CXCL10抑制小鼠肺纤维化需要糖胺聚糖结合和syndecan-4

Sdc4公司^–/–非感染性急性肺损伤后，小鼠出现过度纤维化表型。

为了研究syndecan-4诱导表达的生物学意义，我们检测了肺损伤后的炎症和纤维化反应Sdc4公司^–/–老鼠。最近的研究Sdc4公司^–/–小鼠认为syndecan-4在组织损伤中起着非冗余作用(18)和维修(20). 我们观察到Sdc4公司^–/–与同窝对照组相比，小鼠的羟脯氨酸含量增加，三色胶原染色增强，I型胶原特异性免疫荧光染色增强（图​（图2，2，A–C）。在以进行性肺纤维化为特征的纤维化病灶中，描述了具有活化肌成纤维细胞表型的成纤维细胞(4). 成纤维细胞，尤其是肌成纤维细胞是主要的效应细胞类型，在纤维形成过程中产生细胞外基质并提供收缩力(25). 当我们用抗α-SMA抗体（新出现的肌成纤维细胞的标记物）对肺切片进行染色时，Sdc4公司^–/–小鼠α-SMA阳性细胞明显增多（图​（图2B）。2B） ●●●●。这些数据表明，syndecan-4可能通过抑制成纤维细胞/肌成纤维细胞向组织损伤区域的迁移，在限制非感染性肺损伤后的纤维生成中发挥作用。

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图2

肺纤维化增加Sdc4公司^–/–老鼠。

(A类)Sdc4公司^–/–和窝友WT对照组受博莱霉素诱导的肺损伤影响。伤后14天和21天测定肺中羟脯氨酸含量(n个= 5–10). 数据是3个类似实验的代表。(B类)肺切片Sdc4公司^–/–伤后21天，WT小鼠用三色和抗α-SMA染色，胶原染色增强，α-SMA表达增加Sdc4公司^–/–老鼠(n个= 7). 原始放大倍数，×100。(C类)肺切片Sdc4公司^–/–伤前、伤后14天和21天，对WT小鼠进行I型胶原染色，结果显示肺组织中I型胶原的染色增加Sdc4公司^–/–老鼠(n个= 7). 原始放大倍数，×100。

标准偏差4^–/–小鼠肺损伤后出现炎症反应失调。

然后我们研究了syndecan-4在非感染性急性肺损伤炎症反应中的作用。我们观察到Sdc4公司^–/–小鼠与其WT窝友进行比较（图​（图3A）。三A） ●●●●。这可能是syndecan-4缺乏症的普遍表现，因为我们观察到巯基乙酸刺激后腹膜细胞炎性细胞浸润增加（补充图1；本文在线提供的补充材料；doi:10.1172/JCI38644DS1). BAL细胞的差异细胞计数显示，炎症细胞的总增加主要是由于巨噬细胞和淋巴细胞（图​（图3，三、B和E）。此外，我们还发现了中性粒细胞向肺部募集的相对不足Sdc4公司^–/–博莱霉素治疗后的小鼠（图​（图3，三、C和D）。为了确定中性粒细胞缺乏是否有助于syndecan-4缺乏症的纤维生成，我们使用中性粒细胞化学引诱剂N个-甲酰-新亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸（FNLP）强行将中性粒细胞募集到肺泡腔(26). 气管内滴注FNLP和博莱霉素后Sdc4公司^–/–小鼠中性粒细胞数量恢复到与WT小鼠相当的水平（补充图2A）。有趣的是，肺泡腔中中性粒细胞的恢复并没有改变在Sdc4公司^–/–非感染性肺损伤后的小鼠（补充图2B）。这些数据表明，尽管syndecan-4有助于中性粒细胞跨上皮迁移Sdc4公司^–/–小鼠不是由中性粒细胞募集受损引起的；其他机制必须解释纤维化表型。

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图3

炎症调节异常Sdc4公司^–/–博莱霉素致小鼠肺损伤。

(A类)Sdc4公司^–/–博莱霉素诱导的肺损伤后21天内，小鼠BAL中的总炎症细胞增加。(B类——E类)细胞总数的增加是巨噬细胞增加的结果(B类)和淋巴细胞(E类). (C类和D类)中性粒细胞也减少。(A类——E类)n个= 5–7. *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. 在3个单独的实验中获得了类似的结果。

CXCL10对纤维化的抑制需要辛迪加-4的存在。

一项旨在确定促纤维化介质（如TGF-β或IL-13）增加或抗纤维化细胞因子（如IFN-γ和HGF）减少的详尽研究未能确定解释成纤维细胞积聚显著增加的候选者Sdc4公司^–/–小鼠（补充图3）。未能发现肝纤维化前或抗纤维化介质的改变Sdc4公司^–/–小鼠引导我们探索syndecan-4可能在限制肺成纤维细胞迁移中发挥作用的可能性。已知趋化因子和趋化因子受体可调节成纤维细胞迁移。CXCR3和CXCL10以前被证明可以限制博莱霉素模型中的肺纤维化(9——11). 因为CXCL10已被证明与硫酸乙酰肝素相互作用(27)，我们试图确定在缺乏syndecan-4的情况下，外源性CXCL10是否影响体内纤维化。外源性给予CXCL10抑制了博莱霉素诱导的WT小鼠肺纤维化（图​（图4），4)，如前所述(9). 然而，CXCL10的抗纤维化作用在Sdc4公司^–/–鼠标（图​（图4），4)，证明这种效果需要syndecan-4的存在。

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图4

外源性CXCL10不能抑制Sdc4公司^–/–老鼠。

Sdc4公司^–/–和窝友WT对照组受博莱霉素诱导的肺损伤影响。从受伤当天起，每天肌肉注射重组小鼠CXCL10或BSA缓冲液。伤后13天测定肺中羟脯氨酸含量(n个= 8–9).

Sdc4中成纤维细胞积聚增加^–/–小鼠肺博莱霉素损伤后。

成纤维细胞是纤维形成过程中的主要效应细胞。它们在损伤后积聚在肺间质中，并在关键介质（如TGF-β）的作用下产生基质。肝纤维化增加Sdc4公司^–/–博莱霉素损伤模型中的小鼠可能是由于成纤维细胞增殖、胶原合成或迁移失衡所致。我们证实CXCL10不影响成纤维细胞增殖（数据未显示），如之前报道的那样(10). 然后我们确定CXCL10是否在调节胶原蛋白合成中发挥作用。用重组小鼠CXCL10蛋白处理小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞。CXCL10不影响3T3成纤维细胞的胶原蛋白生成（补充图4）。重要的是，我们证实TGF-β刺激成纤维细胞产生胶原蛋白，并发现CXCL10无法抑制这种作用。因此，CXCL10的抗纤维化作用不是由胶原合成抑制引起的。然而，用成纤维细胞标记物ER-TR7染色的肺切片(10)确实显示成纤维细胞染色在标准偏差4^–/–博来霉素损伤后的小鼠肺部（图​（图5）。5). 这些数据表明纤维化表型的关键成分Sdc4公司^–/–小鼠组织损伤部位成纤维细胞积聚增多。

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图5

更多成纤维细胞染色Sdc4公司^–/–与WT小鼠肺部的对比。

肺切片标准偏差4^–/–用成纤维细胞标记物ER-TR7对博莱霉素损伤前、损伤后14天和21天的同窝WT小鼠进行染色，发现肺组织中成纤维细胞染色增加Sdc4公司^–/–老鼠(n个= 7). 原始放大倍数，×100。

CXCL10在肺成纤维细胞上直接与syndecan-4相互作用。

此前发现CXCL10抑制成纤维细胞对受损肺组织BAL液的趋化性(10). 这种抑制的机制尚不清楚，因为肺成纤维细胞不表达CXCL10受体CXCR3（补充图5和参考文献。10). 因为CXCL10以前被证明能结合糖胺聚糖（GAG；参考。27)，我们假设CXCL10可能与成纤维细胞上的syndecan-4结合，以调节成纤维细胞的迁移。我们使用几种方法研究了CXCL10直接与syndecan-4结合的可能性。首先，我们发现碘标记的CXCL10与肺单细胞匀浆或培养的原代成纤维细胞的结合Sdc4公司^–/–与WT小鼠肺组织匀浆相比，小鼠数量减少（图​（图6，6、A和B）。从中分离出的肺细胞总数Cxcr3号机组^–/–与来自WT小鼠肺组织的匀浆相比，小鼠还表现出CXCL10结合减少（图​（图6A）。6A） ●●●●。CXCL10绑定到Cxcr3号机组^–/–成纤维细胞与WT成纤维细胞相当（图​（图6B）。6B） ●●●●。此绑定是特定的，因为添加了未标记的CXCL10阻止了绑定活动（图​（图6C）。6C） ●●●●。从小鼠分离的总肺细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。其次，生物素化的CXCL10交联到syndecan-4承载细胞，并且通过添加未标记的CXCL1蛋白而消除了这种结合（图​（图6D）。6D） ●●●●。作为对照，CXCL10被证明与携带CXCR3的细胞交联，并且通过添加未标记的CXCL10取代了交联（数据未显示）。这些数据表明CXCL10直接与syndecan-4结合。

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图6

CXCL10与syndecan-4结合。

(A类)从WT肺组织中分离出的细胞数量相等，Sdc4公司^–/–、和Cxcr3号机组^–/–小鼠与¹²⁵I标记的CXCL10。清洗后，测量总放射性标记活性。减少的绑定¹²⁵I标记的CXCL10到Sdc4公司^–/–和Cxcr3号机组^–/–观察到细胞(n个= 3). 从3个实验中获得了类似的结果。(B类)从WT肺组织中分离出等量的成纤维细胞，Sdc4公司^–/–、和Cxcr3号机组^–/–小鼠与¹²⁵标有I的CXCL10。减少的绑定¹²⁵I标记的CXCL10到Sdc4公司^–/–观察到成纤维细胞(n个= 4). 从3个实验中获得了类似的结果。(C类)CXCL10与成纤维细胞的结合。将WT肺组织中含Syndecan-4的成纤维细胞在24孔板中汇合，并用¹²⁵I标记的CXCL10和在4°C下增加未标记CXCL10的浓度。金额¹²⁵与细胞结合的I-CXCL10显示为在没有未标记CXLC10的情况下的百分比。(D类)将CXCL10交联到syndecan-4。生物素标记的CXCL10（0.5μg）与肺组织匀浆在存在或不存在过量未标记CXCL10的情况下孵育，并与DSS交联，然后是IP与syndecan-4特异性抗体。用链霉亲和素HRP观察到与生物素化CXCL10交联的新癸烷-4，然后增强化学发光。箭头表示CXCL10–syndecan-4复合物。

CXCL10–syndecan-4相互作用调节成纤维细胞迁移。

然后，我们通过研究CXCL10–syndecan-4相互作用对成纤维细胞迁移的影响来确定其在肺纤维化发病机制中的生物学意义。肺纤维化患者的BAL(28,29)或博莱霉素治疗小鼠(10,29)诱导成纤维细胞的趋化活性。CXCL10能够抑制BAL诱导的成纤维细胞迁移(10). 为了确定CXCL10抑制成纤维细胞趋化性是否需要syndecan-4，我们检测了WT和Sdc4公司^–/–成纤维细胞对来自纤维化肺组织的BAL液作出反应，并在两组中观察到迁移（图​（图7，7、A和B）。与我们之前的观察一致，重组CXCL10抑制了WT小鼠原代肺成纤维细胞对博莱霉素治疗小鼠肺部分离的BAL液的趋化性（图​（图7，7、A和B）。然而，CXCL10没有减弱标准偏差4^–/–成纤维细胞对BAL的迁移反应。因此，CXCL10对成纤维细胞趋化性的抑制取决于成纤维细胞上辛迪加-4的存在。此外，CXCR3对CXCL10抑制成纤维细胞趋化性是不可或缺的，因为CXCL10可以抑制BAL诱导的成纤维细胞从Cxcr3号机组^–/–成纤维细胞（图​（图7C）。7C） ●●●●。

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图7

CXCL10抑制BAL诱导的成纤维细胞趋化性需要syndecan-4。

(A类)肺成纤维细胞分离自Sdc4公司^–/–和室友对照小鼠，并将其置于纤维连接蛋白涂层的Boyden小室中，小室孔径为8μm。将博莱霉素损伤后5天来自WT小鼠的BAL加入到底部腔室中。对于某些组，还将重组CXCL10（500 pg/ml）添加到顶部和底部室中(n个= 12–14). 原始放大倍数，×100。从5个实验中获得了类似的结果。(B类)成纤维细胞迁移的定量。用40倍物镜在光学显微镜下对每片5个视野的成纤维细胞进行计数。5个区域的成纤维细胞总数表示为迁移指数(n个= 3–5). (C类)肺成纤维细胞分离自Cxcr3号机组^–/–老鼠和电镀到博伊登室。博莱霉素损伤5天后，将来自WT小鼠的BAL添加到底部腔室。对于某些组，还将重组CXCL10添加到顶部和底部腔室中。在显微镜下用一个×40物镜观察4个视野中的成纤维细胞总数作为迁移指数(n个= 4).

博莱霉素给药和BAL。

博莱霉素用于Sdc4公司^–/–和之前描述的年龄和性别匹配的WT C57BL/6J小鼠(11). 在麻醉下，通过手术暴露小鼠的肺和心脏。气管插管，用0.8-ml等分冷PBS冲洗肺部3次。回收活细胞并用血细胞仪计数。BAL细胞的细胞分裂素制剂按常规染色，并进行差异细胞计数。

外源性CXCL10治疗。

两者都有标准偏差4^–/–将小鼠和同窝对照分为CXCL10治疗组和对照组，每组10只小鼠。全部Sdc4公司^–/–小鼠和室友对照组受到博莱霉素诱导的肺损伤。从受伤当天起，每天给小鼠肌肉注射溶解于20μl 0.25%BSA/PBS中的重组小鼠CXCL10（1μg；Peprotech）。作为对照，每天给另一组小鼠肌肉注射20μl 0.25%BSA/PBS。伤后13天取小鼠肺，测定肺中羟脯氨酸含量。

mRNA分析。

使用TRI从肺组织中提取RNA佐尔试剂（Invitrogen）。对于实时RT-PCR分析，使用SuperScript II RNase H逆转录1μg总RNA^——含有0.5μg/μl寡核苷酸（dT）的逆转录酶（Invitrogen）₁₇引物。在得到的cDNA中，使用ABI Prism 7500检测系统（Applied Biosystems）对1μl进行实时PCR（SYBR Green的qPCR核心试剂盒；Eurogentec）。根据GenBank数据库中的cDNA序列设计特异性引物。底漆Sdc4公司({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_011521”，“term_id”：“118130129”，”term_text“：“NM_011521”}}NM_011521)分别为5′-ACTGGATAACACACATCCCTGAG-3′（正）和5′-GCAACTGACACACA-3′（反义），以及GAPDH公司（NM_00100130）分别为5′-ATCATCCGCCCCTTCTG-3′（正义）和5′-GGTCATGAGCCCCCACAAT-3′（反义）。引物均为cDNA特异性引物，未扩增基因组DNA。基因组DNA的污染可以忽略不计。实时PCR的条件为：95℃下1个循环10分钟，95℃下40个循环15秒，60℃下1分钟，25℃下1次循环2分钟。每个基因的相对表达水平根据GAPDH公司样品中的水平。

流式细胞术。

如前所述，对全肺单细胞匀浆或分离的原代肺成纤维细胞进行流式细胞术分析(11). syndecan-4的细胞表面表达是用藻红蛋白结合的悉尼-4特异性抗体（克隆KY/8.2；BD Biosciences）以及流式细胞仪上的白细胞表面标记CD45（FACSCanto II；Becton Dickson）检测的。syndecan-4的细胞表面表达也用悉尼-4抗体进行了分析（由美国俄克拉荷马州俄克拉何马市俄克拉荷玛医学研究基金会P.Kincade提供）。使用FACS Diva软件（Becton Dickson）分析流量数据。

组织学和免疫组织化学。

如前所述，通过肺部切片的常规三色染色检测胶原蛋白含量(11). 肺组织中的α-SMA用抗α-SMA（克隆1A4；DakoCytomation）染色，I型胶原用兔I型胶原多克隆抗体（Abcam）染色，成纤维细胞用ER-TR7（Santa Cruz Biotechnology）染色，然后用Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories）或荧光染色。

羟脯氨酸测定。

用常规羟脯氨酸法测定小鼠肺中的胶原蛋白含量(11).

放射性标记的CXCL10绑定。

肺单细胞匀浆细胞或纯化肺成纤维细胞（1×10⁵)与¹²⁵I-CXCL10（Perkin­Elmer）和各种浓度的未标记CXCL10（研发系统）在4°C下持续60分钟。通过用0.33%聚乙烯亚胺处理的玻璃微纤维过滤器（Whatman）过滤细胞，洗涤，空气干燥，并在γ计数器上计数。

交叉链接。

重组CXCL10来自R&D Systems。CXCL10使用EZ-Link磺基丁二酰亚胺-6′-（生物胺基）-6-己酰胺己酸盐（皮尔斯生物技术）进行生物素化。来自肺匀浆的蛋白质（1 mg）与0.5μg生物素化CXCL10在4°C下孵育过夜；一些样品在室温下用1μg CXCL10预培养1小时。用试剂DSS在冰上交联2小时。IP使用抗syndecan-4抗体（克隆KY103；参考。63)或CXCR3抗体（Zymed）。在4%-20%Tris-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离免疫沉淀物，转移到PVDF膜上，并用增强化学发光法（Amersham）观察。

原发性肺成纤维细胞的分离和成纤维细胞迁移实验。

原发性肺成纤维细胞被分离和培养，成纤维细胞趋化性试验如前所述进行(10). 将肺成纤维细胞镀在孔径为8μm、涂有纤维连接蛋白的Boyden腔上(10). 博莱霉素损伤3天后，将来自WT小鼠的BAL添加到底部腔室。某些组也用浓度为500–1000 ng/ml的重组CXCL10或CXCL10突变体，或与0.5–2μg/ml的肝素或硫酸肝素结合，添加到顶部和底部室中。肝素酶I来自肝素黄杆菌来自Sigma-Aldrich。成纤维细胞（1×10⁶细胞）用肝素酶在0.02U下处理2小时(64). 迁移指数表示为显微镜下放大×100或×400倍观察的5个区域的细胞总数。

人肺成纤维细胞。

从IPF患者的手术肺活检中分离出人肺成纤维细胞。IPF的诊断依据美国胸科学会的标准公认建议(65). 所有实验均由杜克大学机构审查委员会批准，并符合该委员会概述的指导方针。每个受试者都获得了知情同意。

我们感谢P.Kincade提供抗syndecan-4抗体，感谢C.Gerard提供Cxcr3号机组^–/–老鼠。本研究得到了NIH向P.W.Noble提供的AI052201、HL06539和HL77291赠款的支持。