在公共数据库中(14). 这些来源于大脑（海马体）、睾丸、胚胎组织和各种肿瘤。无论总账1-与GLUD2公司转录本或后者相对不稳定，目前尚不清楚。

在这里，我们报道了我们开发了一种新的多克隆抗体，可以选择性地识别hGDH2等蛋白。使用这种抗体，我们首次在蛋白质水平上证实了hGDH2在人脑和睾丸中的内源性表达。然而，我们惊讶地发现，与大脑相比，内源性hGDH2在睾丸中的表达更为密集，睾丸中的支持细胞被我们的抗hGDH2抗体强烈标记。另一方面，使用未固定的人类大脑皮层组织，我们发现星形胶质细胞被抗体牢固地标记，神经元显示出相当微弱的hGDH2免疫反应性。由于星形胶质细胞和支持细胞分别是哺乳动物中枢神经系统和睾丸的支持细胞，这些观察结果表明，这些细胞选择性表达hGDH2可能通过促进为靶细胞提供营养所需的代谢再循环过程而带来生物优势。

实验程序

材料

Sf21细胞和杆状病毒表达载体来自Invitrogen（Carlsbad，CA）。Sf21昆虫细胞和胎牛血清的培养基来自Invitrogen。改良杆状病毒（BaculoGold）是从Pharmingen中获得的。NADPH和ADP来自罗氏应用科学公司。Phenyl-Sepharose HP来自Amersham Biosciences，Bio-Gel羟基磷灰石HT来自Bio-Rad。Ficoll来自Sigma，硝化纤维素膜（Porablot NCP）来自Macherey-Nagel（德国杜伦）。抗GDH抗体是从国际生物设计公司（Saco，ME）获得的针对全长牛GDH的抗体。抗锰超氧化物歧化酶抗体来自Millipore（Billerica，MA），抗肌动蛋白单克隆抗体来自Chemicon。使用DC蛋白质分析（Bio-Rad）进行蛋白质测定。

hGDH2特异性抗体的产生

选择了一种12氨基酸长的hGDH2特异性肽（PTAEFQDSISGA），对应于成熟人类蛋白的436–447残基。该肽含有R443S的进化变化，通过在N端添加半胱氨酸合成（以促进结合）并注射到兔子体内。收集血清并用于蛋白质印迹和免疫组织化学实验。所有抗体生成相关步骤均由Innovagen（瑞典隆德）执行。

定点突变和质粒构建

A类GLUD2公司和a总账1cDNA，在pBSKII中克隆+如前所述，使用基因编辑器诱变系统（Promega）在不同位置对载体进行诱变(15). 双向测序证实了构建物的方向和偶然的DNA改变的缺失。

野生型和突变型hGDH1和hGDH2蛋白质的产生

如前所述，使用杆状病毒表达系统在Sf21细胞中表达野生型和突变型cDNA(5,7,15,16). 如前所述，从Sf21细胞提取物中纯化野生型hGDH1和hGDH2蛋白(9). 在α-酮戊二酸还原胺化的方向上，分光光度法（340 nm）测定GDH活性(8).

睾丸粗提物和纯化酶制剂

在知情同意后，对尸检时获得的睾丸、脑和肝组织进行GDH研究。将约1 g组织在10 m内均匀化（玻璃到玻璃）米Tris-HCl（pH 7.4），含0.1 m米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米氯化钠、1%Triton X-100和蛋白酶抑制剂。离心得到的粗提取物（11000×克)使用细胞裂解液。使用苯基-脑葡萄糖柱对这些提取物的30–55%硫酸铵进行部分纯化(15). 使用含有GDH活性的组分。

睾丸亚细胞分离

在含有0.25的冰镇线粒体分离缓冲液中切碎约1g组织米蔗糖，10米米三氯化氢（pH 7.4），0.5 m米EDTA和蛋白酶抑制剂。用Dounce均质器（在15 ml缓冲液中）均质组织，然后在2000×克在4°C下保持5分钟。上清液（整个提取物）在12500×克在4°C下保持10分钟。将线粒体颗粒重新悬浮在4.5 ml 3%Ficoll培养基中，并小心地装入8 ml 6%Ficoll介质中(17). 11500×离心后克在4°C下放置30分钟，丢弃上清液，用线粒体分离缓冲液清洗线粒体颗粒，并在含有1%Triton X-100、0.5米氯化钠，10米米三氯化氢（pH 7.4）和0.5 m米EDTA公司。

Western Blot分析

纯化的重组hGDH1和hGDH2蛋白、粗组织提取物和部分纯化的GDH组分在8.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上运行。将蛋白质转移到硝化纤维素膜上，并与抗GDH多克隆抗体、抗hGDH2多克隆抗体，抗锰超氧化物歧化酶抗体或抗肌动蛋白单克隆抗体孵育。使用ChemiRent检测系统试剂盒（Chemicon）对蛋白质条带进行可视化。阻断实验是通过将抗hGDH2抗血清与用于提高该抗体的免疫原性肽预孵育来进行的。

人类睾丸的免疫染色

采用睾丸切除术后获得的正常睾丸标本，因睾丸扭转而进行治疗。在室温下，将试样固定在10%福尔马林中24小时。组织在自动组织处理器中制备，使用升高的乙醇浓度、二甲苯和石蜡。将连续石蜡切片（4μm厚）安装在玻璃载玻片上，在进行免疫组织化学之前保存。

免疫组织化学

使用的主要抗体包括上述新型兔抗hGDH2多克隆抗体（1:5000）、小鼠抗波形蛋白多克隆抗体，以及小鼠抗钙调素单克隆抗体（1:150；Dako M7245）。载玻片切片在60°C下烘烤10分钟，用两次二甲苯洗涤脱蜡，通过一系列分级酒精洗涤再水化，在水中漂洗，并用0.1米含有0.01%吐温20的磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）。使用目标回收溶液（Dako S1700）在蒸笼中进行热诱导抗原回收。用3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶10分钟。然后将载玻片在封闭溶液（无血清蛋白封闭，Dako X0909）中培养20分钟，以封闭非特异性结合。将主要抗体添加到载玻片中，并在4°C的加湿室中培养过夜。使用LSAB+辣根过氧化物酶试剂盒（Dako K0679）完成检测。切片用生物素结合的抗兔IgG培养30分钟，最后用与过氧化物酶结合的链霉亲和素培养30分钟。使用3,3′-二氨基联苯胺或AEC+显色剂进行免疫染色。玻片用苏木精复染，通过分级醇和二甲苯逐步脱水（除非使用AEC+），最后在DPX或Glycergel安装介质中安装后用盖玻片覆盖。使用1）抗hGDH2抗体，2）抗hGDH2抗体与免疫原性肽在室温下预孵育1小时，3）兔免疫前血清，以及4）二级抗体（未与一级抗体预先孵育的组织）平行进行竞争性研究。在装有406个物镜的奥林巴斯光学显微镜下检查载玻片。

福尔马林固定石蜡包埋睾丸组织切片的双重免疫荧光

如上所述进行脱蜡和抗原回收。用10%的正常驴血清封闭切片，并在4°C下用兔抗hGDH2抗血清（1:10000）孵育过夜。用磷酸盐缓冲盐水冲洗三次后，将双免疫荧光切片与第一二抗体（Alexa Fluor 594标记的驴抗兔抗体）在室温下孵育1h。第二步使用3.3%的正常山羊血清进行阻断。然后将载玻片与小鼠抗波形蛋白抗体或小鼠抗钙视网膜蛋白抗体在4°C下孵育1小时，用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并与第二种二抗（Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠）在室温下孵育1小时。最后，用含4′，6-二氨基-2-苯基吲哚的介质对载玻片进行复染，并使用40或63个油物镜通过激光扫描共聚焦荧光显微镜（Leica TCS-NT激光扫描显微镜，Leica Microsystems Heidelberg GmbH）进行检查。使用徕卡应用软件采集并合并图像。

死后人脑的双重免疫荧光

英国多发性硬化脑组织库（伦敦帝国理工学院）提供了速冻固定和未固定的死后人脑组织样本。切片在冷甲醇中渗透8分钟，用磷酸盐缓冲盐水清洗三次，在2%正常山羊血清中封闭45分钟，并用兔抗hGDH2抗血清（1:2000）在4℃孵育过夜。清洗后，将切片在室温下用生物素化山羊抗兔二级抗体（1:200；Vector Laboratories BA-1000）孵育1小时，然后在室温下再用异硫氰酸荧光素结合链霉亲和素（1:800）孵养1小时。随后在4°C的温度下，将双免疫荧光切片与抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP；1:1000；Invitrogen）、NeuN（1:300；Millipore）或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG；1:200；伦敦帝国理工学院理查德·雷诺兹教授馈赠）的小鼠抗体孵育过夜。清洗后，用TRITC结合的抗鼠二级抗体（1:100；Jackson ImmunoResearch Laboratories）孵育切片1 h，并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚进行复染。最后，用自体荧光消除剂（Chemicon）处理切片10分钟，并如上所述进行成像。为了证明hGDH2抗血清标记的特异性，将兔抗血清与免疫原性肽在室温下预孵育1h后，对切片进行平行染色。使用蔡司Axiovision软件，通过蔡司荧光显微镜和数码相机（卡尔蔡司MicroImaging）拍摄图像。

结果

hGDH2特异性多克隆抗体的制备及鉴定

将合成的长12氨基酸的hGDH2特异性肽注射到兔子体内后，我们发现生成的抗体能够选择性检测Sf21细胞中表达的hGDH2。相反，即使每个泳道负载多达400ng，抗体也不能识别在这些细胞中表达的hGDH1(图1和​和22和补充图1). 这在使用高纯度hGDH2或hGDH1制剂时是正确的(图1和​和2，2,A类和B类)，表达hGDH1或hGDH2的培养Sf21细胞的全匀浆(图2,C类和D类)或粗肝提取物(补充图1). 已知人类肝脏仅表达家政GDH（hGDH1）(5). 我们对表达两种人类同工酶的Sf21细胞匀浆进行的Western blot分析表明，hGDH2在SDS-PAGE上的迁移略高于hGDH1(图2C类)，如前所示纯化重组hGDH1和hGDH2(9). 此外，表达突变hGDH2蛋白的Sf21细胞的Western blot分析表明，我们的抗体不能识别通过Arg替代Ser获得的hGDH2-突变443(图2)或通过用Leu取代Ser445(补充图2). 此外，抗体对Q441R和S445A hGDH2突变体的亲和力降低(补充图2). 所有这些单一氨基酸替换都位于用于提高抗体的12-氨基酸长肽内(补充图3). 另一方面，用谷氨酸替代赖氨酸450还是Tyr代表他的454，该表位外的残基(补充图3)，不影响我们的抗体对hGDH2突变体的识别(补充图2). 相反，Ser替代Arg443hGDH1中的抗体能够识别重组hGDH1-突变体(图2A类). 由于用于产生抗体的12-残基肽在残基443处有Ser而不是Arg（就像野生型hGDH2一样），这些结果证实了抗体对hGDH2-表位的特异性(图2). 与我们的抗hGDH2抗体获得的数据相反，一种针对全长牛肝GDH的市售抗体检测到具有可比亲和力的所有野生型和突变型人类GDH（非歧视性抗GDH抗体）(图1和​和22(B类和D类)和补充图1和2).

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纯化hGDH1和hGDH2蛋白的Western blot分析。重组总账1和GLUD2公司cDNA在Sf21细胞中表达，分别产生hGDH1和hGDH2蛋白。按照“实验程序”所述，将这些蛋白纯化至同质性。在8.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用我们的抗hGDH2抗体进行印迹(左侧面板)或抗牛肝GDH的市售抗体(右侧面板). 纯化hGDH1和hGDH2的装载量显示在相应车道上方（以毫微克为单位）。在这些条件下，抗hGDH2抗体只识别纯化的hGDH2，而市售抗GDH抗体识别两种人类异蛋白（非歧视性）。hGDH2的迁移率略高于hGDH1（估计分子量分别为58和56 kDa），如前所示，纯化hGDH1和hGDH2-用SDS-PAGE分离并用考马斯蓝显示(9).

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443残基突变对抗hGDH2抗体特异性的影响。突变型和野生型(重量)使用杆状病毒表达系统在Sf21细胞中产生hGDH1和hGDH2。纯化至同质性的重组人表达蛋白(A类和B类)或粗Sf21细胞提取物(C类和D类)在8.5%凝胶上电泳，并用我们的抗hGDH2抗体进行印迹(A类和C类)或商用非歧视性(非光盘。)抗GDH抗体(B类和D类). 抗hGDH2抗体是针对一种12个氨基酸的长肽产生的，该肽对应于成熟hGDH2蛋白的436–447残基，鉴定了R443S hGDH1突变体和野生型hGDH2，两者都携带Ser443而不是Arg443发生在野生型hGDH1中。相反，当443hGDH2被Arg取代，抗体不再识别突变的hGDH2-酶。

人睾丸和脑中hGDH2的检测

使用我们的hGDH2特异性抗体，我们对人脑和睾丸进行了Western blot分析，发现这两个器官都表达hGDH2蛋白(图3和​和4）。4). 相反，在相同条件下通过蛋白质印迹分析的人类肝脏提取物对hGDH2的存在呈阴性(图4和补充图1). 这些结果与先前报道的数据一致，这些数据表明人类肝脏表达总账1仅mRNA(5). 在人类睾丸提取物中，我们的抗hGDH2抗体检测到一条免疫反应带(图3)而在人类大脑皮层（顶叶、颞叶和额叶）提取物中，它显示了两条免疫反应带，它们的迁移模式略有不同(图4). 抗hGDH2抗体与hGDH2-肽（用于培养该抗体）的预培养几乎完全阻断了抗体与人脑提取物的两条带的结合(补充图4). 此外，使用我们的抗hGDH2抗体，我们通过分析人类睾丸中部分纯化的GDH制剂获得了类似的结果(图3)和人脑(补充图4和5). 对两种人体器官的比较表明，粗制睾丸提取物中hGDH2蛋白的含量远远高于人脑提取物(图4). 基于密度测定，我们估计大脑皮层中hGDH2的相对表达量（加载到Western blots上的hGDH2-蛋白量/mg总蛋白）是睾丸中的10-20%。当我们使用识别hGDH1和hGDH2（见上文）的商业非歧视性抗体时，我们获得了与抗hGDH2-抗体不同的蛋白质印迹模式。因此，除了抗hGDH2抗体显示的条带外，在人类睾丸中检测到的非歧视性抗体还提取了代表hGDH1的第二条条带，该条带稍稍向下迁移。此外，这些分析表明，人类睾丸的粗提物或部分纯化的GDH制剂含有类似数量的hGDH1和hGDH2条带(图3B类). 另一方面，从人脑中提取的粗提物或部分纯化的GDH制剂含有大量hGDH1(图4). 在这些条件下，非歧视性抗体识别出一条与hGDH2特异性抗体显示的紧密条带重叠(图4). 对不同受试者的人体组织（大脑、睾丸和肝脏）进行的蛋白质印迹分析得出了相似的结果。

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使用抗hGDH2和非歧视性抗GDH抗体的人类睾丸免疫印迹。人类睾丸的粗提物和部分纯化GDH制剂在8.5%凝胶上运行。以表达的重组hGDH1和hGDH2作为对照。抗hGDH2抗体在纯化的两种蛋白中均显示出一条hGDH2-特异性条带(采购。)和粗制睾丸提取物(A类). 相反，非歧视性(非直径。)抗体显示了两条数量几乎相等的条带，分别代表hGDH1和hGDH2(B类).

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人脑、睾丸和肝脏的蛋白质印迹分析。 A类人顶叶、颞叶和额叶（各60μg）以及人睾丸和肝脏（各20μg）的粗提取物在8.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到硝化纤维膜上。使用抗hGDH2抗体进行印迹(上部面板)或反GDH非歧视(非光盘。)抗体(下部面板).B类显示了使用不同数量的粗组织提取物对人类额叶、睾丸和肝脏进行的Western blot分析的结果。每条车道上方显示了总蛋白质含量（微克）。使用抗hGDH2抗体进行印迹。这些印迹显示，人类睾丸中hGDH2的含量远远高于人类大脑，而人类肝脏中则没有。hGDH2的这种差异表达与以下事实形成对比：人类肝脏提取物中GDH活性水平（每分钟每毫克蛋白质氧化的NADPH含量为1.301±0.41μmol）高于人类大脑提取物（顶叶、颞叶和额叶的蛋白质含量分别为0.356±0.021、0.501±0.027和0.467±0.014μmol/min/mg），而人类睾丸粗提物的GDH活性更低（每分钟每毫克蛋白质氧化的NADPH为0.078±0.003μmol，平均值±S.D.）。这些酶测定测定了hGDH1和hGDH2活性的总和。

hGDH2主要定位于线粒体部分

人类睾丸提取物的亚细胞分馏显示hGDH2和hGDH1都定位于线粒体部分，而细胞溶质部分没有检测到这些亚型的数量(图5). 此外，线粒体部分（1:1）中的hGDH1/hGDH2比率与整个组织裂解液和含有最高GDH活性的苯-脑葡萄糖柱部分相似。同样，hGDH1和hGDH2均位于人类额叶和颞叶的线粒体部分（数据未显示）。

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hGDH2和hGDH1在人睾丸线粒体和细胞溶质部分的分布。使用Ficoll方法分离线粒体部分（见“实验程序”）。在8.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳等量的全裂解物、线粒体和细胞溶质部分的蛋白质，并使用抗hGDH2抗体进行免疫印迹(A类)和非歧视(非直径。)抗GDH抗体(B类). 肌动蛋白(C类)和锰超氧化物歧化酶(锰超氧化物歧化酶;D类)分别作为细胞溶质和线粒体标记物。hGDH1和hGDH2均富集于线粒体部分，而胞质部分基本上无GDH免疫反应。这些免疫印迹数据与使用这些组分的GDH活性分析结果一致（数据未显示）。

人睾丸支持细胞中hGDH2免疫活性增强

将兔抗hGDH2多克隆抗体的稀释度从1:500增加到1:10000。免疫组织化学研究的最终工作稀释度为1:5000，人类睾丸免疫荧光研究的最终稀释度为1:10000。在生精小管中，支持细胞的细胞质中检测到hGDH2的强烈表达，生殖细胞中完全没有hGDH2-免疫反应。此外，在生精小管的结缔组织鞘中未检测到hGDH2表达。在间质中，hGDH2定位于Leydig细胞的细胞质中。在间质的其他细胞如肌成纤维细胞、巨噬细胞等中未发现hGDH2表达(图6A类). 与3,3′-二氨基联苯胺孵育1分钟（数据未显示）或与AEC+孵育15分钟后，可观察到染色(图6A类)，并且通过将初级抗体与免疫原性肽孵育而显著减弱(图6B类). 抗体与肽预孵育后，在一些Leydig细胞的细胞质中观察到轻微残留染色(图6B类)在用肽（免疫前血清）免疫之前，将组织与兔子的血清孵育后，这意味着莱迪格细胞染色的一小部分必须归因于非特异性结合(图6,B类和C类).

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人睾丸中hGDH2的定位。图中显示了用兔抗hGDH2抗血清染色的人睾丸石蜡包埋固定切片的图像，以及用AEC+色原（红色色素）可视化的图像。A类，在支持细胞的细胞质中发现hGDH2的点状免疫反应(联合国安全理事会)在生精小管内以及Leydig细胞的细胞质内(液晶显示器)在中间空间中。精子母细胞(统计过程控制)没有hGDH2免疫反应。B类与免疫原性肽预孵育后，染色明显减弱。在莱迪格细胞的细胞质中可以观察到一些残留染色。C类，用兔免疫前血清培养组织(乘客信息系统)Leydig细胞胞质轻度染色，而生精小管无hGDH2免疫反应。D类，省略了一级抗体，只显示了二级抗体的非特异性染色(秒Ab).

众所周知，波形蛋白可以染色支持细胞的细胞质（精原细胞、生殖细胞或精子细胞中没有波形蛋白）(18)我们还使用小鼠抗波形蛋白抗体对人类睾丸进行了免疫染色。结果显示，曲细精管内波形蛋白的表达与hGDH2染色后的表达相似（数据未显示）。波形蛋白和hGDH2的双重免疫荧光研究证实hGDH2-点状免疫反应位于支持细胞的细胞质内(图7,A类和C–E类). 另一方面，钙视素是一种细胞内钙结合蛋白，已知在莱迪格细胞的细胞质和细胞核中表达，但在生殖细胞或分化良好的支持细胞中不表达。因此，我们对hGDH2和钙调素进行了双重免疫荧光，发现与钙调素免疫反应一样，hGDH2-点状免疫反应位于Leydig细胞的细胞质内；然而，Leydig细胞的细胞核缺乏hGDH2免疫反应性(图7(F–H（飞行高度）)和补充图6). 对四种不同人类睾丸的研究得出了类似的结果。

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用双重免疫荧光研究人睾丸中Sertoli和Leydig细胞细胞质中hGDH2的定位。所示为用1）兔抗hGDH2抗血清（红色染色）、2）鼠抗波形蛋白单克隆抗体（绿色染色）和3）鼠抗钙调素单克隆抗体染色的人睾丸石蜡包埋福尔马林固定切片的图像。在A类，兔抗血清未预先孵育，而B类，在染色前与免疫原性肽预先孵育。支持细胞胞浆中存在hGDH2的特异性点状免疫反应(联合国安全理事会;A类和C类)也标有波形蛋白(D类和E类). 兔抗血清与免疫原性肽预孵育后，这种反应性几乎完全消失(B类). Leydig细胞的细胞质中也有hGDH2特异性染色(液晶显示器) (F类和H（H）)也用钙调素标记(G公司和H（H）).

hGDH2在人脑星形胶质细胞中富集

为了确定hGDH2在正常人脑中的细胞分布，我们用抗hGDH2-的兔抗血清与抗GFAP（星形胶质细胞标记物）、NeuN（神经元标记物）和，和MOG（一种少突胶质细胞和髓鞘标记物）(图8). 抗hGDH2多克隆抗体仅与未固定脑组织中的抗原（1:2000）发生特异性反应，而固定脑组织显示非特异性免疫反应。在未固定的人脑中，hGDH2免疫染色主要存在于星形胶质细胞的核周细胞质及其近端突起的灰质和白质中(图8(A–C)和​和99A类). 染色与睾丸中观察到的点状外观相同(图9A类). 这些结果与蛋白质的线粒体定位一致。抗体与免疫原性肽的预孵育导致星形胶质细胞在整个白质和灰质的点状细胞质染色明显减弱，证实了其特异性(图9B类). 抗hGDH2和抗NeuN抗体的双重免疫染色显示，抗hGDH2抗体对神经元的染色较弱(图8,D–F). 这种染色广泛地局限于神经元的细胞质中，但比在星形胶质细胞中观察到的染色弱得多，并且缺乏典型的点状图案。抗hGDH2和抗MOG双重免疫染色显示少突胶质细胞或有髓纤维中未表达hGDH2(图8,G–I). 对三种不同人脑大脑皮层组织的研究得出了类似的结果。

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hGDH2主要定位于人脑星形胶质细胞。显示的是未固定人脑灰度的图像(A–F)和白色(G–I)物质，用GFAP（星形胶质细胞标记物）、NeuN（神经元标记物）单克隆抗体（红色染色）双重染色(n个))和MOG（少突胶质细胞标记物(o（o）)和髓磷脂(米))结合兔抗hGDH2抗血清（绿色染色）。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（蓝色染色）观察细胞核。合并的图像显示在右侧面板细胞质中发现hGDH2的强斑点免疫反应(闭合箭头在里面A类,D类、和G公司)和近端过程(开放箭头)鉴定为星形胶质细胞的细胞(一)由于其强烈的GFAP反应性(B类). NeuN阳性神经元的细胞质中存在较弱且相当弥漫的hGDH2反应性(D–F型). MOG和hGDH2定位之间没有重叠(G–I)表明少突胶质细胞中缺乏hGDH2表达。

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人脑中hGDH2的特异性标记。所示为未固定的人脑皮层图像，在没有固定的情况下，用鼠抗GFAP单克隆抗体（红色染色）和兔抗hGDH2抗血清（绿色染色）进行免疫染色(A类)和存在(B类)抗原（免疫原性肽）。用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚观察细胞核(DAPI公司; 蓝色染色）。细胞质中有hGDH2的特异性点状免疫反应(箭头)星形胶质细胞(一)，标有GFAP(箭头). 兔抗血清与免疫原肽预孵育后，hGDH2免疫反应几乎完全消失(B类).

讨论

在这里，我们开发了一种特异性识别hGDH2的抗体，并将其用于研究人体组织。结果表明，人的大脑和睾丸内源性表达hGDH2，而不是肝脏；然而，令我们惊讶的是，这种表达在睾丸中的比例高于在大脑中的比例。我们的抗hGDH2抗体在人类睾丸提取物中识别出一条hGDH2-带，而在人类大脑提取物中，抗体识别出两条这样的带，在SDS-PAGE上它们的迁移模式略有不同。鉴于之前的研究表明GDH在人体组织中经历翻译后修饰(19,20)，我们的观察可能反映了人类大脑和睾丸中hGDH2的不同处理。在这方面，从人类肝脏纯化的GDH的测序表明，一部分酶在不同的N末端位点被裂解(19). 还有，侯赛因等。(20)他使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了从人脑中纯化的GDH，报告了四种电泳上不同的等蛋白，它们的分子量和电荷略有不同。

在人类睾丸中，支持细胞对hGDH2具有强烈的免疫反应性，而在人脑中，皮质星形胶质细胞对hGDH2具有较强的免疫反应。在这些细胞的细胞质中，抗hGDH2抗体标记出类似线粒体的粗糙结构。我们在表达hGDH1/EGFP和hGDH2/EGFP的培养细胞中观察到类似的模式(21,22). 这些数据与我们使用亚细胞组分的Western blot结果一致，表明hGDH2定位于线粒体(21,–23)在表达hGDH1/EGFP或hGDH2/EGFP的培养细胞上发现，该酶定位于线粒体，并且缺失53氨基酸长的N末端线粒体靶向序列阻止GDH进入线粒体(22). 然而，根据目前的数据，我们不能排除hGDH1或hGDH2在较小程度上定位于其他细胞隔室，如内质网(22,24,25).

如上所述，我们的数据表明，在人类睾丸中，Sertoli细胞强烈表达hGDH2，Leydig细胞也呈hGDH2-阳性。相反，精原细胞和分化的生殖细胞对该蛋白呈阴性。众所周知，精子发生是精原细胞（干细胞）发育成高度专业化细胞——精子的过程。这在很大程度上取决于支持细胞，众所周知，支持细胞能够滋养和支持分化的生殖细胞(26,–28). 具体而言，内分泌调节允许支持细胞发育和重组，通过其紧密连接的复合体产生血睾丸屏障，并为生殖细胞提供营养、生存和调节因子(26,27,29). 这种时间建模过程导致在管腔室中形成特定的生化和细胞构筑微环境，生殖细胞在这里生存、增殖和分化。在确定的支持细胞产物中，包括能量底物，如乳酸，如下文对星形胶质细胞所述，其主要来源于通过谷氨酸转化为α-酮戊二酸的三羧酸循环。此外，我们最近发现雌激素选择性地抑制hGDH2（其亲和力与GTP对hGDH1的亲和力相似）。4因此，这些观察结果加在一起，增加了女性激素调节hGDH2活性可能构成这些激素影响睾丸功能的机制之一的可能性。

与睾丸中支持细胞的支持作用类似，星形胶质细胞也被认为支持、滋养和隔离神经系统中的神经元细胞。尽管需要更好地理解GDH在这些过程中的作用，Sonnewald等。(30)研究表明，添加到大脑皮层星形胶质细胞原代培养物中的谷氨酸在三羧酸循环中被广泛代谢，形成主要是乳酸，并输出到神经元。这需要GDH部分催化谷氨酸转化为α-酮戊二酸。这些观察结果与现有证据一致，即大脑中的GDH主要向谷氨酸的氧化脱氨作用发挥作用(31). 另一方面，几乎没有证据表明GDH参与大脑中谷氨酸的合成，因为这种酶具有较高的K（K）米对于氨（10–20 m米)和全国广告部+/NADH在这个器官中的比例很高(31). 然而，氨浓度的局部增加可能促进α-酮戊二酸的还原胺化，正如“谷氨酸/谷氨酰胺支链氨基酸穿梭”被认为参与神经元和星形胶质细胞之间氨的循环一样(32). 此外，GDH可能参与“丙氨酸穿梭”，即丙氨酸从神经元向星形胶质细胞移位，同时乳酸从星形胶质细胞向神经元移位(33).

有证据表明hGDH2获得的特性允许酶适应神经组织中普遍存在的独特条件(9,10). 这些包括对GTP抑制的耐受性，对ADP催化功能的依赖性，以及在相对较低的细胞内pH下有效发挥功能的能力。对GTP的抵抗被认为是促进hGDH2在富含GTP的神经组织环境中的功能，使酶能够代谢兴奋性传递期间突触末端释放的谷氨酸，即使增强的三羧酸循环产生足以完全灭活hGDH1的GTP量。此外，hGDH2对细胞ADP水平的依赖性可能对通过GDH途径调节神经递质谷氨酸的流量很重要，因为已知在兴奋性传递期间突触中发生ATP对ADP的水解增强(34). 同样，hGDH2的最佳pH值略低于hGDH1的pH值，这一事实可能对该酶在谷氨酸摄取后突触星形胶质细胞中普遍存在的相对酸化条件下的功能很重要(9,10).

尽管睾丸中GDH的功能尚未像神经组织中那样得到广泛研究，但支持细胞密集表达hGDH2的发现表明，这种蛋白质的特殊功能特性可能使这些支持细胞能够有效地回收代谢产物，这些代谢产物对向生殖细胞提供营养至关重要。因此，睾丸支持细胞和大脑星形胶质细胞表达hGDH2可能具有重要的生物学优势。

补充材料

补充数据：

致谢

我们感谢捐献生物材料的患者。我们感谢Giovanna Arianoglou、Konstantinos Kanavouras、Nikolas Borombokas、George Z.Rassidakis博士、Kiki Thermos博士和Martina Samiotaki博士的帮助，感谢Iris Plaitakis的编辑协助。我们感谢英国多发性硬化组织库提供的尸检人脑样本。

*这项工作得到了克里特岛神经疾病研究与治疗协会（EY ZHN）和塞浦路斯研究促进基金会（K.A.K.）的资助。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含补充图1-6和其他参考.

4N.Borompokas、M.Papachatzaki、K.Kanavouras、V.Mastorodemos和A.Plaitakis，未发表数据。

三使用的缩写为：

GDH公司
谷氨酸脱氢酶
hGDH公司
人类GDH
GFAP公司
胶质纤维酸性蛋白
MOG公司
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白
TRITC公司
四甲基罗丹明异硫氰酸酯
EGFP公司
增强的绿色荧光蛋白。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会